细胞工程复习.doc

生物工程(bioengineerinng): 是以生命科学为基础, 利用生物体系和工程学原理生产生物制品和发明新物种一门综合技术。
细胞工程(cell engineering):是指应用细胞生物学和分子生物学方法, 经过类似于工程学步骤, 在细胞整体水平或细胞器水平上, 根据大家意愿来改变细胞内遗传物质以取得新型生物或特种细胞产物一门综合性科学技术。
愈伤组织(callus): 由外植体组织增生细胞产生一团不定型疏散排列薄壁组织。
外植体(explant): 指植物组织培养中用来进行离体无菌培养离体材料, 能够是器官、 组织、 细胞和原生质体等。
脱分化（dedifferentiation）: 又称去分化, 在一些特定条件下, 分化细胞表型也不稳定, 其基因活动模式也发生可逆改变, 细胞脱离原状态而回复到分生状态改变过程。
再分化(redifferentiation): 是指在离体条件下, 无序生长脱分化细胞在合适条件下重新进入有序生长和分化状态过程。 原代培养（primary culture）: 在首次传代前培养。又称初代培养。
传代培养（passage culture/subculturing）: 又称继代培养, 是指原代培养细胞继续转接培养过程。
看护培养（nursing culture）: 是指用一块生长活跃愈伤组织来看护单个细胞, 使其连续分裂和增殖一个培养方法。
喂养层培养（feed layer culture）: 是把处理过（如X射线处理）无活性或分裂很慢细胞来喂养所需培养细胞。
植物组织培养（plant tissue culture）: 是指在无菌条件下, 将离体植物器官、 组织、 细胞、 胚胎、 原生质体等培养在人工配置培养基上, 给予合适培养条件, 诱导产生愈伤组织, 潜伏芽, 或者长成新完整植株一个试验技术。
植物细胞培养: 指在离体条件下, 将愈伤组织或其她易分散组织置于液体培养基中进行震荡培养, 得到分散成游离悬浮细胞, 经过继代培养使细胞增殖, 从而取得大量细胞群一个技术。
种质资源（germplasm resources）: 又称遗传资源, 指一切含有一定种质或基因并能并能繁殖生物类型总称, 而种质是指决定生物遗传性状并将生物遗传信息从亲代传输给子代遗传物质。
人工种子（artificial seed）: 又称合成种子或体细胞种子, 是指将植物离体培养胚状体或芽包裹在含有养分和保护功效人工胚乳和人工种皮中类似种子颗粒。
悬浮培养（suspension culture）: 将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖技术。
细胞融合(cell fusion): 又称体细胞融合, 使用自然或人工方法使两个或两个以上细胞合并形成一个细胞技术。 原生质体(protoplast): 是去除细胞壁后裸露球形细胞。
体细胞杂交（somatic cell hybridization）: 是指将不一样起源体细胞融合并使之分化再生, 形成新品种技术。
染色体工程（chromosome ngineering）: 是大家根据一定设计, 有计划地消减、 添加或替换同种或异种染色体, 从而达成定向改变遗传性状和选育新品种一个技术。
多倍体(polyploid): 指体细胞中含有超出正常染色体组数个体, 即含有三套以上染色体组细胞或个体。 同源多倍体: 假如多倍体染色体来自于同一物种或在原有染色组基础上加倍而成个体。
异源多倍体: 假如多倍体染色体起源于不一样物种个体。
单倍体(haploid): 是细胞中含有正常体细胞二分之一染色体数个体, 即含有配子染色体组个体。
动物细胞培养(animal cell culture): 模拟动物体内生理环境, 在无菌、 适温和丰富营养条件下, 使离体细胞分裂增殖一个技术, 是动物细胞工程基础。
杂交瘤细胞(hybridoma cell): 在制备单克隆抗体过程中, 用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成细胞。
单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）: 经过免疫哺乳类动物单一B淋巴细胞能够分泌单一性抗体, 这种含有特异性、 同质性抗体就称为~~。
胚胎工程（embryo technology）: 指全部对配子和胚胎进行人为地干预, 使其环境原因、 发育模式或局部组织功效发生质和量改变, 取得所需成体动物技术。
体外受精(in vitro fertilization,IVF): 将哺乳动物精子和卵子在体外人工控制环境中完成受精过程技术。
核移植(nuclear transfer): 利用显微操作技术将一个动物细胞核移入同种或异种动物去核成熟卵细胞内, 重新组成重构胚并使之发育成成体动物技术。
多倍体动物(polyploidy animal): 指细胞中含有超出正常体细胞染色体组数动物个体。
转基因动物(transgenic animal): 指在基因组内稳定地整合外源基因, 而且外源基因能够稳定地遗传给后代基因工程动物。 干细胞(stem cell,SC): 一类含有自我更新和分化潜能细胞, 即起源细胞。
内细胞团(embryoblast): 又称胚细胞, 是一团位于哺乳动物早期胚胎中一个细胞团块。
组织工程(tissue engineering): 利用生命科学、 医学、 工程学原理与技术, 单独或组合地利用细胞、 生物材料、 细胞因子实现组织修复或器官再生一门技术。
种子细胞(ssed cell): 是组织修复或器官再生细胞材料, 细胞必需能不停进行细胞分裂, 且必需能被调控分化成特定组织细胞。
胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）: 是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离一个全能性细胞。
成体干细胞（adult stem cell,ASC）: 是成体组织内含有更新和深入分化潜能细胞。
1.简述植物组织培养通常过程【 1）培养材料采集: 植物含有全能性细胞有三类: 受精卵、 发育中发生组织细胞、 雌雄配子及单倍体细胞。在快速繁殖中最常见材料是茎尖, 通常切块在0.5cm左右, 对于木本花卉来说, 针叶树种多采取种子内子叶或胚轴, 草本植物多采取茎尖。2）培养材料消毒: 自来水、 蒸馏水、 消毒刀切成小块, 无菌环境下70%酒精, 漂白粉饱和液。3）制备外植体:消毒刀切成0.2~0.5cm小片4）接种和培养 接种、 封口、 温度25 5）培养物增殖: 继代培养, 增殖在分化培养基上6）根诱导: 生根培养基上进行生根培养7)炼苗移栽 8）再生植株判定:用细胞学或生态学等方法检验再生植株是否变异】
2.组织培养与细胞培养区分与联络【区分①组织培养: 从机体内取出组织或细胞, 模拟机体内生理条件, 在机体外进行培养, 使之生存或成长成组织; 细胞培养: 指植物细胞在体外条件下存活或生长, 此时细胞不长成组织。②组织培养用于植物快速繁殖组培技术, 细胞培养关键用以生产次生代谢产物为目大规模细胞培养技术。联络: 植物细胞培养部分技术是建立在组织培养基础上。
3.植物增殖方法有多个, 分别有什么特点。
【1）腋芽增殖: 培养方法简单, 能高度保持遗传稳定性, 能长久继代繁殖, 通常不需要添加外源激素。缺点: 繁殖系数较小2）不定芽繁殖: 繁殖系数高, 遗传稳定性好, 但继代次数有限, 进行生根培养时才能形成真正植株。缺点: 传代次数受限3）胚状体增殖: 增加率高, 双极性免去生根步骤, 胚状体休眠诱导难以把握, 通常能够做人工种子。缺点: 胚状体休眠难以把握, 成苗率不高4)愈伤组织增殖: 成功率高, 繁殖系数大。缺点: 遗传稳定性差, 对品种要求遗传稳定性高作物通常不采取这种快速繁殖。】
4.热处理脱毒与茎尖脱毒原理及其技术。
（一）热处理脱毒原理1)病毒进入植物细胞后, 随植物细胞DNA一起复制, 热处理不能杀死病毒, 只能转化病毒活性, 使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止, 而失去侵染能力2）热处理是一个物理效应, 加重植物细胞分裂, 使植物细胞在与病毒繁殖中取胜。热处理脱毒方法①温水浸湿处理: 材料置于50℃左右热水中浸渍几十分钟到数小时。特点: 简单易行, 成本低, 但易使材料受伤②热空气处理: 将植物用35～40℃热空气处理2～4周或更长时间。特点: 损伤较小, 操作简便, 须严格控制温度时间。
（二）茎尖脱毒: 病毒在植物体分布不均一, 在植物体内传输关键以维管束为主, 越靠近生长点约0.1~1.0mm病毒浓度越稀。技术关键: 1）诊疗病毒种类及分布2）母体植物选择与预处理3）茎尖剥离4）脱毒苗保留和繁殖。
5.影响茎尖脱毒原因【①母体材料病毒侵染程度: 单一病毒感染植物脱毒效果好。②外植体生理状态: 生长旺盛芽比休眠芽好③起始培养珠尖大小: 不带叶原基生长点培养脱毒效果最好。】
6. 超低温保留原理（方法）【超低温保留通常是指在低于—80度超低温环境下保留种质资源。而液氮为—196度, 此时几乎全部细胞代谢活动停止, 仅保留细胞活力和形态分生潜能, 当解冻后能恢复其再生能力（低温能抑制生物细胞生化活动）】
7.简述理想人工种子要求【人工种子关键由人工种皮、 人工胚乳和胚状体三部分组成, 而人工种子制作过程中包埋是非常关键步骤。所以对于人工胚乳, 理想包埋介质应满足1)对所包埋胚乳无伤害2）有足够柔软性, 能够保护胚乳, 许可其发育。3）含有一定硬度, 避免运输和操作过程中伤害4）有穿透性, 传输细胞生长所需营养, 并能容纳其她附加成份, 杀虫剂, 防腐剂等5）能够用现有温室和农机器械进行播种。适宜外植体愈伤组织经培养得到胚状体也很关键】
8.简述植物单细胞制备方法优缺点【1）机械法: 优点: 操作简单, 能够取得游离单个细胞, 细胞完整性很好。缺点: 效率低, 取得细胞数量有限。2）酶解法: 优点: 用果胶酶处理细胞壁, 将细胞释放出来, 轻易取得大量单细胞。缺点: 酶成本高, 且对细胞活性有一定破坏。3）愈伤组织诱导法: 优点: 经过愈伤组织反复几代培养, 使细胞之间结构非常松散, 便于得到单个细胞。缺点: 操作复杂, 且添加酶对细胞活性有一定影响】
9.简述理想植物细胞悬浮体系要求【1）悬浮培养物分散良好, 细胞团较小。2）均一性好, 细胞形状和细胞大小大致相同以及培养基清澈透亮。3）细胞生长快速, 悬浮细胞生长量通常为2~3天, 甚至更短时间便能够增加一倍】
10.简述原生质体分离纯化方法。
分离1）机械法缺点①得到原生质体有限②只限于能够广泛发生质壁分离组织③不能从成熟和分生细胞分离原生质体。优点: 得到原生质体完好无损2）酶解法: 用纤维素酶, 果胶酶等降解细胞壁。缺点: 酶会对原生质体产生部分影响。优点①能够轻易地大量地得到原生质体②条件温和, 完整性好, 有活力。③几乎能够从任何组织分离出原生质体 纯化方法①沉降—漂浮法: 滤出液置于离心管中低速离心, 原生质体将沉于管底, 细胞碎屑浮于上清液中。弃上清, 冲洗液冲洗, 离心搜集底部原生质体②漂浮法: 利用比重大于原生质体高渗溶液, 在溶液中漂浮, 用吸管搜集③过滤离心法: 采取40~100um网筛过滤细胞混合液, 除去未消化细胞, 细胞团, 碎屑, 然后在合适溶剂内低速离心, 弃上清, 取底部原生质体④界面法: 是原生质体处于两界面之间, 从而获取一定量得原生质体。

11.细胞融合关键方法有哪些, 各有什么特点。
（1）生物方法（如病毒诱导融正当）优点: 融合率较高, 对多种动物细胞都适宜, 且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖, 轻易培养。缺点: 操作繁琐, 融合率不高, 病毒能对所融合细胞产生影响, 含有危险性（现在较少使用）。（2）化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融正当）优点: 融合成本低, 勿用特殊设备, 融合子产生异核率较高, 融合过程不受物种限制。缺点: 融合过程繁琐, PEG可能对细胞有毒害。（3）物理方法（如电场诱导融正当）优点: 融合率高, 达70%~80%甚至100%, 不存在对细胞毒害问题, 可在显微镜下定向诱导, 可直接挑选杂种细胞, 操作简便。缺点: 需要特殊仪器设备且仪器昂贵。
12.怎样选择融合后杂合细胞【①抗药性筛选法: 利用细胞对药品敏感性差异筛选融合细胞②营养互补筛选法: 细胞在缺乏一个或多个营养成份时不能生长繁殖即属于营养缺点型细胞。利用两亲本细胞营养互补能够筛选融合细胞③物理特征筛选法: 利用细胞在形态、 大小、 颜色上差异能够在倒置显微镜下用微管将融合细胞吸收挑选出来, 也能够用采取离心方法分离融合细胞④荧光标识法:对于形态、 颜色上都不能区分情况, 能够采取不一样荧光染料（比如发光绿色荧光异硫氰酸荧光素和发红色荧光碱性蕊香红荧光素）分别标识两个亲本细胞, 这么融合细胞内存在两种荧光标识, 能够在荧光显微镜下挑选分离或用流式细胞仪分离】
13.人工诱导多倍体植物形成方法【（一）生物学方法①体细胞杂交法:利用染色体加倍个体再与未加倍个体杂交培育出多倍体植物（如, 无子西瓜培育）②胚乳培养法: 胚乳具细胞全能性, 经培养可得到三倍体植株, 但在发育过程中会发生倍性改变（二）化学方法: 利用部分化学物质能够阻止第二极体排出或受精卵有丝分裂而产生三倍体或四倍体①细胞松驰素 B: 抑制肌动蛋白聚合成微丝, 从而抑制细胞质分裂②秋水仙素: 可抑制细胞分裂中纺锤丝形成, 所以能够抑制有丝分裂】
14.简述原代培养和传代培养基础过程【原代培养①取出动物组织, 用尖嘴剪刀将组织剪碎, 用Hanks液冲洗下剪刀上碎片②消化, 加入酶液消化, 可加Hanks液, 目为了稀释酶浓度③离心去除未消化细胞, 碎片④制备细胞悬液, 并计数, 控制生长密度4悬液移入培养瓶⑤接种
传代培养: 1, 吸出瓶内旧培养液。2, 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。3,2~5分钟后检验, 如有细胞间隙变大或者细胞质回缩现象, 停止消化。4, 吸出消化液, 加入Hanks液, 轻轻转动, 避免细胞流失, 吸收残余消化液。假如单用胰蛋白酶, 能够直接加入培养液。5, 用吸管轻轻吹打瓶壁, 使细胞脱落制成悬液, 计数后统计其浓度。6, 从新接种培养。】
15.简述体外受精通常过程【（一）卵母细胞采集和成熟培养①超速排卵技术: 用促性腺激素处理, 促雌性动物排卵, 从输卵管中冲取卵子②直接获取法; 从活体动物卵巢中采集卵母细胞, 在体外经人工培养为成熟卵子（二）精子采集和获能: 精子采集通常采取“上浮分离法”, 精子获能可采取添加诱导精子获能物质, 如Ca2+ 血清蛋白 肝素）（三）体外受精①获能精子和培养成熟卵子, 在受精溶液中完成受精过程②在人工条件下, 将精子注入到成熟卵子中, 完成人工授精（四）受精卵发育与体外培养: 受精卵需在体外培养发育一段时间才能移植至受体子宫】
16.常见多倍体动物培育方法有哪些【物理法: 1)温度休克法: 用略高于或略低于致死温度冷或热休克来诱导三倍体或四倍体方法。包含冷休克法和热休克, 略高于致死低温为冷休克, 温度在0~5℃; 温度略低于致死高温为热休克, 温度在30℃左右。2）水静压法: 采取较高水静压, 抑制卵母细胞第二极体释放或细胞分裂产生多倍体。此方法有诱导率高, 时间短, 对受精卵损害小, 成活率高特点。3）还有机械创伤法, 电离辐射法, 离心法等, 不过损害大, 不宜使用。化学法: 用一些化学药品诱导多倍体（细胞松驰素 B: 抑制肌动蛋白聚合成微丝, 从而抑制细胞质分裂）。生物学法: 关键指远缘杂交, 利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交产下多倍体】
17.胚胎干细胞体外培养关键技术【①特殊培养基和消化液: 用高糖和谷氨酰胺DMEM培养基, 葡萄糖浓度通常在4500mg/L以上, 添加15%胎牛血清添加抑制细胞分化β-巯基乙醇, 消化液使用消化液中胰蛋白酶和EDTA浓度比通常动物细胞高②喂养层细胞: 首先提供物理支持, 其次喂养层含有促进细胞增殖和抑制其分化功效。常见喂养层细胞有STO(小鼠胎儿成纤维细胞) PMEE③条件培养基和细胞因子: 在基础培养基中按一定百分比添加了抑制因子和细胞因子, 如白细胞因子（LIF）可抑制细胞生长和分化】
18.判定胚胎干细胞【①碱性磷酸酶活性高②端粒酶活性高③细胞膜表面有特殊标识④能分化成三个胚层细胞⑤可诱导分化为多种成体干细胞】 19.组织工程三要素【①种子细胞: 包含干细（胚胎干细胞、 成体干细胞）、 组织起源体细胞②支架材料: 指替换细胞外基质生物医学材料, 含有良好生物亲和性、 生物可降解性、 适宜三维立体结构、 支架强度③影响因子: 物理因子关键是应力作用; 生长因子是经过与细胞膜受体结合, 调整细胞生长与其她细胞功效等多效应多肽类物质】
20.举例说明组织工程产品技术路线【①将体内培养细胞接种到受损部位生长进行原位修复②将支架材料与细胞混合, 移植到受损部位, 伴随细胞生长, 支架材料降解而替换或填补受损部位③使用可降解三围多孔材料, 接种培养细胞, 体外再生组织或器官, 移植替换】
21.单克隆抗体制备通常过程【①亲本细胞选择(骨髓瘤细胞: 不分泌抗体, 多用BALB/C小鼠骨髓瘤细胞, 淋巴细胞: 经免疫处理淋巴细胞)②细胞融合（用化学法: PEG结合高Ca2+诱导剂）③筛选a在HAT培养基中筛选杂交细胞（添加喂养层细胞）b后改用HT培养基c载改用完全RPMI 1640培养液④杂交瘤细胞克隆化培养, 方法是有限稀释法（添加喂养层细胞）⑤判定;分2部分a杂交瘤细胞判定: 染色体数目, 既可作为判定客观指标, 又可了解分泌抗体能力）b抗体性状判定: 抗体特异性, 抗体效价⑥大量生产】
一、 怎样看待试管婴儿带来伦理学问题？
（一）体外受精技术,俗称“试管婴儿”, 是从卵巢内取出多个卵子, 在试验室里让它们与男方精子结合, 形成胚胎, 然后转移胚胎到子宫内, 使之在母亲子宫内着床, 妊娠。正常受孕需要精子和卵子在输卵管相遇, 二者结合, 形成受精卵, 然后受精卵再回到子宫腔, 继续妊娠。所以“试管婴儿”能够简单地了解成因为试验室试管替换了输卵管功效而称为“试管婴儿”。
（二）不符合伦理道德(1)把试管婴儿看成人体零配件工厂,是对生命不尊敬(2)早期生命也有活下去权利,抛弃或杀死多出胚胎,无异于”谋杀”(3)有些人会滥用设计试管婴儿技术,而设计婴儿性别。
（三）符合伦理道德(1)设计试管婴儿是为了救人,是救治患者最好,最快捷措施之一(2)提供骨髓中造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤(3)脐带血乃试管婴儿”身外之物”.
（四）中国政府见解 中国卫生部在《体外受精----胚胎移植及其衍生技术规范》中要求,实施体外受精----胚胎移植及其衍生技术必需取得卫生部同意书。
二、 怎样看待体细胞克隆技术？
（一）体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养, 使其处于休眠状态, 利用细胞核移殖技术将其导入去核卵母细胞, 发育成胚胎后移植至受体, 妊娠产仔, 克隆出成体细胞。
（二）不符合伦理道德: 生殖性克隆是指出于生殖目使用克隆技术在试验室制造人类胚胎, 然后将胚胎置入人类子宫发育成胎儿或婴儿过程 1)克隆技术尚不成熟, 还处于探索阶段, 通常克隆动物夭折率高 2)克隆人严重违反了人类伦理道德3)克隆人冲击了现有婚姻家庭和两性关系等传统伦理道德观念4)克隆人是制造在心理上和社会地位上都不健全人。
（三）符合伦理道德: 诊疗性克隆是指把克隆出来组织或者器官用于诊疗疾病, 这种用于医疗目, 在试验室使用克隆技术制造胚胎过程被称为“诊疗性克隆”。在适宜条件下, 使其发育成为人体任何一个器官, 包含大脑、 肌肉、 血液和神经, 这些器官组织将用于医疗。
（四）中国政府见解: 严禁生殖性克隆人,不反对诊疗性克隆.
三、 怎样正确看待转基因动物？
①基因重组打破了物种间界限, 打搅了自然进化历程, 改变了生态系统结构, 破坏了生态系统稳定性, 这对人类可能是个灾难 ②转基因生物含有新性状, 其适合度和竞争力增加, 可能会造成原来就弱濒危生物愈加快从地球上消失 ③转基因数目增加会对生物多样性, 群落结构形成威胁 ④新性状转基因生物假如大量回归自然界, 有可能会影响到生态系统中能量流动和物质循环 ⑤重组微生物降解产物是否有害 ⑥转基因食品是否会影响人类健康还不确定。

1、 植物脱毒技术方法（热处理, 茎尖培养、 愈伤组织、 微体嫁接离体、 珠心组织培养法、 ）
2、 愈伤组织培养取得无病毒植株原因（A病毒在植株体内不一样器官或同一器官不一样组织中分化不均匀, 那些无病毒组织产生愈伤组织就是取得无病毒组织基础B有些愈伤组织细胞病毒浓度较低, 在愈伤组织快速分裂过程中, 病毒复制能力弱C愈伤组织产生抗性变异细胞） 3、 单细胞制备方法（机械法 酶法（果胶酶） 愈伤组织诱导法）
4、 细胞株保留方法（继代培养保留法、 低温保留法、 冰箱保留）
5、 细胞同时化培养（体积选择法、 冷处理法、 饥饿法、 抑制法（有丝分裂抑制）
6、 细胞悬浮系统（机械搅拌式、 气压搅拌式培养体系、 旋转式培养体系）
7、 原生质体分离方法（机械法（先使细胞壁分离在用刀切）、 酶解法（纤维素酶, 果胶酶）
8、 原生质体纯化方法（①过滤离心法②漂浮法③沉降法和漂浮法结合④界面法）
9原生质体活力测定（染色法荧光素双醋酸盐（FDA）法能发荧光为活性; 酚藏花红染料法含有活性原生质体不着色） 或细胞
10、 细胞融合步骤（①两原生质体相互靠近②质膜融合形成细胞桥③胞质渗透④细胞核融合）
11、 细胞融合方法（生物法仙台病毒、 物理法电融合诱导、 化学法NaNo3诱导融合高ph高浓度Ca2+离子聚乙二醇诱导融合）
12、 多倍体物种判定（核体积测量（细胞核大小与染色体数目成百分比）、 染色体计数法、 DNA含量测定）
13、 贴附型细胞【①成纤维型细胞（细胞大致成梭形或不规则形贴壁后成长梭形, 胞质外伸出2-3长短不一样突起细胞之间排列疏散有较大细胞间隙, 起源于中胚层）②上皮型细胞: 扁平状, 形态较为规则, 贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形, 中央有扁圆形核生长时相互紧密链接成单层细胞, 起源于内胚层和外胚层, 比如皮肤表皮细胞, 消化管③游走型细胞: 含有类似巨噬细胞特征在支持物上分散生长, 通常不连接成片、 形成菌落;细胞质常伸去伪足和突起, 细胞不稳定, 外形不规则且不停改变。这种细胞形态关键是含有吞噬细胞单核巨噬细胞系统细胞。比如: 颗粒性白细胞、 淋巴细胞④多形型细胞: 是部分形态上不规则细胞, 通常分胞体和胞突两部分, 胞突为细长形。胞体呈多角形但没有成纤维细胞那样不规则; 比如 神经元, 神经胶质细胞】
14、 非贴附型细胞（悬浮型）癌细胞
15、 细胞培养条件: ①温度37 ②pH7.2-7.4 ③气体O2 CO2 ④培养基: 天然培养基 合成培养基 无血清培养基 ⑤常见溶液: 平衡盐水（BBS）由生理盐水和葡萄糖制成（维持渗透压, BBS中有酚酞指示剂）PH调整液NaHCO3、 HEPES氢离子缓冲剂 ⑥细胞消化液: 胰蛋白酶溶液——解离分散细胞、 EDTA化学螯合剂, 清除溶液中Ca2+Mg2+、 抗生素溶液预防污染——青霉素, 链霉素 ⑦甘油和二甲基亚砜（DMSO）是细胞冷冻防护剂。作用是结合细胞中水分子, 降温时降低细胞内冰晶分子形成, 避免对细胞造成伤害。
16、 细胞冷冻过程（1取生长状态好细胞消化制成细胞悬液2离心洗涤3加含10%DMSO冷冻液4加入安瓶5熔封670℃放置2-3h7移入液氮罐中8统计）
17、 动物细胞特点（1无细胞壁2动物细胞倍增时间长, 生长缓慢3培养过程需氧量少, 对机械搅拌敏感4以聚集体形式存在5原代细胞通常繁殖50代左右退化死亡） 养）
18、 细胞小规模培养方法（①悬滴培养②罐注小室培养③培养瓶培养④培养板培养⑤转管培
19、 动物细胞大规模培养（①悬浮培养②微载体培养③中空纤维法）
20、 单克隆抗体生产路径（细胞融合 、 病毒转化）
21、 HAT选择培养基三种关键成份（次黄嘌呤H 氨基蝶呤A 胸腺嘧啶核苷T）
22、 DNA合成2条路径（合成路径 糖, 氨基酸——ⅠⅠ——核苷酸——DNA可被A阻断; 补救路径 核苷酸及其前体——Ⅰ—核苷酸——DNA T—TK—dNTP H—HGPPT—HMP）
23单克隆抗体制备（①体内接种法:血清法, 腹水法 ②体外培养法）
24细胞核移植（①直接注射法②透明带下注射法） 25重组胚激活（电激活、 化学激活）
26胚胎冷冻保留（玻璃化冷冻胚胎 、 程序冷冻） 27、 精子冷冻保留【常温保留（15-25）低温保留（0-5）冷冻保留-79 ~-196卵细胞冷冻: 玻璃化冷冻】
28多倍体判定【①染色体计数和核型分析②核仁数目银染测定③细胞核体积测量4DNA含量测定】 29、 转基因方法（电穿孔法、 显微注射法 、 裸露DNA直接注射法、 基因枪介导DNA转移、 胚胎干细胞方法 、 精子载体法、 逆转录病毒感染法）
30、 怎样判定干细胞【①体外分化试验②体内分化试验③嵌合体形成④核移植】