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固定化技术在医药上研究应用
摘要:综述了固定化技术制作方法及载体选择, 以及固定化技术在医药方而研究与应用, 并对固定化技术应用前景及存在问题进行了评述。
关键词:固定化技术;定点固定化;无载体固定化;医药

固定化技术是从60年代开始快速发展起来一项新技术, 它是经过采取化学或物理手段将游离细胞或酶定位于限定空问区域内, 使其保持活性并可反复利用一个基础技术。七十年代后, 固定化微生物技术直接从固定化酶技术发展而来, 微生物细胞固定化方法多个多样, 任何一个限制细胞自由流动技术, 都能够用来对微生物细胞进行固定化。固定化酶、 固定化微生物细胞、 固定化动植物细胞、 生物传感器以及生物反应器研究快速发展, 形成了一个范围广泛固定化生物催化剂研究领域。固定化技术已广泛应用到食品与发酵工业、 有机合成工业北学分析、 医疗诊疗、 环境净化及能源生产等各个领域, 充足显示其美好前景。
而固定化在生物技术方面最关键应用领域是固定化酶, 因为固定化酶以其特有优点而含有宽广发展前景。它最大特点是既含有生物催化剂, 又含有固相催化剂特征。与天然酶相比, 固定化酶含有以下优点: ①能够在较长时间内数次使用, 而且在大多数情况下, 酶 稳定性提升。如固定化葡萄糖异构酶, 能够在60～65。C条件下来连续使用超出1000h。固定化黄色短杆菌中延胡索酸酶用于生产L-苹果酸, 连续反应一年, 其活力仍保持不变。②反应后, 酶与底物和产物易于分开, 产物中无残留酶, 易于纯化, 产品质量高。③反应条件易于控制, 可实现转化反应连续化和自动控制。④酶利用效率高, 单位酶催化底物量增加, 用酶量降低。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。
1固定化方法
1 1载体选择
固定化技术中使用载体需符合以下条件:固定化过程中不引发活性丧失;对酸、 碱有一定耐受性;有一定机械强度;有一定亲水性及良好稳定性;有一定疏松网状结构, 颗粒均匀;共价结合时含有可活性基团;廉价易得等。现在用于结正当载体关键有:碎石、 卵石、 煤渣、 焦碳、 硅藻土、 多孔砖、 石英砂、 硅胶、 沸石及活性炭等, 它们可分别应用
于不一样处理工艺。用于包埋法材料有聚乙烯醇(PVA) ,聚丙烯酞氨( ACAM) ,聚乙烯乙二醇( PEG ) ,琼脂、 海藻酸钙、 角义菜胶和聚丙稀酸等。值得注意是, 通常载体都要经过活化后才能用于固定化技术, 比如对于纤维素载体通常要引入脂肪族或芳香族氨基、 梭基或硫羟基来活化羟基。
1 2固定化方法选择
固定化方法中研究最多是酶固定化方法, 酶固定化方法可增加酶稳定性。现在关键固定化方法有:
1 2.1载体结正当 载体结正当是结合于不溶性载体上一个固定化方法, 依据结合形式不一样, 可分为物理吸附法、 离了结正当和共价结正当3种。
1 2.2交联法 交联法是用双功效基团或双功效试剂, 使酶与酶或细胞与细胞之问交联固定化方法。这一固定化方法附着牢靠, 不易漏失, 但因为固定化过程中包含化学反应, 所以失活现象较为严重。
1 2.3包埋法 包埋法是将酶或细胞包埋于聚合物中一个固定化方法, 关键有以下儿种类型:网格型、 微囊型和脂质型。包埋法制备方法简单, 条件温和, 通常不包含酶分了化学改变, 所以酶活力回收率高, 不过酶轻易漏失, 催化反应受传质阻力限制, 不易催化大分了底物反应。
1 2.4选择性热变性法 选择性热变性法是将细胞在合适温度下处理使细胞膜蛋白变性, 但不使酶变性而使酶固定于细胞内方法。
1 2.5定点固定化技术 定点固定化技术是借助分了生物学方法, 经过酶蛋白上特定位点与膜载体作用, 在膜表面形成一个高度有序酶分了二维阵列。酶蛋白上作用位点远离催化活性中心, 使底物能充足靠近活性中心。定点固定化方法关键有3种:抗体偶联法、 生物素亲和素亲和法和氨基酸置换法。与固定化方法相比, 定点固定化技术活力和固定量都有显著提升。
1 2.6无载体固定化技术无载体固定化技术取得重大突破是交联酶结晶( CLECs)技术[1], CLECs是一个无需载体、 现有纯蛋白高度特异活性又对有机溶剂含有高度耐受性生物催化剂。荷兰Delft大学Sheldon小组提出一个用盐、 有机溶剂或非离了聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白, 得到酶聚集体, 再用戊二醛交联无载体固定化方法—交联酶聚集体(C LEA s)技术[2]。C LEA s技术是继CLECs以后又一个无载体固定化技术。近儿年, 交联酶聚集体技术已被成功地应用于青霉素酞化酶、 脉酶、 氧化还原酶和7种不一样微生物起源脂肪酶固定化。
1 2.7联合固定化技术 联合固定化技术最初是把外来酶结合于固定化完整细胞上, 以后大家又发展到将两种酶、 两种微生物细胞以及生物催化剂(酶细胞)与底物或其她物质联合固定在一起。联合固定化技术是酶、 细胞固定化技术发展综合产物, 与一般固定化技术相比, 能够充足利用酶和细胞各自特点, 把不一样起源酶和细胞生物催化性质结合到一起。多个酶同时固定在膜材料上, 利用各自功效协同催化复杂生物转化过程是固定化研究一个新方向, 另外, 酶还能够与细胞及其它部分生物分了共固定, 组成更为复杂生物转化体系。
1 2.8藕合固定化技术[6] 藕合固定化是指儿种固定化方法或载体联合使用, 即添加稳定因了和促进因了固定化方法。藕合固定化基础上能够处理单一固定化方法酶活回收率低、 稳定性差转质阻力差等问题, 并含有方法多样、 操作简便、 技术成熟等特点。伴随大家对固定化酶微环境认识和研究深入加深, 藕合固定化技术[3]将逐步成为研究热点。Culla KC[4]等在酶固定化过程中添加了部分抗生素和盐, 它们能和二硫键还原产生硫醇(如B-巯基乙醇,N-乙酰马来酰亚胺)相互作用, 降低硫醇含量达成稳定酶活力目。
2固定化技术在医药方面应用
2 1 抗生素上应用
自20世纪70年代初, 欧美国家已开始用特殊合成树脂固定化青霉素酞化酶来生产6 -APA[5], 但价格昂贵, 酶活还较低。中国相关固定化青霉素酞化酶研究工作起步较晚, 还要靠进口价格昂贵固定化载体或固定化青霉素酞化酶来满足半合成青霉素生产需要。
2 1.1 用于生产β内酞胺类抗生素中问体青霉素酞化酶在偏碱性环境下, 能够催化青霉素G和头抱菌素G水解, 制备生产半合成p内酞胺类抗生素所需中问体:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和7氨基脱乙酞头抱烷酸[7](7 -ADCA )。传统上多采取氧化反应酒旨化及扩环重排等化学反应来合成7- ADCA, 但其过程存在着步骤多、 反应条件要求高、 成本高、 三废污染等问题, 现在已逐步被固定化方法所替换。
2 1.2 用于生产半合成β内酞胺类抗生素固定化青霉素酞化酶在酸性环境中可催化6APA,7AD-以发生酞基化反应制备半合成抗生素, 该方法含有稳定性好、 转化率高、 产品纯度高、 污染少、 成本低等优点, 受到大家重视。
2 2 氨基酸上应用
氨基酸是蛋白质结构基础单位, 对维持机体蛋白质动态平衡有极其关键意义。自然界天然蛋白质中存在20余种基础氨基酸, 皆为L型, 非基础氨基酸多为外消旋体, 然而D型和L型对映体生理作用迥异。氨基酸关键经过发酵法和合成法生产, D-氨基酸通常经过光学拆分得到。D-氨基酰化酶利用其立体专一性反应, 从化学合成底物生产含有光学活性D -氨基酸
蒲广西等研究了利用基因重组工程技术构建高活性氨基酞化酶工程菌连续拆分D, L蛋氨酸[9]。氨基酞化酶工程菌经发酵搜集高活性菌体, 经过海藻酸钠包埋技术制备固定化酶, 连续拆分D,L蛋氨酸, 结果比酶活性大于6 000 u/g湿菌体, 酶柱比酶活性大于4 000 u/g酶, 半衰期20d,可连续拆分24d,拆分率达90%, 收率达74.5%左右。伴随基因工程药品和固定化技术发展, 大家对D氨基酸需求日益增加, 所以筛选含有高活力D氨基酰化酶菌株, 而且建立起简单快捷生产D氨基酸方法有着宽广工业前景。
2 3 酶制剂上应用
脂肪酶不仅能够催化酷水解反应, 而且能在有机溶剂中催化醇和酸酷合成反应酒旨交换反应、 氨解反应驮合成反应等等。陈秀琳研究以cM-纤维素[10]为载体固定化脂肪酶最适制备条件, 固定化酶酶学特征以及操作稳定性, 结果表明本法制备得到固定化酶酶活力较高, 回收率也较高, 最适温度, pH都有了提升, 稳定性也提升了, 酶和载体问结协力较牢靠。现在脂肪酶制造油化学品关键障碍就是脂肪酶价格较高, 而固定化酶含有能够回收、 反复使用、 稳定性高产品质量高等优点, 所以脂肪酶固定化技术能够在药品制备、 食品及轻工等方面广泛应用。
固定化胰蛋白酶[11]( imm ob ilized trypsin,IFP )是人胰岛素固相酶促半合成转化反应中催化剂, 高秀蓉等对其催化特征和稳定性与固定化之前相比进行了研究, 发觉胰蛋白酶经固定化后, 最适作用PH值范围变窄, 最适作用温度和Km值升高, 热稳定性和酸碱稳定性都有所增强。
2 4药品筛选上应用
药品筛选就是对可能作为药品物质进行初步药理活性检测和试验, 以求发觉其药用价值和临床用途, 为发展新药提供最初始依据和资料。传统药品筛选方法是采取药理学方法, 经过体内、 体外多个试验, 评价药用样品药学活性。直到20世纪70年代中期, 动物试验一直是药品筛选关键方法, 但动物试验存在需时长、 劳动强度大、 操作技术要求高、 受试样品需要量大等缺点。现代科技发展为高效率筛选药品提供了技术条件, 高通量药品筛选技术[12](HTS)就是将多个技术方法有机结合而形成一个新技术体系。
在高通量筛选中, 邻位闪烁分析[13](Scintillation-Prox in ityA ssay)因为含有检测灵敏度高, 分析适用性宽和无须对反应物及底物进行繁琐分离等优点已发展为高通量筛选试验室最常见、 最基础分析检测手段之一。基础原理是将靶分了(受体、 酶或相关大分了)固定于含有荧光闪烁剂微球表面, 当发生标识配基与受体亲合时, 标识同位素释放粒了就会激活微球中闪烁剂产生荧光;反之无亲合作用时, 放射性同位素距离闪烁剂较远, 无法激活闪烁剂, 故不产生荧光。从邻位技术基础过程看, 药品筛选包含靶分了固定化和配靶亲合等亚过程, 药品疗效取决于分了本身结构及靶分了构像, 固定化能对靶分了构像造成一定影响, 固定化过程中可能存在靶分了与靶分了、 靶分了与微球、 体相与表面相之问存在相互作用, 所以邻位筛选效果依靠固定化方法。
用于药品筛选膜蛋白微阵列, 因为类脂环境影响膜蛋白功效难以很好发挥, 使微阵列制作有困难。最近微阵列技术取得了突破性进展, 处理了膜和蛋白固定化问题, 发明了一个机械上稳定又许可单个分了在固定化膜内移动系统, 这种水平方向流动性是生物膜特征之一。
伴随国际药品研究形势发展, 开发含有自主知识产权新药已迫在眉睫, 中国天然资源丰富, 应用高效药品筛选方法, 利于从海洋生物、 中药材植物资源中开发出含有自主知识产权新药。
2 5 手性药品上应用
手性药品临床意义已引发了大家注意, 并成为国际开发烧点, 世界正在开发1 200种新药种有三分之一是手性药品, 同时手性药品又是药品开发中难点, 往往是一个对映体含有很大药用价值, 而另一对映体没有药效, 甚至对人体有毒害作用。怎样从对映异构体中分离出有效成份或合成有效成份是现在面临一大课题。青霉素酰化酶[12]对L型氨基酸含有极高选择性, 在固定化青霉素酰化酶作用下, 很轻易使L-苯甘氨酸和D-苯甘氨酰胺合成D-甘氨酰胺-L甘氨酸, 其可深入环化为含有立体构象D, L-3,6-苯哌嗪-2, 5-二酮。3,
6-二苯哌嗪-2, 5-二酮这两个异构体含有较多应用价值, 不仅可用作食品添加剂、 壳聚糖酶抑制剂[13], 还可用作抗病原体和抗过敏药品, D-甘氨酰胺-L-苯甘氨酸本身就是一个低毒性肿瘤和组织消溶剂[14]。所以固定化技术适合于手性药品工业大规模生产。
手性药品相互作用研究也应用了固定化方法。如应用亲合色谱技术时, 能够在色谱柱上固定化HAS[15]或AGP[16]来研究手性药品发生在分布步骤相互作用, 就是在流动相中添加并用药品来考察并用药品与对映体在分布步骤有没有相互作用。
2 6 中草药上应用
于荣敏等以聚胺酯泡沫为固定化材料, 对固定化银杏细胞培养法[17]生产银杏内酯进行研究。经过用高密度、 小孔径聚胺酷材料P29,将其切成0 5 cmx 0 .5 cm x0. 5 cm小块, 每瓶加0 72 g载体, 加65 m L液体培养基, 接种鲜重200 g /I,考察多种原因对固定化银杏细胞培养影响, 结果可得到高达71%固定化百分比, 载体上细胞密度达成干重22mg/cm3。由此可见以聚胺酷泡沫为固定化材料进行银杏细胞固定化培养含有方法简便、 成本低廉、 细胞固定化百分比高等优点, 含有潜在应用价值。
3 展望
最近光、 辐射等物理技术应用于酶固定化, 大大促进了这一领域发展。光引发聚合常被用于制备固定化酶膜或对膜材料进行改性;辐射技术在固定化酶领域有广泛应用, 能有效提升酶活力, 也用于膜材料制备和改性;等离子体技术处理膜材料, 产生多种能量粒了与载体表面作用, 在表面引入羟基、 氨基、 羧基、 羰基等基团, 达成改变载体表面化学结构目, 继而进行酶固定化。
自1953年酶固定化方法首次提出以来, 大家不停探索新固定化方法, 以期提升酶在各方面稳定性。从吸附、 包埋、 共价偶联到交联法, 从载体固定到无载体固定, 固定化技术不停发展。现在寻求愈加好固定化材料和固定化方法仍是各国科研人员正在进行课题, 固定化后回收率高、 多批次使用损失小掖固分离良好是我们需要考虑指标。
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