蛋白质通论.pptx

蛋白质是一类重要的生物大分子，英文名称叫做protein，汉文译为蛋白质。蛋白质在生物体内占有特殊的地位，蛋白质和核酸是构成细胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的物质基础。第4章 蛋白质的共价结构第1页/共105页蛋白质蛋白质 蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。蛋白质在生命中的重要性蛋白质在生命中的重要性 早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。一一、蛋白质通论、蛋白质通论第2页/共105页 1.1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分蛋白质是生物体内必不可少的重要成分 蛋白质占干重 人体中（中年人）人体 45%水55%细菌 50%80%蛋白质19%真菌 14%52%脂肪19%酵母菌 14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%2.2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者蛋白质是一种生物功能的主要体现者 （1）酶的催化作用 （2）调节作用(多肽类激素)（3）运输功能 （4）运动功能 （5）免疫保护作用(干扰素)（6）接受、传递信息的受体 （7）毒蛋白3.3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象第3页/共105页蛋白质的组成元素组成：碳50、氢7、氧23、氮16、硫03、其他微量蛋白质的平均含氮量：16，凯式定氮法测量蛋白质含量的基础蛋白质含量蛋白氮6.25 （6.25即16的倒数，为1g氮所代表的蛋白质量（克数）。第4页/共105页按组成分：蛋白质的分类单纯蛋白质：完全由氨基酸构成，根据其物理 性质进行分类缀合蛋白质：氨基酸辅基（非蛋白），根据 其非氨基酸成分进行分类第5页/共105页按生物学功能分：酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等按形状分：纤维状蛋白质、球状蛋白质、膜蛋白按肽链的多少（相对分子质量）分：单体蛋白质、寡聚蛋白质（多聚蛋白质）第6页/共105页蛋白质的形状第7页/共105页蛋白质的大小与分子量蛋白质的大小与分子量 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。第8页/共105页l蛋白质分子量的变化范围很蛋白质分子量的变化范围很大，从大约大，从大约60006000到到10000001000000道道尔顿（尔顿（DaDa）或更大。或更大。l某些蛋白质是由两个或更多某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基个蛋白质亚基(多肽链多肽链)通过非通过非共价结合而成的，称共价结合而成的，称寡聚蛋白寡聚蛋白质质。有些寡聚蛋白质的分子量。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。可高达数百万甚至数千万。第9页/共105页蛋白质通论第10页/共105页单体蛋白质：仅由一条多肽链构成寡聚蛋白质：两条或多条多肽链构成，其中每条多肽链称为亚基，亚基之间通过非共价键相互缔合不含辅基的蛋白质，用110除它的相对分子质量即可估计其氨基酸残基的数目。（蛋白质氨基酸的平均相对分子质量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均相对分子质量接近128，形成肽键时除去一分子水，所以氨基酸平均相对分子质量128-18110）第11页/共105页蛋白质的构象蛋白质的构象：每一种天然蛋白质都有自己的特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常称为构象。构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。构型的改变必需通过共价键的破裂的改变。第12页/共105页蛋白质的结构层次一级结构：基本结构，多肽链的氨基酸序列，由肽键连接而成的结构。二级结构：多肽链主链构象 主要动力：氢键 主要形式：螺旋、折叠三级结构：多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。一级结构决定高级结构，高级结构决定蛋白质功能。第13页/共105页蛋白质的结构层次第14页/共105页蛋白质功能的多样性第15页/共105页 二二 肽（肽（peptidepeptide）n一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为失水形成的酰胺键称为肽键肽键，所形成的化合物，所形成的化合物称为称为肽肽。（一）肽、肽键与肽平面（一）肽、肽键与肽平面（一）肽、肽键与肽平面（一）肽、肽键与肽平面由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由几几个个到到几几十十个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为寡寡肽肽，由由更更多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成肽肽链链的的氨氨基基酸酸单单元元称称为为氨基酸残基氨基酸残基。第16页/共105页 肽键肽键（peptide bondpeptide bond）n肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。n组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。0.1270.127nmnm键长键长=0.132=0.132nmnm 0.149nm0.149nm第17页/共105页肽键平面的形成肽键平面的形成第18页/共105页肽键肽键第19页/共105页n肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键键性性质质，不不能能自自由由旋旋转转。C-NC-N键键约约有有4040的的双双键键性性质，而质，而C-OC-O键具有键具有4040单键性质。单键性质。n组成肽基的组成肽基的4 4个原子和个原子和2 2个相邻的个相邻的C C原原子倾向于共平面，形成子倾向于共平面，形成肽平面肽平面。两个。两个C C可以处于顺式构型或反式构型。在可以处于顺式构型或反式构型。在大多数情况下，以大多数情况下，以反式结构反式结构存在。但存在。但脯氨酸脯氨酸形成的肽键除外，可以是顺式，形成的肽键除外，可以是顺式，也可以是反式的也可以是反式的。第20页/共105页第21页/共105页肽单位肽单位 多肽链是由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的。多肽链是由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的。多肽链主链骨架的重复单位就是多肽链主链骨架的重复单位就是肽单位肽单位，它是由肽键的，它是由肽键的4 4个原子与相连的两个个原子与相连的两个碳原子组成的基团。碳原子组成的基团。肽单位结构基本上是固定的，有下列特征：肽单位结构基本上是固定的，有下列特征：1.1.肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键中的肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键中的 C-NC-N键的键长为键的键长为 0.132 0.132nmnm，比大多数其他化合物的比大多数其他化合物的 C-NC-N单单键（键（0.1490.149nmnm）短，比短，比 C=NC=N双键（双键（0.1270.127nmnm）又长些。因又长些。因此，肽键具有部分（约此，肽键具有部分（约4040）双键性质；具有刚性，不能）双键性质；具有刚性，不能自由旋转。自由旋转。第22页/共105页2.2.肽单位是刚性平面结构。即肽单位的肽单位是刚性平面结构。即肽单位的6 6个原子都位于同一个个原子都位于同一个刚性平面上，又称刚性平面上，又称肽平面或酞胺平面肽平面或酞胺平面。3.3.肽单位中，肽单位中，C=OC=O与与N-HN-H或两个或两个碳原子呈反式排布。这是碳原子呈反式排布。这是因为反式构型的能量比顺式构型的能量低。因为反式构型的能量比顺式构型的能量低。4.4.肽单位平面结构有一定的键长和键角。肽单位平面结构有一定的键长和键角。0.1270.127nmnm键长键长=0.132=0.132nmnm 0.149nm0.149nm第23页/共105页肽链中肽链中AAAA的排列顺序和命名的排列顺序和命名第24页/共105页第25页/共105页n在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序n通常在多肽链主链的一端含有一个游离的氨基，通常在多肽链主链的一端含有一个游离的氨基，称为称为氨基端氨基端或或N-N-端；在另一端含有一个游离的羧端；在另一端含有一个游离的羧基，称为基，称为羧基端羧基端或或C-C-端。如果多肽链主链末端的端。如果多肽链主链末端的氨基和羧基连接起来，则称氨基和羧基连接起来，则称环状肽或环肽环状肽或环肽。n氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。肽的命名是根端氨基酸残基为终点的排列顺序。肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的，规定从肽据参与其组成的氨基酸残基来确定的，规定从肽链的链的NHNH2 2末端氨基酸残基开始，称某氨基酰某氨基末端氨基酸残基开始，称某氨基酰某氨基酰酰某氨基酸。如上述五肽可表示为：某氨基酸。如上述五肽可表示为：n Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Glnn 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰氨丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰氨第26页/共105页四肽的结构四肽的结构第27页/共105页（二）肽的重要理化性质（二）肽的重要理化性质1.熔点高。这说明它和氨基酸一样，是以偶极离子形式形成离子晶格而存在的。2.具有酸碱两性性质和等电点。肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链R上可解离的基团。每一种肽都有其相应的等电点。第28页/共105页3.具有旋光性。这是由于肽中有不对称C原子存在。一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和。但是较长的肽，其旋光度则不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。4.具双缩脲反应。这是肽和蛋自质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，利用此反应借助分光光度法可测定肽或蛋白质含量。第29页/共105页5.具紫外吸收。如果肽中存在有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，则在280nm处有最大吸收峰。利用这个特性可对肽类进行定量测定。6.其他反应。由于肽中存在游离的-NH2和游离-COOH，所以能进行茚三酮反应、酰化反应、酯化反应等许多反应。第30页/共105页第31页/共105页 在给定的在给定的pHpH下，根据下，根据HendersonHendersonHasselbalchHasselbalch方程方程不难确定出每个侧链占优势的电离态。我们只需掌握这不难确定出每个侧链占优势的电离态。我们只需掌握这样一个规则：样一个规则：当溶液当溶液pHpH大于解离侧链的大于解离侧链的PKPKa a值，占优势值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的pHpH小于解离侧小于解离侧链的链的PKPKa a值，占优势的离子形式是它的共轭酸，即：值，占优势的离子形式是它的共轭酸，即：第32页/共105页第33页/共105页第34页/共105页第35页/共105页（三）天然存在的重要多肽（三）天然存在的重要多肽n在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。白质的亚单位。n但是，生物体也有许多分子量比较小的多肽以但是，生物体也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为理功能，常称为活性肽活性肽（active peptideactive peptide）。）。n如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。胱甘肽；蛇毒多肽等。第36页/共105页与真核生物的与真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶 牢固结合牢固结合第37页/共105页第38页/共105页三三 蛋白质的一级结构的测蛋白质的一级结构的测定定1 1.定义定义 1969年，国年，国际纯化学与应用化学委员际纯化学与应用化学委员会（会（IUPAC）规定：规定：蛋蛋白质的一级结构指蛋白质白质的一级结构指蛋白质多肽连中多肽连中AA的排列顺序，的排列顺序，包括二硫键的位置。包括二硫键的位置。其中其中最重要的是多肽链的氨最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。生物功能的基础。第39页/共105页 2.2.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定n蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。上千种不同蛋白质的一级结构被测定。第40页/共105页a a、样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；b b、知道蛋白质的相对分子量；知道蛋白质的相对分子量；c c、知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；（1 1）测定蛋白质一级结构的要求）测定蛋白质一级结构的要求第41页/共105页蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链拆分多肽链断开多肽链内的二硫键断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端末端裂解多肽链为较小的肽段裂解多肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键的位置确定二硫键的位置第42页/共105页 (2)(2)测定步骤测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。肽链的数目。B.多肽链的拆分多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。第43页/共105页几条多肽链借助非共价键连接在一起，称几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为为寡聚蛋白质寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，如，血红蛋白为四聚体，可用可用8 8mol/Lmol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍或高浓盐酸胍或高浓度盐处理，即可分开多肽链度盐处理，即可分开多肽链(亚基亚基)；如；如果多肽链间是通过共价二硫桥连接的，果多肽链间是通过共价二硫桥连接的，如胰岛素，可采用氧化剂或还原剂将二如胰岛素，可采用氧化剂或还原剂将二硫键断裂。硫键断裂。第44页/共105页第45页/共105页 (2)(2)测定步骤测定步骤C.二硫键的断裂 多肽链间或内通过二硫键交联在一起。多肽链间或内通过二硫键交联在一起。可在可在8 8mol/Lmol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇(还原法还原法)处理，使处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（如，（如，ICHICH2 2COOHCOOH）保护生成的巯基，以保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。防止它重新被氧化。第46页/共105页第47页/共105页S SS SS SS SS SS S胰岛素胰岛素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH-巯基乙醇巯基乙醇二硫键的断裂二硫键的断裂二硫键的断裂二硫键的断裂巯基（巯基（-SH）的保护的保护第48页/共105页D 氨基酸组成的分析蛋白质的组成分析可用酸水解，同时辅以碱水解。水解中氨基酸遭破坏的程度与保温时间呈线性关系，因此该氨基酸在蛋白质中的真实含量可通过不同的保温时间测出样品中该氨基酸的含量并外推出至零时间的含量的方法求出。蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示，或用每100g蛋白质中含氨基酸的克数表示。第49页/共105页 测测定定每每条条多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸组组成成第50页/共105页第51页/共105页 (2)(2)测定步骤测定步骤 E.E.分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。n多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)amino-terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。n在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定第52页/共105页nSangerSanger法法：2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-DNP-多多肽或肽或DNP-DNP-蛋白质）。蛋白质）。DNP-DNP-多肽在酸性条件下水解，只有多肽在酸性条件下水解，只有N-N-末端氨基酸为末端氨基酸为黄黄色色DNP-DNP-氨基酸衍生物，氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的鉴别所生成的DNP-DNP-氨基酸，就可得知氨基酸，就可得知N-N-末端氨基酸。末端氨基酸。该产物能够用有机溶剂（如乙醚、乙酸乙酯）该产物能够用有机溶剂（如乙醚、乙酸乙酯）抽提抽提分分离。不同的离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法法第53页/共105页n在在碱性碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNSDNS）可可以与以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。n此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的氨基酸有很强的荧光荧光性质，检测灵性质，检测灵敏度可以达到敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol，比比DNFBDNFB法高法高100100倍。倍。DNS-DNS-氨基酸氨基酸不需要抽提不需要抽提，可直接用纸电泳或者薄层层析加以鉴定。，可直接用纸电泳或者薄层层析加以鉴定。N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法第54页/共105页n多肽或蛋白质的末端氨基能与多肽或蛋白质的末端氨基能与PITCPITC（EdmanEdman试剂试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称PTCPTC-多肽或多肽或PTCPTC-蛋白质。后者在酸性有机溶剂蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，中加热时，N N一末端的一末端的PTCPTC一氨基酸发生环化，一氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去除去N N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为因为PTCPTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表。反应液中代表N-N-末端残基的末端残基的PTHPTH-氨基酸氨基酸，经，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层折、气相色有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层折、气相色谱和谱和HPLCHPLC等进行鉴定。此方法还可以用来测定等进行鉴定。此方法还可以用来测定氨基酸序列。氨基酸序列。苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITCPITC）法）法N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定第55页/共105页n氨肽酶是一类氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶肽链外切酶或叫外肽酶，它们能，它们能从多肽链的从多肽链的N N末端逐个地向里切。根据不同末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的就能知道该蛋白质的N N-末端残基序列。末端残基序列。n最常用的氨肽酶是最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶（LAPLAP），），亮亮氨酸氨肽酶不是只能水解以氨酸氨肽酶不是只能水解以LeuLeu为为N N-末端残基末端残基的肽键，只是水解以的肽键，只是水解以LeuLeu为为N N-末端的肽键速度末端的肽键速度为最大。为最大。氨肽酶法氨肽酶法N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定第56页/共105页序列是Gly-Ser-Val第57页/共105页n此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质物质而与C-端氨基酸分离。游离的C-端氨基酸可用FDNB法或DNS法及层析技术进行鉴定。n肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏不谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏不易测出，易测出，C C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸。末端的精氨酸转变为鸟氨酸。C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定肼解法肼解法第58页/共105页还原法还原法C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定肽链肽链C C一末端氨基酸也可用硼氢化锂还原成相一末端氨基酸也可用硼氢化锂还原成相应的应的-氨基醇。肽链完全水解后，代表原来氨基醇。肽链完全水解后，代表原来C C-末端氨基酸的末端氨基酸的-氨基醇，可用层析法加氨基醇，可用层析法加以鉴别。以鉴别。第59页/共105页n羧肽酶是一种羧肽酶是一种肽链外切酶肽链外切酶，它能从多肽链的，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解AAAA。根据不同的反应时间测。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定羧肽酶羧肽酶(carboxypeptidase)carboxypeptidase)法法第60页/共105页n目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自来自面包酵母。面包酵母。n羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的以外的所有所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。羧肽酶羧肽酶(carboxypeptidase)carboxypeptidase)法法C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定第61页/共105页（2 2）测定步骤）测定步骤F.F.多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 可采用两种可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。离开来。多肽链断裂法：多肽链断裂法：酶解法和化学法酶解法和化学法第62页/共105页 酶解法酶解法:n最常用的蛋白水解酶：胰蛋白酶，糜蛋最常用的蛋白水解酶：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，又叫白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，又叫肽链内切酶或内肽酶肽链内切酶或内肽酶。多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的选选选选择择择择性性性性降降降降解解解解第63页/共105页nTrypsinase ：R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链（专一性较侧链（专一性较强，水解速度快）。强，水解速度快）。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。肽链肽链水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2第64页/共105页 有时待测的多肽链中赖氨酸残基和（或）精有时待测的多肽链中赖氨酸残基和（或）精氨酸残基的数量较多，为了减少胰蛋白酶的作用氨酸残基的数量较多，为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基团保护起来位点，可以通过化学修饰将其侧链基团保护起来。例如用。例如用马来酸酐马来酸酐（即顺丁烯二酸酐）可以保护（即顺丁烯二酸酐）可以保护LysLys残基侧链上的残基侧链上的-NH-NH2 2，这样胰蛋白酶就不会这样胰蛋白酶就不会水解水解LysLys残基的羧基端肽键，只能断裂残基的羧基端肽键，只能断裂ArgArg残基羧残基羧基端的肽键。反之，如果用基端的肽键。反之，如果用1 1，2-2-环己二酮环己二酮修饰修饰ArgArg的胍基，则胰蛋白酶只能断裂的胍基，则胰蛋白酶只能断裂LysLys残基羧基端残基羧基端的肽键。的肽键。如果想增加多肽链中胰蛋白酶断裂点，可以如果想增加多肽链中胰蛋白酶断裂点，可以用用氮丙啶氮丙啶处理多肽链样品，这对处理多肽链样品，这对CysCys残基侧链被残基侧链被修饰成类似修饰成类似LysLys的侧链，也具有的侧链，也具有-NH-NH2 2 。这样，。这样，胰蛋白酶便能断裂胰蛋白酶便能断裂CysCys残基羧基端的肽键。残基羧基端的肽键。胰胰蛋蛋白白酶酶第65页/共105页n或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（C Chymotrypsinhymotrypsin）：）：R R1 1=Phe,=Phe,Trp,TyrTrp,Tyr时水解快时水解快;R R1 1=Leu=Leu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。nR R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。肽链水解位点水解位点糜糜蛋蛋白白酶酶第66页/共105页nP Pepsinepsin：R R1 1和和R R2 2Phe,Trp,Tyr;Phe,Trp,Tyr;LeuLeu以及其它疏水以及其它疏水性氨基酸水解速度性氨基酸水解速度较快较快。nR R1 1=Pro=Pro 不水解。不水解。肽链水解位点水解位点胃胃蛋蛋白白酶酶第67页/共105页nthermolysinthermolysin：R R2 2=Phe,Trp,Tyr;=Phe,Trp,Tyr;LeuLeu，Ile,MetIle,Met以及其它疏水性强的以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。氨基酸水解速度较快。nR R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。nR R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。肽链水解位点水解位点嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶第68页/共105页木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶R R1 1=Arg=Arg或或LysLys第69页/共105页n前者又叫谷氨酸蛋白酶：前者又叫谷氨酸蛋白酶：R R1 1=Glu=Glu、Asp(pH7.8Asp(pH7.8磷酸缓冲液磷酸缓冲液););R R1 1=Glu=Glu(pH7.8(pH7.8碳酸氢铵缓冲液或碳酸氢铵缓冲液或pH4.0pH4.0醋酸醋酸铵缓冲液铵缓冲液)n后者又叫精氨酸蛋白酶：后者又叫精氨酸蛋白酶：R R1 1=Arg=Arg肽链水解位点水解位点葡葡萄萄球球菌菌蛋蛋白白酶酶和和梭梭菌菌蛋蛋白白酶酶第70页/共105页 化学法：化学法：可获得较大的肽段可获得较大的肽段溴化氰溴化氰(Cyanogen bromide)Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切水解法，它能选择性地切割由割由甲硫氨酸的羧基甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。所形成的肽键。第71页/共105页羟胺（羟胺（NHNH2 2OHOH）：）：专一性断裂专一性断裂-AsnAsn-Gly-Gly-之间之间的肽键。也能部分裂解的肽键。也能部分裂解-AsnAsn-Leu-Leu-之间的之间的肽键以及肽键以及-AsnAsn-Ala-Ala-之间的肽键。之间的肽键。第72页/共105页 （2 2）测定步骤测定步骤G.G.分离肽段分离肽段,测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。第73页/共105页nEdman Edman（苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯P PITCITC法）法）氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法实际上也是一种实际上也是一种N-N-端分析法。此法的特点是能够不端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行解离。端氨基酸残基逐一进行解离。E E E Ed d d dm m m ma a a an n n n氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸顺顺顺顺序序序序分分分分析析析析法法法法第74页/共105页第75页/共105页第76页/共105页 Edman降解法现在已有多种改进形式。例如DNSEdman测序法，它是用前述的DNS法测定肽链的N一末端贱基，用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链样品。此外为提高检出被释放残基（PTH一氨基酸）的灵敏度，采用荧光基团或有色基团等标记的PITC试剂，如4一N，N一二甲氨基偶氮苯4，异硫氰酸酯（缩写为DABITC）就是改进的有色Edman降解试剂。生成的PTH氨基酸在紫外区有强吸收，可利用各种层析技术分离。第77页/共105页第78页/共105页 测测定定每每条条多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸组组成成第79页/共105页 （2）测定步骤）测定步骤H.H.确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。的氨基酸顺序。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定第80页/共105页 示例示例(十肽的水解十肽的水解)A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：A1 Ala-PheA1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-Val A4 His-ValB B法水解得到三个小肽：法水解得到三个小肽：B1 Ala-Phe-Gly-LysB1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val B3 Tyr-His-Val第81页/共105页N-N-末端残基末端残基H HC-C-末端残基末端残基S S第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段OUS SEOOUS SEOPS WTOUPS WTOUEOVE VERLEOVE VERLRLA APSRLA APSHOWT HOHOWT HO氨基酸顺序怎样排列？氨基酸顺序怎样排列？第82页/共105页 （2）测定步骤）测定步骤I.I.确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置采用胃蛋白酶水解：采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳切点多，二硫键稳定定第83页/共105页n一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换换)。n将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的的对对角线电泳技术角线电泳技术进行分离。进行分离。二二硫硫键键位位置置的的确确定定第84页/共105页S SS SHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H第85页/共105页+-+-第第二二向向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段第86页/共105页n将每对含磺基丙氨酸的肽段取下，进行将每对含磺基丙氨酸的肽段取下，进行氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链间或肽链内的位置。间或肽链内的位置。二二硫硫键键位位置置的的确确定定第87页/共105页 3.3.蛋白质一级结构举例蛋白质一级结构举例 （1 1）胰岛素（）胰岛素（InsulinInsulin）A A链链B B链链一个链内二硫键和两一个链内二硫键和两个链间二硫键，分子个链间二硫键，分子量量57005700A A链链2121个个aaaa残基残基B B链链3030个个aaaa残基残基第88页/共105页 （2 2）牛胰核糖核酸酶（）牛胰核糖核酸酶（RNaseRNase）一条多肽链，一条多肽链，124124AAAA残基组成，四残基组成，四 个链内二硫键，分子量个链内二硫键，分子量1260012600。它是测出一它是测出一级结构的第一个酶分子。级结构的第一个酶分子。第89页/共105页 四四 蛋白质一级结构与生物功能的关系蛋白质一级结构与生物功能的关系 （一）同源蛋白质的物种差异与生物进化（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1 1、同源蛋白质同源蛋白质在不同生物体中行使相同或相似在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的功能的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，称为相似性，称为序列同源性序列同源性。具有明显。具有明显序列同源序列同源的蛋白的蛋白质也称为同源蛋白质。质也称为同源蛋白质。同源蛋白质含有不变残基和可变残基。同源蛋白质含有不变残基和可变残基。2 2、细胞色素、细胞色素C C 细胞色素细胞色素C C是真核细胞线粒体内膜上一种含是真核细胞线粒体内膜上一种含FeFe的的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。第90页/共105页血红素结合部位血红素结合部位酶结合部位酶结合部位第91页/共105页 通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C C一级结构的研究表明：一级结构的研究表明：（1 1）亲缘关系越近，）亲缘关系越近，AAAA顺序的同源性越大。顺序的同源性越大。不同生物与人的细胞色素不同生物与人的细胞色素C C相比较相比较AAAA差异数目差异数目 黑猩猩黑猩猩 0 0 鸡、火鸡鸡、火鸡 13 13 牛猪羊牛猪羊 10 10 海龟海龟 15 15 狗驴狗驴 11 11 小麦小麦 35 35 粗糙链孢霉粗糙链孢霉43 43 酵母菌酵母菌 44 44 （2 2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素素C C功能密切相关的功能密切相关的AAAA顺序却有共同之处，即保守顺序顺序却有共同之处，即保守顺序不变（不变残基）不变（不变残基）第92页/共105页（二）同源蛋白质具有共同的进化起源（二）同源蛋白质具有共同的进化起源1、氧合血红素蛋白肌红蛋白、血红蛋白的链和链是珠蛋白，它们有很高的序列同源。人肌红蛋白和人-珠蛋白链有38个氨基酸是相同的，人-珠蛋白和人-珠蛋白有64个残基是共同的。第93页/共105页20世纪 以氨基酸为原料合成了一个十八肽。1953年 美国 Du.Vigneaud：生物活性的催产素 1965年 中国：生物活性的牛胰岛素 1962年 美国Merrifield：固相合成法 五 肽与蛋白质的合成第94页/共105页（一）肽的人工合成两种类型：一是由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成，二是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。控制合成所选的试剂必需能和其他不应参加接肽的功能团不