DNA与蛋白质技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,1,方法及原理,(1),方法：电泳法。,(2),原理：,各种蛋白质分子带电性质的差异；,分子本身大小、形状的不同。,2,实验操作程序,(1),点样：用微量加样器取新制血清，小心加到电泳样品槽的胶面上。,(2),电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。,(3),染色：用质量分数为,0.05%,的考马斯亮蓝,R,250,染色液对凝胶进行染色。,(4),脱色：用体积分数为,7%,的醋酸溶液脱色。,(5),制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两层透气玻璃纸中间自然干燥。,特别提醒：,相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此蛋白质分子彼此分离。,1.,下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入,(,图,),和洗脱,(,图,),示意图，请据图回答下列问题。,(1),在加样示意图中，正确的加样顺序是,_,。,(2),用吸管加样时，应注意正确操作，分别是,_,、,_,、,_,。,(3),等样品,_,时，才加入缓冲液。,(4),待,_,接近色谱柱底端时，用试管收集流出液每,_mL,收集一管，连续收集。,解析：,进行凝胶色谱操作加样时，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使核内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，用吸管小心地将,1 mL,透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不可破坏凝胶面。吸管应贴着管壁加样，待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端出口，加入缓冲液，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每次,5 mL,收集一管，连续收集。,答案：,(1),(2),不,要触及破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动,(3),完全进入凝胶层,(4),红色的蛋白质,5,1,细胞内,DNA,复制与,PCR,技术的比较,细胞内,DNA,复制,PCR,不同点,解旋,在解旋酶作用下边解旋边复制,95,高温解旋，双链完全分开,酶,DNA,解旋酶、,DNA,聚合酶,耐高温的,DNA,聚合酶,引物,RNA,人工合成的,DNA,单链,温度,体内温和条件,高温,相同点,需提供,DNA,复制的模板；,四种脱氧核糖核苷酸作原料；,子链延伸的方向都是从,5,端到,3,端,2.PCR,技术反应过程中控制不同温度的意义,(1)95,变,性，双链,DNA,解旋为单链；,(2)55,复性，引物与两条单链,DNA,结合；,(3)72,延伸，耐高温的,DNA,聚合酶有最大活性，使,DNA,新链由,5,端向,3,端延伸。,2.,多聚酶链式反应（,PCR,）是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术。,PCR,过程一般经历,30,多次下述循环：,95,条件下使模板,DNA,变性、解链,55,条件下复性,(,引物与,DNA,模板链结合,),72,条件下引物链延伸,(,形成新的脱氧核苷酸链,),。下列有关,PCR,过程的叙述，不正确的是,(,),A,变性过程中破坏的是,DNA,分子内碱基对之间的氢键，也,可利用解旋酶实现,B,复性过程中引物与,DNA,模板链的结合是依靠碱基互补配对,原则完成的,C,延伸过程中需要,DNA,聚合酶、,ATP,、,4,种核糖核苷酸,D,PCR,与细胞内,DNA,复制相比，其所需要酶的最适温度较,高,解析：,PCR,一般要经历,30,多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物,延伸而成的,DNA,单链会与引物,结合，进行,DNA,的延伸。,DNA,变性,(90,95,),：双链,DNA,模板在热作用下，氢键断裂，形成单链,DNA,。复性,(55,60,),：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部双链。延伸,(70,75,),：在,Taq,酶,(,在,72,左右活性最高,),的作用下，以,dNTP(,三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写,),为原料，从引物的,5,端向,3,端延伸，合成与模板链互补的,DNA,链。,答案：,C,【,例,1】(2009,广东高考,)(1),商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生,_,，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间的,_,表示。,(2),利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：,中的主要成分为,_,；,中包含植酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶的方法及其依据。,_,。,(3),为构建基因工程菌，可用,PCR,等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。,PCR,反应包括多次循环。每次循环包括三步：,_,。反应过程中打开模板,DNA,双链的方法是,_,。,(4),除植酸酶外，微生物还能应用在哪些酶的生产中？,(,至少写两种,)_,错答案例：,（,1,）,透,明圈 植酸钠的生成量（,2,）杂质 电游法 根据蛋白质之间的电荷分子大小差异进行（,3,）变异,恢复,延长加热,(4),纤维素酶 蛋白酶,误点诊断：,本题综合考查酶的应用及,PCR,技术等相关的基础知识，题目背景较新，但答案很基础，由于学生答题不够仔细，基本技术的名称掌握不牢固，基本技术的流程把握不准确导致出错，对于选修内容应重点落实基础知识，规范用语，正确思路为：,(1),当植酸钙被植酸酶分解以后，会在平板上出现透明圈。植酸酶活性高低可以单位时间内底物减少量来表示。,(2),透析的目的是将酶与发酵液分开。分离不同种类的蛋白质可以用凝胶色谱法，原理是根据相对分子质量大小。,(3)PCR,技术包括三步：变性,复性,延伸，变性反应的原理是采用加热处理。,(4),微生物产生酶的种类很多。例如蛋白酶、脂肪酶等。,正答示范：,(1),透,明圈植酸钠的消耗量,(,减少量,),或磷酸,(,肌醇,),的生成量,(,产量,),(2),小分子杂质凝胶色谱法：根据蛋白质之间的分子大小、吸附性质等差异进行纯化,(,或电泳法：根据蛋白质之间的电荷、分子大小等差异进行纯化,),(3),变性、复性和延伸,(,长,),加热,(,或高温处理,),(4),蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶,【,例,2】,近,十年来，,PCR,技术,(,多聚酶链式反应,),成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用,DNA,半保留复制，在试管中进行,DNA,的人工复制,(,如图,),，在很短的时间内，将,DNA,扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1),加热使,DNA,双链打开，这一步是打开,_,键，称为,_,，细胞中是在,_,的作用下使此键断裂的。,(2),当温度降低时，引物与模板,_,端结合，在,DNA,聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个,DNA,分子，此过程中原料是,_,，遵循的原则是,_,。,(3)PCR,技术的必要条件，除了模板、原料、,ATP,、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的,_,和,_,。,(4),如图为某一次循环的产物，请据图回答问题。,PCR,一般要经历三十多次循环，每次循环可分为,_,、,_,、,_,三个步骤。,DNA,的羟基,(,OH),末端称为,_,，图中所示的羟基端为,_(,填字母,),。,PCR,技术与细胞内,DNA,复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用,_,酶使双链间氢键断裂，而,PCR,技术利用,_,原理使双链间氢键断裂。以引物为标记，可判断出此产物最早为第,_,次循环的产物。,思路点拨,：本题考查体内,DNA,复制与,PCR,技术的原理以及基本条件。,(1)PCR,技术利用热变性原理使,DNA,双链间的氢键断裂，称为解旋，而细胞中是在解旋酶的作用下使氢键断裂。,(2)PCR,技术扩增,DNA,与细胞内,DNA,复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的,3,端结合后，,DNA,聚合酶才发挥作用。,(3)PCR,技术与体内,DNA,复制不完全相同，除了需要模板、原料、,ATP,、酶以外，至少还需要液体环境,(,稳定的缓冲液环境,),、每一步骤需要适宜的温度及酸碱度。,(4),PCR,的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。,DNA,的两条链是反向平行的，为了明确地表示,DNA,的方向，通常将,DNA,的羟基,(,OH),末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端。,DNA,聚合酶不能从头合成,DNA,，只能从,3,端延伸,DNA,链。因此,DNA,复制需要引物，当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,3,端开始延伸,DNA,链，,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端延伸。由另一条新合成的,DNA,可知，,A,端为,3,端，,B,端为,5,端，,D,端为,3,端。,DNA,分子在细胞内复制或转录时，在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，,DNA,分子是在,80,100,的温度范围内变性，即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。,在,PCR,反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的,DNA,为模板，两条,DNA,链可分别由引物,和引物,与其结合并在,DNA,聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子,DNA,中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的,DNA,分子又可作为模板参与反应，所以会出现,DNA,分子两端均含引物的情况，如图所示：,因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。,答案：,(1),氢,解旋解旋酶,(2)3,四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则,(3),温度酸碱度,(4),高温变性低温复性中温延伸,3,端,A,、,D,解旋热变性一,【,互动探究,】,(1),用,于,PCR,的引物一般长度为,20,30,个核苷酸，它的化学本质是什么？,(2)PCR,反应中，如果以引物为标记，共有几种,DNA,分子产生？,提示：,(1),引物的作用是与模板链结合，提供,3,末端，使,DNA,聚合酶能够催化子链的延伸，在生物体内,DNA,复制时，引物一般为一小段,RNA,，但在,PCR,反应中，可以是一小段,DNA,或,RNA,。,(2),共有,3,种。,点击此处进入 随堂双基演练,谢谢,