人白介素试剂盒检测方法原理步骤说明书.doc

人IL-10定量分析酶联免疫检测试剂盒
IL-10介绍:
人IL-10 是由160个氨基酸组成4个α螺旋结构细胞因子, 分子量为18.5 kDa。在水溶液中以二聚体形式存在, 分子量约为39 kDa。
人IL-10是个多效性因子, 能够对多个细胞起作用, 关键表现为免疫抑制和免疫刺激两方面作用, 尤其是在调整淋巴系和髓系细胞功效方面饰演关键作用。IL-10 也含有单核细胞/巨噬细胞依靠、 抗原刺激引发PBMNC 和 NK 细胞合成其它细胞因子抑制作用。巨噬细胞膜介导共刺激引发T细胞和NK细胞活化后产物及功效也可被IL-10所抑制。IL-10是单核细胞/巨噬细胞功效强有力调整物。IL-10作为细胞介导免疫反应抑制物, 能够抑制像前列腺素E2、 TNF-α、 IL-1、 IL-10和 IL-8等很多引发炎症细胞因子。IL-10 能够促进可溶性TNF受体释放和ICAM－1和B7在细胞表面表示。IL-10还参与B细胞、 柱状细胞及胸腺细胞增殖和分化调控。
人IL-10与鼠类IL-10在DNA序列和氨基酸序列上高度同源, 其DNA序列中一个开放基因框与艾伯斯坦-巴尔病毒基因组上基因框BCRF1高度同源, 这可能在病毒感染中饰演关键角色原因。在很多与寄生虫感染报道中, IL－10表示也会增加, 如曼森氏血吸虫感染、 利什曼原虫感染、 弓形虫感染、 锥虫感染等。分枝杆菌感染如麻风分枝杆菌、 结核杆菌、  鸟分枝杆菌等感染也会引发IL－10表示升高。
检测原理:
本试剂盒采取双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-10 浓度。IL-10 捕捉抗体已预包被于酶标板上, 当加入标本或参考品时, 其中IL-10 会与捕捉抗体结合, 其它游离成份经过洗涤过程被除去。当加入生物素化抗人IL-10 抗体后, 抗人IL-10 抗体与IL-10 接合, 形成夹心免疫复合物, 其它游离成份经过洗涤过程被除去。随即加入辣根过氧化物酶标识亲合素。生物素与亲合素特异性结合, 亲合素连接酶就会与夹心免疫复合物连接起来; 其它游离成份经过洗涤过程被除去。最终加入显色剂, 若样本中存在IL-10 将会形成免疫复合物, 辣根过氧化物酶会催化无色显色剂氧化成蓝色物质, 在加入中止液后呈黄色。经过酶标仪检测, 读其450nm处OD值, IL-10 浓度与OD450值之间呈正比, 经过参考品绘制标准曲线, 对照未知样本中OD值, 即可算出标本中IL-10 浓度。

人定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分
规格（96T/48T）
人IL-10预包被板
12条 / 6条
样本分析缓冲液
5ml/3 ml
标准品稀释液
10ml/5ml
人IL-10标准品
4支/2支(冻干)
人IL-10生物素化抗体
10ml/5ml
亲和素连接HRP酶
10ml/5ml
浓缩洗涤液 20×
30ml/15ml
TMB底物
10ml/5 ml
中止液
5ml/3 ml
封板胶纸
3/2张
说明书
1份

标本搜集:
1.标本搜集请按下列步骤进行操作:
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;
B.血清标本应是自然凝固后, 取上清, 避免在冰箱中凝固血液;
C.血浆标本, 推荐用EDTA方法搜集;
D. 若待测样本不能立刻检测, 标本搜集后请分装, 冻存于－20℃, 避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;
3.标本应清澈透明, 检测前样本中如有悬浮物应经过离心去除;
4.请勿使用溶血, 高血脂或污染标本检测, 不然结果将不正确。
注: 正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:
1.试剂盒请保留在2～8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶, 请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后, 剩下部分请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时, 请立刻更换枪头, 避免交叉污染。
6.严禁混用不一样批号试剂盒组份。
7.充足混匀对确保反应结果准性很关键, 在加液后请轻轻叩击边缘以确保混匀。
8.室温反应, 请严格控制在25～28℃。
9.洗涤过程是至关关键, 洗涤不充足会使正确度下降并造成结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时提议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡产生。
12.血清和血浆标本检测时, 检测抗体孵育时间应合适延长。

检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟; 每次检测后剩下试剂请立刻于2～8℃保留。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.标准品:加入标准品稀释液0.25ml至冻干标准品瓶中使IL-10终浓度达成pg/ml, 室温反应, 请严格控制在25～28℃。静置15分钟后轻轻混悬待根本溶解, 用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点, 最高浓度为 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板: 每孔洗涤液为300ul, 注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最终一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
试验过程需自备材料:
1. 不一样规格加样枪及对应枪头; 2.酶标仪;
3．自动洗板机; 4．去离子水或双蒸水;

操作步骤:
1.经过计算并确定一次性试验所需板条数, 取出所需板条放置在框架内, 临时用不到板条请放回铝箔袋密封, 保留于4℃。
2.提议设置本底较正孔, 即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次试验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不一样浓度标准品(100ul/孔)加入对应孔中, 用封板胶纸封住反应孔, 室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本, 请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本, 如稀释量大, 请将样本与样本分析缓冲液等量加入, 不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
4.洗板5次, 且最终一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔, 室温孵育60分钟。
6.洗板5次, 且最终一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔, 避光室温孵育20分钟。
8.洗板5次, 且最终一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔, 避光室温孵育20分钟。
10.加入中止液50ul/孔,混匀后立即测量OD450值。
结果判定:
1.复孔值在20%差异范围内结果才有效, 复孔值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本OD值应减去本底校正孔OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标, OD值作纵坐标, 以平滑线连接各标准品坐标点。经过标本OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限, 应合适稀释后重测, 计算浓度时应乘以稀释倍数。
经典数值和参考曲线
浓度pg/ml
经典OD值1
经典OD值2
OD平均值
0
0.11
0.1332
0.1216
62.5
0.2468
0.3662
0.3065
125
0.3104
0.4134
0.3619
250
0.4748
0.611
0.5429
500
0.9045
1.0647
0.9846
1000
1.4787
1.5241
1.5014

2.0334
2.2461
2.13975

人IL-10参考标准曲线

注意: 本图仅供参考, 应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。
灵敏度, 特异性和反复性:
1.灵敏度: 数次反复结果表明, 最小检出量为8.8pg/ml。
2.特异性: 与人IL-10 sRα,IL-10 Rβ,IL-22,IL-24小鼠IL-10和猫IL-10等没有交叉反应。
3.反复性: 板内, 板间变异系数均<10%.
参考文件:
J Surg Res. Aug;99(2):187-93.
Am J Gastroenterol. Jul;96(7):2098-102.
J Immunol. Aug 1;167(3):1535-41.
Immunol Invest. May;30(2):143-56.