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硕士《代谢控制发酵》试题及答案

1．为何说进行代谢控制分析能够揭示细胞代谢动态改变规律？(15%)
答: 代谢控制分析以生化反应体系敏感性分析为基础, 研究分析代谢控制在各路径之间分配规律, 是一个以系统见解对细胞内代谢调控进行定量分析理论和试验方法。代谢控制分析以系统见解对细胞内代谢调控进行定量分析, 认为代谢控制是细胞内代谢系统属性, 能够用酶动力学性质进行定量表示, 代谢路径中酶促反应步骤对代谢控制作用随系统内外条件改变而改变, 用理论计算或试验确定控制系数能够加深对代谢控制结构特征了解。代谢控制分析基础研究对象是由单步反应组成复杂代谢网络, 其中单步反应步骤是组成系统基础结构单元。因为代谢系统中全部反应步骤都直接或者间接地对代谢流和代谢物浓度产生影响。所以, 对其中任一反应施加轻微扰动, 由此产生代谢流或代谢物浓度改变, 能够作为该反应步骤对代谢系统控制度量。代谢控制分析从系统论角度考察代谢现象, 把每个酶促反应作为代谢系统最基础组成部分, 同时将基因表示、 酶活水平、 代谢物浓度、 抑制机制、 效应物、 抑制剂、 激活剂以及环境条件等影响归结为对反应扰动, 再依据代谢系统结构特点进行系统综合分析。它一个关键特点就是结合具体酶反应动力学性质来分析说明代谢网络特征, 如利用与代谢网络中某一步反应含有相同参数酶促反应速度方程求导取得弹性系数, 或者经过体内试验测定弹性系数; 依据连通原理确定代谢网络中控制系数, 从而研究复杂代谢网络动态改变规律。同时, 利用代谢控制分析连通原理还能深入推广用来描述代谢物扰动经过代谢网络传输机理。所以, 进行代谢控制分析能够揭示细胞代谢动态改变规律。
2．要系统研究代谢流及其控制机制, 必需包含哪些基础步骤？(10%)
答: 系统研究代谢流及其控制机制, 包含以下多个基础步骤:
（1）建立一个能尽可能多观察代谢网络并测定其流量方法。为了做到这一点, 通常从测定细胞外代谢产物浓度入手进行简单物料平衡。因为一个代谢路径代谢流并不等于该路径中一个或多个酶活性, 所以酶法分析并不能提供代谢网络真正代谢流信息, 除非对应酶在体外分析条件下存在并含有活性。所以, 在代谢分析中, 酶法分析常会错误地显示相同数量级代谢流, 从而造成产生不正确结论。
（2）在代谢网络中施加一个已知扰动, 以确定在系统松散以后达成新稳态时代谢流。常见扰动方法包含开启子诱导、 底物流加、 特定碳源消除或物理原因改变等。一个扰动往往能提供多个节点上相关信息, 这对于正确描述代谢网络控制结构所必需最小试验量是至关关键。
（3）系统分析代谢流扰动结果。假如某个代谢流扰动对其下游代谢流并未能造成可观察影响, 那么就能够认为该处节点对上游扰动是刚性, 相反则成为柔性。通常地, 在刚性节点处, 不能经过改变上游酶活性来影响其下游代谢流。
（4）除了上述对代谢路径物质流和能量流进行分析外, 代谢工程还包含信息流分析, 如信号转导路径等。
3. 在酿酒酵母培养过程中葡萄糖-6-磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸和1, 6-二磷酸果糖节点被认为是关键节点。在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+, 得到以下结果（图）; 在培养液中添加EDTA和NH+4, 得到以下结果（图）。试判定葡萄糖-6-磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸和1, 6-二磷酸果糖节点刚柔性(15%)。
答: 经过在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+, 以改变对应代谢流量, 能够判定葡萄糖-6-磷酸节点性质。因为葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖磷酸异构化生结果糖-6-磷酸反应是一个经典可逆反应, 所以在稳定态时, 葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸流量靠近平衡, 这么就可将葡萄糖-6-磷酸替换果糖-6-磷酸, 看做为合成1, 6-二磷酸果糖底物。由添加Mg2+前后相关路径代谢流分配情况能够看出, 添加Mg2+能在很大程度上提升代谢路径中各个酶活性, 并使整个代谢流量提升了1倍多。然而, 分配进入1, 6-二磷酸果糖节点处流量比率却基础不变, 而胞外1, 6-二磷酸果糖流量比率也只从7.3增加到16.1, 不到产物理论得率最高时流量1/3。以上情况说明, Mg2 +添加后对1, 6-二磷酸果糖代谢路径流量分配并没有发生重大改变。其次, 从无机磷平衡角度分析, 整个代谢过程中还存在大量高能磷酸化合物, 它们阻碍ATP合成。结果表明, 葡萄糖-6-磷酸并不是限制性底物, 而ATP则可能是限速步骤因子, 也就是说, 葡萄糖-6-磷酸所处节点是非刚性。

Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢通量影响
在发酵液中添加EDTA, 减缓1, 6-二磷酸果糖分解速率和葡萄糖摄取利用速率, 可知1, 6-二磷酸果糖与ATP合成是否一致; 在发酵液中添加NH+4, 以解除ATP等物质对磷酸果糖激酶抑制作用, 经过增加1, 6-二磷酸果糖量, 从而刺激磷酸解酮酶活性, 增加ATP合成。故经过该试验能够验证1, 6-二磷酸果糖节点刚性行为。上述两种情况下代谢流量分配结果表明, 添加EDTA与添加Mg2+相比, 代谢路径整体物质流量下降了近30%, 但1, 6-二磷酸果糖节点处流量分配基础没有发生改变; 添加NH4Cl后代谢流量增加了近30%, 然而1, 6-二磷酸果糖节点处流量分配也基础没有改变。故能够判定1, 6-二磷酸果糖所处节点也不是刚性。

酿酒酵母糖酵解代谢路径中1, 6-二磷酸果糖节点柔刚性判定
在前面两组试验中, 代谢流量改变情形与含有刚性节点依靠型网络应答相一致, 这说明在1, 6-二磷酸果糖代谢路径中最少有一个刚性节点。既然葡萄糖-6-磷酸和1, 6-二磷酸果糖所处节点都不是刚性, 所以可推断磷酸烯醇式丙酮酸节点是惟一刚性节点。实际上, 磷酸烯醇式丙酮酸在网络中独特地位也决定了其节点性质, 它被丙酮酸激酶催化生成丙酮酸和ATP, 以后者首先是丙酮酸激酶抑制剂, 起到抑制磷酸烯醇式丙酮酸分解作用, 其次又是果糖-6-磷酸转化为1, 6-二磷酸果糖底物, 在一定浓度范围内能激活磷酸果糖激酶。从依靠型网络刚性特征来看, 也能够得出上述结论。
4. 试述代谢设计实施策略(20%)。
答: 代谢设计战略思想关键包含以下几方面。
一、 在现存路径中改变目产物代谢流
在现存路径中改变目产物代谢流能够增加目产物积累, 通常来讲, 在处于正常生理状态下细胞内, 对于某一特定代谢产物生物合成路径而言, 其代谢流改变规律是恒定。要增加目产物积累, 能够从以下多个方面入手:
（1）增加代谢路径中限速酶编码基因拷贝数
将编码限速酶基因经过基因扩增, 增加拷贝数, 在宿主中表示以实现目产物产率上升。首先, 必需确定代谢路径中限速反应及其关键酶。然后, 将编码限速酶基因经过酶切等手段, 制得特定片段, 连接在高拷贝数载体上, 再导入宿主中去表示, 进而造成最终产物产量增加。
（2）强化以开启子为主关键基因表示系统
经过强化以开启子为主关键基因表示系统, 能够实现目产物产率提升。在此情况下, 重组质粒在受体细胞中拷贝数并未增加, 强开启子只是高效率地促进结构基因转录, 以合成更多mRNA, 并翻译出更多关键酶分子。
（3）提升目标路径激活因子合成速率
激活因子是生物体内基因表示开关, 它存在和参与往往能触发相关基因正常转录, 所以, 经过代谢工程方法提升目标路径激活因子合成速率, 从理论上讲能促进目标路径关键酶基因表示。
（4）灭活目标路径抑制因子编码基因
灭活目标路径抑制因子编码基因目, 就是去除代谢路径中含有反馈抑制或反馈阻遏作用一些因子或者这些因子作用DNA靶位点（如操纵子）, 从而解除其对代谢路径反馈抑制或反馈阻遏作用, 从而提升目标代谢流。
（5）阻断与目标路径相竞争代谢路径
细胞内各相关路径偶联是代谢网络存在形式, 任何目标路径肯定会与多个相关路径共享同一个底物分子和能量形式。所以, 在不影响细胞基础状态前提下, 经过阻断或者降低竞争路径代谢流, 使更多底物和能量进入目标路径, 无疑对目标产物提升非常有益。
（6）改变分支代谢路径流向
提升代谢分支点某一分支代谢路径酶活力, 使其在与另外分支代谢路径竞争中占据优势, 就能够提升目代谢产物产量。赖氨酸工程菌构建是改变分支代谢路径流向一个经典例子。经过克隆二氢吡啶-2, 6-二羧酸合成酶基因, 所得工程菌能够积累大量赖氨酸。相反, 假如将编码高丝氨酸脱氢酶（HD）基因连接在多拷贝载体质粒上并克隆, 使该基因进行扩增, 则代谢流将显著转到合成蛋氨酸和苏氨酸支路上。
（7）构建代谢旁路
为实现大肠杆菌工程菌株高密度培养, 必需阻断或降低对细胞生长有抑制作用有毒物质产生。应用代谢工程方法, 将枯草杆菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中, 构建新代谢支路, 结果可显著改变细胞糖代谢流, 使乙酸处于较低水平, 从而达成高密度培养目。
（8）改变能量代谢路径
改变能量代谢路径或电子传输系统也能够有效改变代谢流。比如, 将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中, 不仅在限氧条件下能够提升宿主细胞生长速率, 而且也能够促进蛋白质和抗生素合成, 这里表示血红蛋白并不是直接作用于生物合成路径, 而是在限氧条件下提升了ATP产生效率。
二、 在现存路径中改变物流性质
在天然存在代谢路径中改变物流性质, 关键是指使用原有路径更换初始底物或中间产物, 以达成取得新产物目。经过以下两种方法能够改变路径物流性质。
（1）利用酶对前体库分子结构宽容性
利用一些代谢路径中酶对底物相对专一性, 投入非理想型初始底物（如己糖及其衍生物）参与代谢转化反应, 进而合成细胞原本不存在化合物。
（2）经过基因修饰酶分子以扩展其底物识别范围
在酶对底物专一性较强情况下, 能够经过蛋白质工程技术修饰酶分子结构域或功效域, 以扩大酶对底物识别范围和催化范围。在基因水平上经过修饰酶分子结构, 可拓展其对底物专一性, 甚至改变酶催化部位。
三、 在现存路径基础上扩展代谢路径
（1）在宿主菌中克隆、 表示特定外源基因能够延伸代谢路径, 从而生产新代谢产物, 提升产率。应用代谢工程技术合成维生素C前体2-酮基古龙酸（2-KLG）是扩展代谢路径一个实例。
（2）导入外源基因, 经过扩展代谢路径还可使宿主菌能够利用本身酶或酶系消耗原来所不能消耗底物。
四、 利用已经有路径转移或构建新代谢路径
在明确了已经有生物合成路径、 相关基因以及各步反应分子机制后, 经过相同路径比较, 便能够利用多基因间协同作用来构建新代谢路径。
（1）转移多步路径以构建杂合代谢网络
克隆异于本身次级代谢产物基因可生产含有新结构代谢产物。将编码某一完整生物合成路径基因转移到受体细胞中, 能够提供含有很大经济价值生产菌种。它们或者能够提升目产物产率, 或者许可使用相对廉价原材料。比如在高产辅酶Q10基因工程菌构建中, 能够利用多个相同路径细微差异, 人工设计出理想新代谢旁路。
（2）修补完善细胞内部分支路径以合成新产物
自然界中存在遗传和代谢多样性提供了一个含有广泛底物吸收谱和产物合成谱生物群集合, 借助于少数多个精心选择异源基因拼接, 能够将天然代谢物转化为更为优良最新型产物。
5. 已知谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸生物合成路径和代谢调整机制以下图所表示。试述苯丙氨酸工程菌株代谢设计策略(25%)。
答: 苯丙氨酸属于芳香族氨基酸, 在生物体内存在严格调控机制。谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸生物合成路径和代谢调整机制如图所表示。在谷氨酸棒杆菌中, 葡萄糖经EMP路径和HMP路径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(EP), 二者在DAHP合成酶(DS)催化下生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP经三步酶促反应生成莽草酸, 莽草酸经三步酶促反应生成份支酸。由分支酸产生两个分支: 首先, 在邻氨基苯甲酸合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸, 邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT)、 色氨酸合成酶(TS)催化下合成色氨酸; 其次, 分支酸在分支酸变位酶(CM)催化下生成预苯酸(PPA)。由预苯酸又产生两个分支: 在预苯酸脱氢酶(PD)作用下生成对羟基苯丙酮酸, 再生成酪氨酸; 在预苯酸脱水酶(PT)作用下生成苯丙酮酸, 最终合成苯丙氨酸。在分支酸处, 倾向于优先合成邻氨基苯甲酸; 在预苯酸处, 倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸。
苯丙氨酸工程菌株代谢设计策略以下:
（1）加速限速反应
苯丙氨酸是由糖代谢中间产物4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸经过一系列反应合成, 大部分路径与Tyr和Trp合成路径一致。苯丙氨酸合成在很多关键点上受到调控,调控路径多个多样, 第一步被三个同功酶催化,这三种酶分别经过转录路径被产物所调控,酶活性也受到产物反馈抑制。这三个酶分别由aroF、 aroG、 aroH基因所编码,分别受Tyr、 phe和Trp调控; 合成苯丙氨酸第二、 第三个关键酶是由pheA基因编码CM/PD酶,它在酶生成水平和酶活力上受到产物调控。可经过关键酶基因克隆表示和去除产物苯丙氨酸反馈抑制双重手段来加速限速反应。
1）关键酶基因克隆与表示
在大肠杆菌和棒状杆菌中, 关键酶有以下多个: 苯丙氨酸氨解酶、 DAHP合成酶、 分支酸变位酶、 预苯酸脱水酶、 氨基转移酶。1985年,Ozaki等把一株抗苯丙氨酸类似物生产菌株谷氨酸棒状杆菌K38染色体上CM和PD基因克隆进质粒pCE53中,再将重组质粒转回亲株,结果使苯丙氨酸产量达成19g/L, 比亲株提升50%。
2）去除终产物苯丙氨酸反馈抑制
关键酶活力对苯丙氨酸生物合成速率相关键作用, 所以必需去除积累苯丙氨酸对酶反馈抑制。因为与苯丙氨酸生物合成相关很多基因都受到tyrR基因编码阻遏蛋白调控,经过构建多个tyrR突变子,并将它们导入生产菌株,从而造成aroF、 aroG、 aroL和与苯丙氨酸运输和转氨基作用相关基因等不受抑制,而变为组成型表示。pheA基因一样在基因表示水平上受到调控,而且对它调控是多方面。它开启子受到与苯丙氨酸相作用特异性抑制蛋白作用,从而对基因转录进行调控。
苯丙氨酸前导弱化子序列,在RNA转录延伸过程中,依据苯丙氨酸浓度,对转录进行调控。经过基因操作,去除pheA中与调控相关部分,将剩下结构基因与新开启子相连,就可使苯丙氨酸产量大幅度提升。
（2）改变代谢流
代谢前体物积累路径分为共同路径和分支路径,共同路径为分支路径提供前体物质;对共同路径研究集中于代谢过程关键分支点。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是各个酶系竞争对象:丙酮酸激酶(PYK)将PEP转化为丙酮酸,PEP羧化酶、 PEP羧激酶将PEP和CO2转化为草酰乙酸,DAHP合成酶将PEP和4-磷酸赤藓糖合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)。比如用同源重组方法使PYK基因失活,尽可能降低PEP流向丙酮酸生成方向,为DAHP合成提供更多原料, 结果使构建出工程菌株苯丙氨酸产量大幅度提升。
（3）阻断竞争代谢支路
构建自杀型载体,取得Tyr营养缺点突变株。自杀型载体技术能够将其携带基因整合到染色体上,在一定温度(42℃)下,又能够从染色体上切割下来,这种方法应用,为取得营养缺点突变株提供了条件。应用这种营养缺点突变株,可使代谢支路中间体预苯酸不流向Tyr生成方向,以使苯丙氨酸合成有充足原料。
（4）构建DS酶缺点回复突变株, 可增加苯丙氨酸前体物DAHP, 所以也有利于苯丙氨酸生物合成。
（5）加强HMP路径, 有利于PEP和EP生成, 从而增加苯丙氨酸合成前体物, 提升苯丙氨酸产生菌产酸率。
（6）切断深入代谢路径, 经过构建苯丙氨酸酶缺失突变株, 苯丙氨酸脱羧酶缺失突变株, 苯丙氨酸-tRNA合成酶缺失突变株以及不分解利用苯丙氨酸突变株, 能够降低苯丙氨酸消耗, 从而有利于苯丙氨酸积累。
（7）生产过程优化
补料分批培养(fed batch)方法对苯丙氨酸工程菌生长最为有利。在发酵过程中经过不停地加入碳源成份,以保持葡萄糖浓度, 不仅能够提升苯丙氨酸产量,还能够降低下游分离难度。在培养过程中, 经过加入氨水调整pH值, 通入氧气及加强搅拌必不可少。
6. 代谢工程研究过程中必需遵照哪些基础原理？(15%)
答: 代谢工程关键目标是经过定向重组代谢网络, 从而达成改良生物体遗传性状目。所以, 它必需遵照下列基础原理:
（1）必需遵照细胞物质代谢规律及路径组合生物化学原理, 它提供了生物体基础代谢图谱及其生化反应分子机理。
（2）必需遵照细胞代谢流及控制分析化学计量学、 分子反应动力学、 热力学以及控制学原理, 这是代谢路径改造理论依据。
（3）必需遵照路径代谢流推进力酶学原理, 包含酶促反应动力学、 变构抑制效应、 修饰激活效应等。
（4）必需遵照基因操作与控制分子生物学和分子遗传学原理, 它们说明了基因表示基础规律, 同时也提供了基因操作一整套相关技术。
（5）必需遵照细胞生理状态平衡细胞生理学原理, 它为细胞代谢机制提供了一个全景式描述, 所以是一个代谢速率和生理状态表征研究平台。
（6）必需遵照发酵或细胞培养工艺学和工程控制生化工程和化学工程原理, 化学工程是将工程方法利用于生物系统研究最适宜渠道, 这种方法在生物系统研究中融入了综合、 定量、 相关等概念, 所以在代谢工程领域中含有举足轻重意义。
（7）必需遵照相关生物信息搜集分析与应用基因组学、 蛋白质组学原理, 各生物物种基因物理信息与其生物功效信息在此交汇, 并为代谢网络设计提供了更为宽广展示平台。