基因芯片在肿瘤研究中的应用.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,肿瘤基因组学与基因芯片,第十讲,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第1页,肿瘤研究,美国1971年颁布国家癌症条例开始抗癌大战,使癌症成为“慢性病”,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第2页,Concept of Neoplasm（瘤）,“is an,abnormal mass,of tissue,the,growth,of which,exceeds and is uncoordinated,with that of the normal tissues,and persists,in the same excessive manner,after cessation of the stimuli,which evoked the change”,Willis,1952,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第3页,Basic Biologic Features of Neoplasms,Oncogenic Lesion,(e.g.RAS,MYC,E2F Activation),Differentiation,Abnormal Proliferation,Angiogenesis,Invasion,Senescence,Apoptosis,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第4页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第5页,Neoplasms Evolve in Multiple Steps,Initiation:presumably occurs through irreversible or stable damage to DNA,Promotion:an process bringing about a clonal expansion of initiated cells,Progression:results when genetic instability leads to further mutagenic and epigenetic changes,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第6页,肿瘤发生（Initiation）,Tumor initiation：Cooperative DNA lesions as common final pathway,Precancerous and incipient（初始）lesions,Molecular targets：Oncogenes,tumor suppressor genes&DNA repair genes,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第7页,肿瘤促进（promotion）,Expansion,of initiated cells,Repetitive,process,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第8页,Initiation&Promotion,致癌剂,肿瘤促进剂,低黄曲霉素B1Aflaloxin B1，高杀草强Amitrole，砷和其化合物Arsenic&compounds，高三氧化二砷Arsenic trioxide，高三硫化砷Arsenic trisulfide，高石棉Asbestos,癌基因（如myc、ras）,需要重复刺激,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第9页,Initiation&Promotion,Time,No tumor,No tumor,No tumor,No tumor,Tumor,Tumor,=Promoter,=Initiator,Gr.1,Gr.2,Gr.3,Gr.4,Gr.5,Gr.6,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第10页,Initiation&PromotionTarget Genes,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第11页,肿瘤发展（progression）,肿瘤组织,浸润,相邻组织,淋巴结转移和血道,转移,远端转移,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第12页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第13页,Apoptosis and Tumorigenesis,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第14页,小 结,肿瘤发生发展三个阶段,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第15页,基于基因表示谱分子分型,为何提倡利用分子水平进行肿瘤分型？,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第16页,肿瘤普通临床学知识,肿瘤诊疗,肿瘤临床分期（stage）,肿瘤临床分级（grade）,肿瘤治疗,放疗,化疗,辅助治疗,靶点治疗,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第17页,肿瘤临床分期(stage),TNM分期,肿瘤大小(T,tumor size),肿瘤是否发生临近淋巴结转移(N,node),肿瘤是否有远处转移(M,metastasis),基因芯片在肿瘤研究中的应用,第18页,乳腺癌 分 期,Tis Carcinoma in site,T1 Tumor 2.0 cm in greatest dimension,T2 Tumor 2.0 cm 5.0 cm in greatest dimension,T3 Tumor 5.0 cm in greatest dimension,T4 Tumor of any size with direct extension to chest wall or skin,N0 No regional lymph nodes metastasis,N1 Metastasis to,moveable,ipsilateral axillary node(s)(同侧腋下淋巴结),N2 Metastasis to ipsilateral axillary node(s)fixed to one another or other structures,N3 Metastasis to ipsilateral internal mammary node(s),M0 No distant metastasis,M1 Distant metastasis(includes metastasis to ipsilateral supraclavicular（锁骨）lymph node(s),Stage 0 Tis N0 M0,Stage I T1 N0 M0,Stage IIa T1 N1 M0,T2 N0 M0,Stage IIb T2 N1 M0,T3 N0 M0,Stage IIIa T1,2 N2 M0,T3 N1,2 M0,Stage IIIb T4 Any N M0,Any T N3 M0,Stage IV Any T Any N M1,问题：这么分期是否准确反应了病人预后情况？,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第19页,肿瘤临床分级(grade),分级指标,:细胞异常形态，细胞恶性生长速度。,肿瘤细胞生长分级,:1 到 3分别对应级别低，中，高，在临床上常称为高分化，中分化，低分化。级别越低，预后越好。级别越高，对放疗和化疗敏感度也较强。肿瘤细胞与起源器官中细胞相同程度，分化良好细胞有高度特化特点，组织结构清楚，很轻易识别。低分化细胞组织结构不清，极难识别。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第20页,肿瘤病理学诊疗方法,冰冻切片和石蜡切片染色和组织化学方法：确定肿瘤细胞分化程度；判别肿瘤类型；研究肿瘤组织发生,流式细胞术定量诊疗（肿瘤细胞核形态参数）：癌（瘤）细胞DNA含量检测；良性病变多为二倍体；恶性肿瘤多为非整倍体,问题：单基因组织化学检测是否能准确反应肿瘤类型及分化程度？,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第21页,肿瘤传统检测,传统肿瘤解剖分期(包含肿瘤大小、淋巴结转移数目，TNM)对于预测肿瘤复发转移价值不可低估，是临床上较成熟风险评定指标。,传统组织病理诊疗：以组织形态、免疫组织化学染色；通常以单一基因不一样表现对肿瘤作出诊疗。,问题：,组织病理学上看起来一样肿瘤，其自然发展史、生物学行为以及对治疗反应和预后等都会有所不一样。从活检标本上看都象是肿瘤两个病人，他们都有肿瘤灶，你能够说它们看起一是一样，但实际上，一位病人已在别部位有恶性生长了。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第22页,肿瘤化疗,化疗对分裂细胞有效，但肿瘤细胞不是体内唯一含有分裂能力细胞，所以化疗对正常分裂细胞有一定伤害。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第23页,肿瘤放疗,放疗对旺盛生长和分裂细胞有效。因为肿瘤细胞比起正常细胞在基因组上不稳定，所以对放疗敏感度高于正常细胞，同时因为正常细胞含有完善修复系统，比较耐受放疗。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第24页,肿瘤辅助治疗,依据肿瘤特殊性质而制订治疗方法，如激素治疗,也有把放疗，化疗结合激素治疗方法称为辅助治疗,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第25页,肿瘤靶点治疗,依据在肿瘤发生发展中含有主要意义靶点基因而研制成药品，如乳腺癌治疗靶点基因HER2，肺癌靶点基因EGFR,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第26页,肿瘤治疗中存在问题,放疗，化疗，激素治疗耐受,过分治疗？,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第27页,基因芯片在肿瘤研究中应用,应用DNA微阵列技术和多基因RT-PCR定量检测方法来预测乳腺癌复发转移风险及其对治疗反应，取得一定突破。还存在诸如检测方法可重复性、肿瘤标本取材标准、统计学分析以及检测结果核查标准化等问题。,Ntzani和Ioannides在总结1995年到4月MEDLINE共84篇关于这类技术论文后发觉,只有30篇包括临床结果,他们提出,DNA微阵列技术还需大规模前瞻性临床试验证实,同时应与现有一些已知预测因子联合进行比较,最终作出慎重审核与决定。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第28页,Stanford大学Patrick Brown认为：有用诊疗图谱必定会出现，“当二个生物标本差异足以引发我们重视时，那么必定在它们基因表示上也有对应差异,一旦候选基因图谱被确定，并集中到几个关键基因上，就可利用简单技术如PCR针对较大人群中对有效、重复产生改变进行检测。假如一个基因在表示上改变能重复出现，则这个基因就可用作基因诊疗标识物,基因芯片在肿瘤研究中应用,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第29页,肿瘤生物学指标(包含组织学分级、biomarker、增殖指标等)不但能够判断肿瘤预后，还能够预测肿瘤对治疗反应，并为肿瘤个体化治疗提供依据。,价值超出了解剖分期，是当前临床研究方向与重点之一。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第30页,肿瘤分子分型（分子诊疗）,肿瘤分级,肿瘤分期，预后,肿瘤放疗化疗或激素治疗耐受,肿瘤靶向转移（肿瘤形成转移能力依赖于各种基因联合作用，肿瘤转移每个器官都需要不一样组基因）。,肿瘤分类：用表示图谱区分出所检测标本是正常组织还是肿瘤；若是肿瘤，又能区分出是良性还是恶性。,利用基因芯片得到Biomarker可用于肿瘤早期诊疗,基因芯片在肿瘤研究中应用,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第31页,白血病分类,肿瘤分类学在过去30多年间进步不少，不过在判定新肿瘤类型（class discovery）和肿瘤分类（cancer classification）还缺乏通用方法,急性白血病分类方法：核形态学分析，酶学免疫组化，染色体易位分析，任何一个分析都需要非常有经验医师进行详尽检验以及分析，需要专业试验室来完成，但没有一个单独测试能够足以用于诊疗,传统分类方法联合利用，普通而言比较准确，但依旧会犯错,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第32页,利用基因芯片表示谱对急性白血病分类,寻找在基因表示水平与预测ALL和AML亲密相关分子群,利用这一分子群，看怎样能将已知分类样本进行准确分类预测，即寻找能进行分类基因群（class predictor）（training set）,用新样本群检测class predictor准确性(test set),基因芯片在肿瘤研究中的应用,第33页,Precise Classification of Cancer is the First Step in Rational Treatment,Gene Expression Profiles,Science,286:531(1999),Distinguishing between,acute lymphoblastic leukemia(ALL),and,acute myeloid leukemia(AML),is crucial because their therapies are different.,RNA from 38 bone marrow samples were hybridized to Affymetrix chips containing probes for 6,817 genes.,The expression profiles of 50 genes clearly differentiate between the two types of cancer.,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第34页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第35页,乳腺癌预后分类与治疗,同一分期乳腺癌病人在治疗反应和总体治疗结果上有很大差异,传统用淋巴结状态和组织化学检测方法无法准确判断肿瘤临床表现,化疗和激素治疗能够降低远处转移风险约三分之一,7080病人不经过化疗等伎俩预后仍很好,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第36页,Gene Expression Signatures for Breast Cancer,Application:Gene Expression,Identifying gene expression signature that reflects biological behavior of a tumor(预后好与预后差),70-gene prognostic profile tested,295 breast cancer samples,outperformed all clinical variables for predicting patient survival,Microarray classifiers to direct customized therapy,Starting point for targeted and rational drug development,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第37页,Classification on prognostic signature,Supervised classification on prognosis signatures,Predict clinical outcome,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第38页,Prognosis of additional 19 patients,Results,231 genes were significantly associated with the disease outcome,70 genes were further selected to be optimal marker gene,Prediction accuracy 80%,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第39页,开发企业：Agendia芯片名称：MammaPrint(R)Agendia Receives U.S.FDA Clearance For MammaPrint Breast Cancer Diagnostic,Test,Agendia announced that the U.S.Food and Drug Administration(FDA)has cleared the companys MammaPrint breast cancer diagnostic test.MammaPrint is agene expression profiling service to assess the risk of recurrence in breast cancer patients.MammaPrint represents a U.S.regulatory milestone as the first In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay(IVDMIA)to acquire market clearance from the FDA,and is the agencys first step toward standardizing these multi-gene expression tests.,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第40页,DNA阵列杂交结果最直接影响是诊疗；杂交结果中能够得到药品靶标基因，可为最终治疗癌症打下基础,挑战：伴随试验技术及仪器不停改进和基因组数据急剧增加，基因芯片产生各种基因表示数据，规模庞大，内容复杂；怎样分析挖掘数据成为生物信息学中挑战性课题。,利用芯片检测肿瘤组织中基因表示谱将成为研究肿瘤一个标准方法。,基因芯片在肿瘤研究中应用,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第41页,小 结,当前肿瘤诊疗和治疗中存在问题,利用基因芯片进行分子分型,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第42页,其它基因芯片类型在肿瘤研究中应用,miRNA芯片,CGH芯片,甲基化芯片等,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第43页,miRNA芯片,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第44页,microRNA,microRNA(miRNA)是20 24nt单链 RNA,在进化上含有高度保守性，它经过与靶mRNA 不完全互补配对，抑制蛋白翻译,调整内源基因表示，在基因调控中饰演了主要角色。,MicroRNA 普通经过碱基配对结合到 mRNA 3 非翻译区（3-UTR），从而抑制mRNA翻译发挥功效，在细胞分化，生物发育过程中起到主要作用，而且参加疾病发生发展,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第45页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第46页,Differences in miRNA Mode of Action,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第47页,miRNA,microRNA在动植物中,广泛并保守存在,；,microRNA参加广泛生物学过程，尤其是,发育相关过程,和,组织特异性,维持；,microRNA与target基因,交叉调控,关系；,microRNA表示基因芯片试验发觉在,癌症组织,中miRNA,广泛失调,；,microRNA表示谱能够对不一样癌症甚至同种癌症不一样亚型进行,分类,。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第48页,miRNA,在癌症中作用,1.miRNA处于基因组中脆性位点，在癌症中经常缺失或扩增,2.miRNA基因所在位点在癌症中在表观遗传层面上被修饰调控,3.miRNA发生相关基因如Drosha,Dicer在癌症中表示失调,Remains largely a mestery!,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第49页,探针,寡核苷酸探针,Sanger mirBase 7.0 中已知 Human,Mouse,Rat,Drosophila,C.elegans 和zebrafish 探针,www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml,前体和成熟miRNA都能够设计探针点于芯片上,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第50页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第51页,Case 1433,was initially diagnosed as,ERMS,based on its histology and reactivity for desmin,smooth muscle actin and CD99，this case clustered tightly with the other ARMS included in the study.Subsequent demonstration of the fusion transcript PAX3-FKHR by reverse transcription(RT)PCR and sequencing in this sample confirms that this case is indeed an ARMS,case 5918,was initially diagnosed as a,GIST,based on its origin in the wall of the colon and reactivity for CD34.However this case clustered away from the eight other GISTs and instead clustered loosely with PRMS.Both KIT and DOG1 are highly expressed in the vast majority of GIST.Case 5918 did not have immunoreactivity for KIT or DOG1 and no mutations were found in KIT exon 11,the most common mutation in GIST.Histologic review of the tumor suggested a new diagnosis of dedifferentiated liposarcoma.,27 sarcomas,5normal smooth muscle and 2 normal skeletal muscle tissues,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第52页,microRNA expression profiles classify human cancers,Leukemia,Solid Tumor,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第53页,microRNA,表示谱不一致性很高,不一样试验室得出,microRNA,表示谱结果很不一致：,microRNA,芯片技术难度和不成熟性。,RNA类型：,总,RNA,进行试验可能同时检测了成熟,miRNA,与前体,miRNA,。假如,miRNA,成熟受阻，则能够解释此矛盾。这暗示，前体,miRNA,可能含有独立，还未知功效。,使用纯化小,RNA,进行试验可能会引入错误：当前无法测量小,RNA,在总,RNA,中百分比情况，假如癌症与良性组织含有不一样百分比小,RNA,，那么纯化小,RNA,试验前提（一样量,miRNA,被纯化得出）则会受到根本影响。,样本量对结果影响,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第54页,PC3 cells were transduced with adenovirus either encoding p53 or containing an empty vector.After 48 h,small RNA was characterized with PCR Arrays containing 376 human miRNA-specific assays.The heat map visualizes the fold-differences in miRNA expression upon p53 over-expression(red,up-regulated miRNA;green,down-regulated miRNA;black,no difference).,PCR Arrays are the most reliable tools for analyzing the expression of a focused panel of genes.Each 96-well or 384-well plate includes SYBR Green-optimized primer assays for a thoroughly researched panel of relevant,pathway-or disease-focused genes,.PCR Arrays can also be customized to contain a panel of genes tailored to your specific research interests.,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第55页,比较基因组杂交芯片CGH array,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第56页,杂合性缺失（loss of heterozygosity）,杂合性指同源染色体中不一样等位基因存在于一个或多个基因位点中现象；野生型拷贝或等位基因发生缺失就称为杂合性缺失（LOH），LOH通常是由染色体缺失或重组引发。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性染色体片段丢失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一个非经常见DNA变异。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第57页,肿瘤中存在基因扩增,经过比较肿瘤组织与体细胞组织中野生型和突变DNA比值能够检测LOH以及基因扩增；,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第58页,比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）,一个分子细胞遗传学技术，能够经过一个简单杂交反应检测出整个基因组,DNA,拷贝数改变。主要原理是,采取经过荧光标识肿瘤基因组,DNA,和正常基因组,DNA,为探针，与正常人中期染色体标本进行原位杂交，依据两种探针荧光信号强度差异找出基因组中,DNA,增加或缺失区域。,DNA Extraction&Label,Hyb,Metaphase Chromosome,Scan,Image,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第59页,aCGH,(Array Comparative Genomic Hybridization),比较基因组杂交（简称CGH）方法被用来监测染色体基因组改变。CGH最突出优点在于：经过一次试验就能完成对整个基因组中全部遗传物质增加或丢失分析，试验所使用DNA能够是从新鲜冻存组织中提取，也能够提取自福尔马林固定石蜡包埋保留材料。,CGH主要用于肿瘤细胞染色体DNA片段缺失和增加检测,同时对其它与染色体拷贝数改变相关疾病也能进行分析和检测，如小儿自闭症，先天性发育迟缓等一系列遗传病症。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第60页,Array CGH就是一个新用于检测肿瘤细胞染色体拷贝数改变技术，该项技术能够经过一个简单杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采取经过不一样颜色荧光标识肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA与芯片上结合覆盖全部人类基因组寡核苷酸探针杂交，依据杂交后两种探针荧光信号强度差异找出基因组中DNA增加或缺失区域。,aCGH特点:高通量（覆盖人类全基因组探针设计，包含针对基因外显子、内含子和基因间序列探针，一张芯片上探针数量靠近24万个探针），高分辨率（24万个探针平均分辩率在6.4KB,对当前较为了解基因来说，能够检测到这些详细基因单个拷贝数改变Agilent，Nimblegen分辨率为6KB）。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第61页,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第62页,利用基因芯片并行检测前列腺癌染色体畸变和基因表示谱,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第63页,研究所用48例前列腺癌样本和10例正常样本（9例前列腺组织和1例肾脏组织）由北京大学从属第一医院提供,表示谱分析,25例前列腺癌样本和3例正常前列腺组织进行了表示谱芯片试验，以混合人类胚胎组织为通用参考。利用平均ratio值（R 0.5 or R -0.5）和非参数t检验（,p,0.1）双重标准筛选前列腺癌差异表示基因，并对差异表示基因进行EASE分析。,array-CGH,18例前列腺癌样本和1例肾脏组织（正常对照）进行了array-CGH试验。利用ACE算法分析试验数据，寻找前列腺癌染色体扩增和缺失。,整合分析,11例前列腺癌样本同时进行了表示谱和CGH试验。,芯片类型：博星基因芯片有限企业8000点基因芯片（cDNA芯片）,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第64页,整合分析,11例前列腺癌样本同时进行了表示谱和CGH试验。我们对这11个样本每个样本计算了余弦相关系数以考查CGH和表示谱一致性。,为了寻找表示受到染色体畸变影响基因，挑选处于染色体扩增区（在 10%18例前列腺癌）表示上调（在25例前列腺癌）基因和处于染色体缺失区（在 10%18例前列腺癌）表示下调（在25例前列腺癌）基因。,对每个挑选出来基因计算了Jackknife相关系数来评定其表示水平和DNA拷贝数关系。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第65页,53个基因表示可能受到染色体畸变影响,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第66页,本研究发觉常见染色体畸变区域大部分在以前研究中报道过，不过与前人研究结果相比也存在畸变区域和畸变频率方面一些差异。究其原因，可能有以下几个方面：利用不一样试验伎俩、不一样分析算法和不一样判断标准都有可能造成研究报道之间差异；前列腺癌存在种族差异。,发觉新染色体畸变，如,Xq21.33-q22.2。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第67页,染色体畸变是一个很主要癌变机制，可能造成位于其上原癌基因激活或者抑癌基因丢失。,我们研究发觉基因表示水平和染色体拷贝数呈弱正相关。余弦相关是线性相关，考虑到DNA，mRNA和蛋白质之间复杂相互作用，我们不能够期待CGH和表示谱展现一个强正相关。,我们推测染色体拷贝数改变不是影响基因表示水平主导原因。很多其它机制如DNA突变、表观遗传学改变、RNA干扰等都在调控基因表示上起着主要作用。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第68页,小结,不一样类型芯片应用于肿瘤分子分型,基因芯片在肿瘤研究中的应用,第69页,