BrukerInVivoXtreme小动物活体成像系统标准操作规程.doc

Bruker In-Vivo Xtreme小动物活体成像系统标准操作规程

【目】经过制订本操作规程, 规范小动物活体成像系统使用。
【准备】
1、 试验试剂（药品、 染料、 麻醉剂、 水、 脱毛膏等）;
2、 试验对象（小鼠、 大鼠、 黑鼠、 裸鼠等）;
3、 如需要气体麻醉则要进行氧气准备, 将麻醉剂倒入麻醉机中, 并检验麻醉机检验窗中液位位于“min”和“Max”之间; 气体麻醉前依据室内温度情况酌情打开动物空气加热器。
【开机】
主机部分:
1、 打开X-Ray光源, 将开关钥匙打到“ON”位置;
2、 打开主机, 将主机右后方电源开关打到“ON”位置。接着打开电脑, 等候网线图标出现一个黄色三角叹号后, 将MI软件打开。
注意: 仪器开机以后, 需要大约20分钟预冷时间。
隶属部分:
1、 如需要进行气体麻醉, 则需要打开麻醉机, 并对试验对象进行预麻醉;
2、 假如需要进行三维旋转拍摄, 则需准备动物旋转系统（MARS）, 动物旋转系统准备需要在不开拍摄软件和MARS控制器按钮打到manual情况下, 先按要求将旋转器安装到暗箱中, 然后将按钮打到auto, 完成以后即可打开MI软件
【拍照】
1、 将试验对象摆放到托盘中, 拍照部位朝下, 如拍摄腹部影像, 需将试验对象腹部朝下, 并将四肢伸展开, 然后将托盘放入暗箱拍摄位置, 放置是托盘缺口朝右侧摆放;
2、 双击桌面MI图标, 打开MI软件, 单击“Capture”按钮, 打开拍摄参数设置界面;
1）: 拍摄界面顶部显示仪器型号。MI软件提供同时拍摄两张图像功效, 即第一张图像是Foreground, 主图像, 第二张图像是Background, 背景图像。点击Foreground和Background按钮进行切换, 对两张图像拍摄程序分别进行编辑。

2）: 左边第一部分File里能够实施和创建、 编辑修改一个Protocol, 同时, Protocol还能够经过点击软件顶部工具栏中Protocol按钮打开。

3）: 第二部分是选择拍摄模式, 共有5种, 分别为Fluorescence荧光, Luminescence化学发光, Radioisotopix同位素, X-Ray X光, Reflectance反射光, 另外能够Custom定制程序。
点击Setting下拉菜单, 能够选择我们已经设定好拍摄程序, 或者选择Default Session默认设置, 和Current Session来新建一个拍摄程序。每个拍摄模式都有一个默认设置, 具体拍摄条件以下（In Vivo Xtreme ENG, 42页）:

右边save保留程序, save as另存为和重命名, Delete删除程序。点击Unlock和Lock键, 能够对锁定程序解锁或为锁定程序设置密码锁定。
在Annotation框中输入文字, 能够对该程序拍摄图片进行至多48个字符注释。
在Accumulation Path栏里选择图像保留路径。

4）: 第三部分是选择或者不选背景图像, Background Image下拉菜单里能够不选背景图像或者选择某个拍摄程序生成背景图像。软件预设了一个标准X光拍摄程序, 一个高分辨率X光拍摄程序和一个反射光拍摄程序, 具体拍摄条件能够在Background中查看。假如我们在Background中编辑保留了自己程序, 在这里也能够选择。

5）: 第四部分中能够查看设备IP地址, 相机序列号和CCD是否已经准备好, 假如方块变成绿色就表示CCD已经降到预设温度, 仪器已经能够正常使用。

6）: 右边第一部分是光源设定, 在光源下拉菜单中, 生物发光和同位素拍摄选择Luminescence, 反射光拍摄选择Reflectance RGB, 荧光和白光拍摄选择Muti-wavelength, X光拍摄选择X-ray。
在Apply Reference File中选择是否应用校正文件, None是不应用校正文件, Auto是当已经设置了适宜校正文件时, 软件自动选择匹配校正文件, 选择Manual后优异行正常图像拍摄, 拍完后移除样品和托盘, 再进行校正文件拍摄。
为了确保图像质量, 通常包含到利用光源试验, 比如荧光, 白光, 反射光和X光成像, 都必需设置适宜校正文件。荧光、 白光和反射光校正文件跟光圈大小、 成像视野、 焦距和激发发射波长相关; X光校正文件跟光圈大小、 成像视野、 焦距和铝膜相关; 当改变拍摄程序中以上参数时, 必需重新拍摄和设置校正文件。以下是校正文件推荐参数设置:

当选择多重曝光时, 应用Fina Accumulation最终只生成一张图片, All Accumulations 每次曝光最终止果都是与之前图片叠加后结果, 保留每次曝光所产生图片, 但在软件中只打开最终一张。All Image是指保留每次叠加图片以及单张图片。Separate Images是指只保留单次曝光结果图片。

7）右边第二部分是选择滤光片, 当进行X光拍摄时, 能够选择不一样厚度铝膜, 铝膜越厚, 过滤掉低能量X射线就越多, 骨骼和肌肉软组织对比度越高, 图像越清楚。所以大鼠X光成像, 对骨骼清楚度要求高图像, 或者需要进行骨密度分析图像, 提议选择0.8mm厚度铝膜。
这里能够选择X光机能量, 有20、 25、 30、 35、 40、 45几档可选, 高清楚度X光成像需要高能量, 通常大鼠或小鼠全身骨骼成像选择45KVP.
在荧光拍摄时需要选择激发和发射滤光片, 荧光成像中依据荧光物质特征来选择对应滤光片, 需要注意是激发和发射滤光片之间波长间隔必需最少在50nm以上, 不然会带来强烈背景干扰。白光、 反射光、 生物发光、 同位素和X光成像, 滤光片都选择0和0。

8）: 右边第三部分是相机设置。包含Exposure Type曝光方法, 这里可选Standard标准曝光, Time Lapse间隔曝光和做校正文件时应用Illumination Reference曝光模式。
曝光时间能够以秒和分钟为单位任意选择, X光最小曝光时间是1.2秒, 其它拍摄模式曝光时间最小是0.1秒（Xtreme FI是0.2秒）, 最长是10分钟。
曝光次数最大可选择32次, 但过多曝光次数是不适宜, 可调整。当在曝光方法中选择Time Lapse时, 这里能够选择拍摄间隔和在多长时间或者几帧以后拍摄停止。
Mode（选择CCD在采集图像时读取速度）里有High Speed和High Sensitivity两个选项, 提议荧光、 反射光和X光选择High Speed, 化学发光和同位素选择High Sensitivity。
Predict Exposure Time是估计曝光按钮, 用此按钮能够估量生物发光和同位素曝光时间。选中以后弹出对话框, 输入曝光所需灰度级, 点击计算按钮, Xtreme会自动计算所需要最好曝光时间。
Binning是指像素合并, Xtreme BI最高到32x32, Xtreme FI最高到64x64, 像素合并是指将CCD相邻多个像素合并成一个像素在图像中展现, 提升CCD拍摄灵敏度和响应速度。当拍摄弱信号比如化学发光或者同位素时, 可能需要用到4x4以上像素合并。
Instant DCR是指CCD即时暗电荷修正设置, 对大多数图像来说, 0.5-1之间值比较适宜。
当用到小样品台进行小视野X光成像时, 必需勾上Mag Stage这个选项, 小样品台提供放大倍数为3.3倍X光成像, 尤其适合拍摄爪子、 关节、 头颅等部位。
FOV中调整成像面积, Xtreme BI分别有7.2x7.2cm, 10x10cm, 12x12cm, 15x15cm, 18x18cm和19x19cm6个成像视野可选择。
fStop是选择光圈大小, 光圈数值越小通光量越大, 成像信号强度越高。
Focal Plane是选择成像焦距, 荧光、 白光和反射光等全部在托盘上成像选择Tray, X光和同位素等在磷屏上成像选择X-Ray。

9）: 右边最下方能够切换拍摄界面Standard和Advanced模式。
Preferences按钮可对仪器硬件进行设置和调试。
点击Preview进入预览界面, 预览界面中能够调整拍摄时间和焦距, 打开反射和白光光源等。
点击Capture按钮直接进行拍摄。

3、 新建不一样模式拍摄程序
1）: 以新建一个荧光拍摄程序为例, 首先在Modality中选择Fluorescence, Setting中选择Current Sesion, Apply Refernce File中选择None, 然后设置适宜激发和发射滤光片, 这里以绿色荧光蛋白GFP激发和发射光480,535为例, Exposure Type选择Standard, 曝光时间、 Bin、 FOV、 fStop和Focal Plane依据需要选择, 下面是不一样拍摄模式推荐拍摄程序:

选好以后点击Save as为程序命名并保留程序。因为荧光、 白光、 反射光和X光需要做背景校正, 所以接下来我们做一个背景校正文件, 在Exposure Type中选择Illumination Reference, 把动物仓中样品和样品托盘取出, 正确放置EPI屏（做X光背景校正文件需正确安装X光磷屏, 做反射光校正文件需放置Backdrop屏）, 关闭仓门点击Capture按钮, 软件进行校正文件拍摄。拍完以后校正文件自动在MI软件中打开, 此时将拍摄模式改回Standard, 校正文件应用中选择Auto, 点击Save保留程序, 这么一个完整荧光拍摄程序就建好了。
2）: 设置Background
在拍摄界面上方点击Background按钮切换到背景图像编辑界面。与Foreground设置相同, Background也能够选择荧光、 生物发光、 同位素、 X光和反射光拍摄模式, 具体程序设置请参考Foreground设置, 需要注意是, 软件设置了2个X光和一个反射光默认程序供用户选择, 用户可依据具体需求设置。当一个设置了Background程序点击Capture拍摄时, 软件会要求提供保留路径, 拍完以后两张图像直接存放且在MI软件中打开, Background叠加Foreground后显示, Foreground图像除了以拍摄日期、 时间、 拍摄模式、 激发和发射滤光片标准方法命名外, 后缀还会加上Frgrnd字样, 而Background图像后缀会加上Bckgrnd字样。大家能够看到这种图片文件名最终还带有一个星号, 这表示经过调整以后图像还未被保留, 将图像保留后, 星号消失。

【图像调整】
1、 MI软件介绍
双击桌面图标Bruker MI SE打开MI软件, 最上方菜单栏中有File、 Edit、 Mode、 Shou、 Window和Help多个选项。File能够打开, 搜索, 关闭, 保留和输出图像、 数据等。Help中能够找到各个软件和硬件说明书。
Navigation里工具能够对图像进行编辑, 打开Image Display菜单栏对图像进行调整, Protocol按钮用于打开Protocol。Multiplex打开以后, 能够对最多4色图像, 或者4个不一样模式成像图像进行叠加。Intansity Scale用于打开或收起Scale。
2、 图像打开与编辑
打开一张图像, 点击Image Display按钮, 按加号打开功效菜单, 对图像进行编辑。

【图像保留】
1、 单击左侧菜单栏“file”——“save”/“save as”进行保留, 保留为MI软件默认格式*.bip;
2、 图像导出: 单击菜单栏“file”——“export data”——“Image…”导出图像为对应格式, 如*.BMP, *.JPG等。
【关机】
标准上小动物活体成像不提议关机, 只需要在不使用时将仪器计算机关闭即可, 仪器自动进入待机状态; 若连续2个月以上不进行试验, 则依据情况关机, 关机次序和开机次序相反。