冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程.doc

冰冻切片免疫荧光染色步骤(表面分子, 以CD4为例)
（1） 冰冻切片室温晾干15分钟;
（2） 用组化油笔将待染组织圈好, 置PBS中浸泡10分钟, 以去除OCT;
（3） 用含10％正常山羊血清PBS室温封闭切片1 小时（此步能够不洗涤, 把封闭液吸干即可）;
（4） 加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA), 4℃孵育过夜;
（5） PBS洗3次, 每次10分钟;
（6） 加入罗丹明标识羊抗小鼠IgG二抗(1:50; Sigma 企业), 37℃孵育1小时;
（7） PBS洗3次, 每次15分钟;
（8） 封片后, 荧光显微镜观察结果并拍照;
（9） 在每切片中选择5个视野计数阳性细胞数。
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注意事项: （1）整个试验过程中勿使表面干燥
（2）稀释、 加二抗（荧光抗体）及以后洗涤过程中注意避光

附注1: 如目分子为胞内分子, 多种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2: 所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）:
（1） pH7.4 0.01MPBS:
配 方 为: 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g
0. 1MPBS 配 方 为: Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定 容 至ml, 高 压, pH7.2-7.4
（2）洗涤液: 0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS, 分装15ml/支－20℃保留
（3）封闭液: 10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS, 分装1.2ml/支－20℃保留
（4）抗体稀释液: 1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS, 分装1ml/支－20℃保留

一、 操作方法及步骤:
①取材, 未能固定组织取材, 不能太大太厚, 厚者冰冻费时, 大者难以切完整, 最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器, 放平摆好组织, 周围滴上包埋剂, 速放于冷冻台上, 冰冻。小组织应先取一支承器, 滴上包埋剂让其冷冻, 形成一个小台后, 再放上细小组织, 滴上包埋剂。
③将冷冻好组织块, 夹紧于切片机持承器上, 开启粗进退键, 转动旋钮, 将组织修平。
④调好欲切厚度, 依据不一样组织而定, 标准上是细胞密集薄切, 纤维多细胞稀可稍为厚切, 通常在5～10um间。

二、 冰冻切片时注意事项:
①防卷板及切片刀和持刀架上板块应保持洁净, 需常常见毛笔挑除切片残余和用柔软纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片经过和附贴地方, 假如有残余包埋剂粘于刀或板上, 将会破坏甚至撕裂切片, 便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时, 可各自放于不一样支承器上, 于冷冻台上冻起来, 然后依据不一样编号, 依序切片, 这么做既不费时也不会乱。
③放置组织冰冻前, 应视组织形状及走势来放置, 所谓“砍柴看柴势”, 切片也是如此, 假如胡乱放置, 就不能收到很好效果。
④组织块不须经多种固定液固定, 尤其是含水固定液, 在未达成固定前, 更不能使用(? ? 不用固定吗？--weibin )。临床快速冰冻切片, 不须要预先固定, 一是为了争取时间, 二是固定了组织, 反而增加了切片难度。假如使用未完全固定组织做冰冻切片, 就会出现冰晶。这是因为含水固定液在组织未经固定前, 其中水份也可渗透到组织中去, 当冰冻发生时, 这些水份就存留于组织中, 形成了冰晶。
⑤当切片时, 假如发觉冰冻过分时, 可将冰冻组织连同支承器取出来, 在室温停留片刻, 再行切片, 或者用口中哈气, 或者用大拇指按压组织块, 以此来软化组织, 再行切片。另者, 调高冰冻点。
⑥用于附贴切片载玻片, 不能存放于冷冻处, 于室温存放即可。因为当附贴切片时, 从室温中取出载玻片与冷冻箱中切片有一个温度差, 当温度较高载玻片附贴上温度较低切片时, 因为两种物质间温度差异, 当它们碰撞在一起时, 分子相互间发生转移而产生了一个吸附力, 使切片与载玻片牢靠地附贴在一起。假如使用冷藏载玻片来附贴切片, 因为温度相同, 没有发生上述现象。

三、 冰冻切片快速染色方法:
① 切片固定30秒－1分钟。
② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。
④ 分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦ 脱水, 透明, 中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟, 切片1分钟, 固定1分钟, 染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程, 结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片方法还有很多个, 如甲醇循环半导体冰冻切片法, 二氧化碳冰冻切片法, 半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等, 这些方法在现在来说已极少使用.
常规方法:
（1）冰冻切片固定                     10～30 s
（2）稍水洗                            1～2 s
（3）苏木精液染色（60℃）              30～60 s
（4）流水洗去苏木精液                  5～10 s
（5）1%盐酸乙醇                        1～3 s
（6）稍水洗                            1～2 s
（7）促蓝液返蓝                        5～10 s
（8）流水冲洗                         15～30 s
（9）0.5%曙红液染色                   30～60 s
（10）蒸馏水稍洗                        1～2 s
（11）80%乙醇                          1～2 s
（12）95%乙醇                          1～2 s
（13）无水乙醇                          1～2 s
（14）石炭酸二甲苯                      2～3 s
（15）二甲苯（Ⅰ）                      2～3 s
（16）二甲苯（Ⅱ）                      2～3 s
（17）中性树胶封固。