SN∕T 3329-2012 中国普氏野马的物种鉴定方法 PCR方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 中国普氏野马的物种鉴定方法犘 犆 犚方法犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳 狊 狆 犲 犮 犻 犲 狊 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犳 狅 狉犈 狇 狌 狌 狊狆 狉 狕 犲 狑 犪 犾 狊 狉 犻 犻犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中国普氏野马的物种鉴定方法犘 犆 犚方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国山东出入境检验检疫局、 中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 郑小龙、 王群、 季新成、 梁成珠、 朱来华、 邓明俊、 岳志芹、 肖西志、 徐彪。犛 犖犜 中国普氏野马的物种鉴定方法犘 犆 犚方法范围本标准规定了中国普氏野马的物种鉴定的 方法。本标准适用于中国普氏野马的物种鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求方法原理根据普氏野马线粒体 控制区（ 区） 设计合成对特异性引物， 对普氏野马的目的基因进行 扩增， 判断样品中是否含有普氏野马的基因。普氏野马形态特征参见附录 。仪器设备 仪。 高速台式离心机。 台式离心机。 混匀器。 冰箱。 微量可调移液器（ 、 、 ） 及配套吸头。 离心管。试剂与材料 无水乙醇。 蒸馏水（ 应符合 中一级水的规格） 。 蛋白酶 。 十二烷基磺酸钠（ ） 。 十六烷基三乙基溴化铵（ ） 。 氯化钠。 三氯甲烷。 异戊醇。犛 犖犜 饱和酚。 乙醇。 缓冲液。 犜 犪 狇 聚合酶。 。 缓冲液（ ） 。 琼脂糖、 电泳缓冲液等（ 试剂配制见附录） 。 引 物： ： ： 将引物用双蒸水稀释为 ， 保存备用。检测方法 样品的处理 血液或精液样品： 可直接使用 新鲜、 冷藏、 冷冻的血液或精液。 动物组织或毛发： 置于液氮中充分研磨， 再将所研磨的材料放入 的离心管中。 样品 犇 犖 犃的提取可使用等效的商品化 提取试剂盒， 按操作说明书进行操作， 也可采用以下方法提取 。 取血液精液或充分研磨的组织样品， 加入 蛋白酶， 充分混匀， 水浴加热 。 加 和 预热的 ， 上下颠倒混匀， 水浴加热 。 加入 的三氯甲烷： 异戊醇（ ） ， 混匀， 室温离心 。 取上层水相于新管， 加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇（ ） ， 混匀， 室温离心 。 取上层水相于新管， 加入 体积的异丙醇沉淀核酸， 混匀， 放置 ， 室温离心 。 弃上清液， 加入 预冷的 乙醇， 室温离心 ， 弃上清液。 吸弃残留液体， 室温干燥 左右， 用 缓冲液溶解， 保存备用。 犇 犖 犃浓度和纯度的测定取适量 溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后， 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测 和 处的吸收值。 的浓度按照式（） 计算。犮犃 犖 （）式中：犮 浓度， 单位为微克每亳升（ ） ；犃 处的吸光值；犖 核酸稀释倍数。当浓度为 ，犃 犃 比值在 之间时， 适宜于 扩增。 犘 犆 犚检测 犘 犆 犚反应体系反应体系总体积为 ， 其中含样品 （ ）， 引物 和 （ ）犛 犖犜 各 ，犜 犪 狇 聚合酶（ ） ， （ 各 ）， 缓冲液 ，水 。也可采用商品化试剂盒的 扩增体系。样品检测时， 同时要设阳性对照和空白对照。 犘 犆 犚反应程序第一阶段： ；第二阶段： ， ， ， 个循环；第三阶段： 。 电泳制备琼脂糖凝胶板， 加样， 电压 ， 电流 ， 电泳 。 凝胶成像仪观察扩增产物电泳结束后， 用凝胶成像仪观察检测结果、 拍照， 记录试验结果。 确证实验通过 序列分析鉴定 产物。结果判定在同一块凝胶板上电泳后， 当阳性对照泳道出现一条 清晰条带， 空白对照泳道不出现任何条带， 相对分子质量标准成立时： 被测样品泳道出现一条 的条带， 则判定为检出普氏野马基因； 被测样品泳道没有出现大小为 的条带， 则判定为未检出普氏野马基因。 检测出现阳性结果时对扩增产物进行序列测定（ 序列参见附录） 。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）普氏野马的形态特征普氏野马（犈 狇 狌 狌 狊 狆 狉 狕 犲 狑 犪 犾 狊 狉 犻 犻） ， 又名野马、 准噶尔野马、 蒙古野马， 大型有蹄类， 普氏野马在分类学上属哺乳纲、 奇蹄目、 马科、 马属， 国家一级保护动物。普氏野马外形酷似家马， 比野驴略大， 体重 ， 体长 。头部较大， 耳短而圆， 颈鬃短而直立， 额部无长毛， 尾的上半部毛较短。夏毛背部呈浅棕色或焦茶色， 体侧色淡， 腹部浅黄色： 冬毛长而厚， 毛色更淡呈浅黄色。背部中央自腰部到尾基有一条狭窄的黑色脊线。夏季四肢具条不十分明显的横纹， 冬季很难看出。染色体狀 ， 不同于家马的狀 ； 二者的杂交后代有繁殖力。曾经分布于阿尔泰山以南、 天山以北的准噶尔盆地及玛纳斯河流域， 沿乌伦古河向东延伸到北塔山、 甘肃的马鬃山， 以及内蒙古的居延海附近。国外曾见于蒙古国的科布多盆地。犛 犖犜 附录犅（ 规范性附录）试剂的配制犅 犜 犃 犈电泳缓冲储存液 碱 冰乙酸 加双蒸水至 ， 应用前用双蒸水将 电泳缓冲液 倍稀释。犅 犜 犈缓冲液 （ ） （ ） 加水定容至 。犅 犛 犇 犛蛋白酶 犓称取 加入到 水中， 加热至 ， 搅拌助溶， 滴加浓盐酸调 到 ， 水定容至 ， 配制成 ； 用灭菌的含 乙酸钙的 （ ） 溶解蛋白酶， 配制成 蛋白酶溶液； 取 和 蛋白酶溶液， 混匀即成。犛 犖犜 附录犆（ 资料性附录）普氏野马犘 犆 犚扩增片段参考序列 犛 犖犜