细胞核的分离与纯化及RNADNA的定量测定.pptx

1.了解细胞核分离纯化的基本原理和方法2.掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法3.掌握离心机的使用一、细胞核的分离与纯化（上午）二、RNA的定量测定三、DNA的定量测定（下午）一、细胞核的分离与纯化 DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、核酸的种类及其分布核 酸 核苷酸 磷 酸 碱 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差异）三、核酸的鉴定浓浓HClHCl 3H3H2 2O O+D核糖 糠醛 糠醛 3，5二羟基甲苯 绿色化合物 RNA水解 D核糖+Pi+A.G.C.U地衣酚法:（1）核糖核酸RNA的测定 DNA水解 D脱氧核糖+Pi+A.G.C.U-H-H2 2O O硫酸硫酸 脱氧核糖 羟基酮基戊醛蓝色化合物蓝色化合物二苯胺法:（2）脱氧核糖核酸DNA的测定1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3 mmol/L CaCl2）称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，TrisHCl（pH7.5）0.15mol/L NaCl液。在0.2mol/L TrisHCl pH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。4、1.5拧檬酸 5、0.9NaCl 6、0.02N NaOH 7、离心机 8、水浴箱 9、常规玻璃仪器试剂与器材试剂与器材 用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入 1.5柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。（1）肝细胞匀浆的制备（2）分离细胞质和细胞核将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。加入TrisHClNaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。加5ml 0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。0.88 mol/L蔗糖-柠檬酸溶液9ml核悬液0.25 mol/L0.88 mol/L初步纯化的细胞核其它的亚细胞结构半个肝脏1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆单层纱布过滤1次滤液离心：3500r/min；15min上清液（保留！）沉淀加入0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液1ml 核悬液沿壁缓铺于9ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；10min上清液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀上层液（弃去）沉 淀纯化的细胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核待测样品鉴定离心：2000r/min，10min细胞核的分离与纯化实验流程试剂（试剂（ml）12细胞质液细胞质液1.0-细胞核液细胞核液-1.01mol/LKOH1.01.02.显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:试剂（试剂（ml）12空白管空白管细胞质细胞质RNA水解液水解液1.0-细胞核细胞核RNA水解液水解液-2.0-5三氯醋酸三氯醋酸1.02.03,5一二羟基甲苯液一二羟基甲苯液3.03.03.01.水解：取试管二支，编号，按下表操作：混合各管沸水浴(10min)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心 2000r/min；5min上清液 立即混合各管沸水浴(10min)冷却660nm比色测定二、RNA的定量测定试剂（试剂（ml）12细胞质液细胞质液2.0-细胞核液细胞核液-2.01mol/L过氯酸过氯酸2.02.0试剂（试剂（ml）12空白空白管管细胞质细胞质DNA水解液水解液2.0-细胞核细胞核DNA水解液水解液-2.0-0.5mol/L过氯酸过氯酸2.0二苯胺试剂二苯胺试剂4.04.04.0混合各管冷却离心 上清液 立即混合各管冷却2000r/min;5min三、DNA的定量测定2.显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取试管二支，编号，按下表操作：沸水浴(10min)沸水浴(12min)595nm比色测定表1.RNA的定量结果试管编号试管编号1（细胞质液）（细胞质液）2（细胞核液）（细胞核液）原始吸光度值原始吸光度值查标准曲线所得数值查标准曲线所得数值提取液中提取液中RNA浓度（浓度（ug/ml）RNA占总占总RNA的百分比的百分比提取液中RNA浓度（ug/ml）=显色反应试管中RNA含量稀释倍数（细胞质液稀释倍数为10倍，细胞核液的稀释倍数为5倍）表2.DNA的定量结果试管编号试管编号1（细胞质液）（细胞质液）2（细胞核液）（细胞核液）原始吸光度值原始吸光度值提取液中提取液中DNA浓度（浓度（ug/ml）DNA占总占总DNA的百分比的百分比1.酸性溶液，取用要小心。2.混匀要充分，并且要注意安全，防止液体溢出。3.沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全。4.离心完后，一定先将上清液转出到另一试管，再吸取所需量的水解液。3.除了定糖法来测定DNA和RNA的含量，还有已经学习过的哪种方法也可以用来测定DNA和RNA的含量？1.为什么说本实验的题目不合适？2.我们已经学习了电泳法来分离蛋白质，请问我们是否可以用这种方法来分离DNA、RNA？实验七实验七 氨基酸的薄层分析氨基酸的薄层分析下次实验预习内容