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红曲霉发酵生产Monacolin K工程技术研究进展
摘 要: 红曲药用价值和保健功效日益引人关注, 其中洛伐她汀作为红曲关键调脂因子成为科研热点和红曲产业发展关键。概述红曲洛伐她汀发觉、 用途、 生产方法、 提纯、 检测方法、 毒性物责问题以及生产现实状况进行综述。
关键词:红曲霉、 洛伐她汀、 检测、 提取、 桔霉素
1. 序言
1.1 Monacolin K发觉及结构式
Monacolin K是现在很好降低人体血液中胆固醇药剂,含有降胆醇、 降血脂作用,又叫洛伐她汀(lovastatin) ,存在于红曲霉及其它真菌如Pleurotus, Phoma, penicillium中。生产所使用菌种关键有两类:红曲霉和土曲霉,东方国家如日本及中国多采取红曲霉,欧美等国研究多采取土曲霉川,最近几年,美国也开始意识到中国食品红曲中药用价值。其结构式为:

分子式为C24H36O5,Mr为404。1979年,日本学者远藤章首先从红色红曲霉菌Monascus ruber中发觉一些能产生强力抑制胆固醇合成活性物质,命名为Monacolin K, Monacolin K类物质不仅能够降低胆固醇,而且对重症胆固醇血症患者也极为有效,尤其是对造成动脉硬化最严重低密度蛋白胆固醇有优先降低作用,其中以Monacolin K抑制HMG一COA还原酶活性最高川。1980年,美国Albert等从土曲霉中发觉了与Monacolin K相同物质侧,命名为mevinolin,现称作洛伐她汀(Lovastatin)。不过采取土曲霉发酵,菌株安全性对下游工程技术要求较高,所以提取收率较低。由药用红曲霉制成制剂含有较强降血脂能力,副作用较低于Lovastatin制剂。近些年来,中国开展了红曲霉降血脂生理活性物质研究。
1.2 Monacolin K基础性状见表1。

1.3 Monacolin K抑制胆固醇合成作用机理
生物化学研究表明,胆固醇合成关键步骤是甲经戊酸合成(见结构式)。

其中影响最大是3一羟基一3甲基一戊二酰CoA〔HMG一CoA〕还原酶,它是胆固醇合成代谢中限速酶,多种原因对胆固醇合成调整关键是经过对HMCCoA还原酶活性影响来实现。Monacolin K空间结构与HMG一CoA结构非常相同,且对HMG一CoA还原酶亲和力比HMG一CoA强1万倍,所以它能竟争性地与IIMG一CoA还原酶结合,从而抑制胆固醇合成。这类物质浓度只要达成0.001一0.005μg/ml,胆固醇合成就会受阻,即人体血液中含有MOnacolin K在1一5μg/L时会产生降低胆固醇功效阁。成年人血液量为20L,所需Monacolin K有效剂量为100μg,若菌株MonacolinK发酵液含量为47.1μg/ml,服用3而发酵液即可满足要求[1]。
2. 功效红曲生产方法
2.1 固态发酵
传统红曲生产工艺关键是以大米为固态培养基, 接种红曲菌菌种后经过发酵生产红曲。该方法工艺落后, 劳动强度大, 红曲产量低, 质量不稳定, 而且易受杂菌污染。80 年代后, 通风池法应用于红曲生产, 红曲产量和质量相对提升。圆盘制曲机应用实现了红曲自动化生产, 并提升了红曲质量, 在一定程度上降低了杂菌污染。
传统红曲发酵工艺因为未能有效控制通风、 温度、 湿度等关键发酵条件, 所以, 所得红曲色价和活性成份较低, 且桔霉素污染严重。刘昕[2]提出在固态发酵中, 代谢产物 Monacolin K 在红曲菌菌丝体生长后期积累达成最大。同时, 因为淀粉质固态培养基料被红曲菌分泌淀粉酶和糖化酶液化而出现基料通气环境恶化, 菌丝体细胞壁被高渗透压葡萄糖液浸润, 从而使其生长代谢出现变态反应, 促进桔霉素生成以抑制其它杂菌生长。所以她提出了一个经过调控红曲菌培养过程中培养温度、 湿度及通风量来抑制桔霉素生成方法, 所取得功效性红曲中Monacolin K 含量高且未检测出桔霉素。
王立新等[3]认为固态发酵法较液体发酵法含有显著优势。在确定试验条件下, 固态发酵法所得Monacolin K 产率为液体发酵法 20 倍以上。所以在掌握固态发酵规律基础上, 设计合理固态发酵反应系统, 实现高效低耗固态发酵生产, 是功效性红曲产业化生产有效路径。同时, 该研究表明固态发酵过程中物料初始含水量以 50%为宜。含水量较高时, 糖化酶活性增强, 从而提升培养基料糖化速率, 不利于红曲中 Monacolin K 积累。
培养温度对促进红曲菌发酵过程中 Monacolin K生成十分关键。恒温培养可取得比变温培养更高收率菌体量和色素, 而变温培养 Monacolin K 产量更高。试验研究表明, 在 32°C 温度下培养 9 d 后, 将温度降至 25°C 下培养 14 d, 则更有利于 Monacolin K积累[4]。
红曲为好气性菌, 其菌丝体生长和Monacolin K等次生代谢产物产生都需要有足够氧气。所以, 适宜溶解氧水平是一个非常关键参数, 它直接影响红曲中 Monacolin K 和桔霉素含量。提升通风量有利于菌体生成和 Monacolin K 产生, 但同时桔霉素含量也增加。所以, 在满足溶氧需求情况下, 可采取低通风量[5]。
固态发酵法是现在红曲生产中广泛采取方法, 含有投资少, 产量大, 生产经验丰富等优点。现代固态发酵工艺关键是控制发酵过程中菌种质量及物料含水量、 通风量、 培养温度及湿度等参数, 经过现代技术优化和改造发酵工艺, 可望有效生产富含活性成份 Monacolin K 且不含桔霉素功效性红曲。
2.2 液态发酵
液态发酵法发酵红曲关键以淀粉、 葡萄糖、 甘油、 黄豆粉、 玉米浆和蛋白胨等为培养基, 采取常规标准深层发酵设备, 如机械搅拌发酵罐等。多年来开发适宜于高粘度发酵体系气升式反应器, 将愈加有利于发酵过程进行。
液态发酵法培养基碳源、 氮源、 初始 pH 值及溶氧量等是关键工艺控制参数。碳源以甘油最好, 葡萄糖次之。有机氮源中肉膏和蛋白胨优于酵母膏, 无机氮源则以 NaNO3很好。C/N 比值是十分关键控制原因, 它不仅影响前期菌丝体生长, 而且对后期代谢产物形成和积累也非常关键。试验结果表明, 当 C/N 比为 5:33 时, Monacolin K 产量较高[6]。赵树欣等[4]认为培养基初始pH值对Monacolin K生成也有显著影响, 当 pH 为 6.0~6.5 时最为适宜。
许赣荣等[7]对经过筛选低产桔霉素一株红曲菌菌种进行液态发酵法培养, 选择玉米淀粉和谷氨酸单钠盐为关键成份培养液, 所取得红曲菌发酵液中桔霉素浓度低于 1mg/ml。另外, 溶氧条件对红曲菌产生桔霉素影响研究结果表明, 高溶氧对桔霉素
产生有促进作用。
Blanc 等[8]研究发觉, 在液态深层培养红曲过程中添加6至18碳脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素生成, 尤其是辛酸和 2-三十碳酮可使桔霉素生成量降低 75%。
杨胜利等[9]研究发觉, 应用超声波技术可提升红曲菌发酵过程中 Monacolin K 产量。正常情况下红曲菌落呈团状, 氧和营养物质不易吸收, 也不利于代谢产物生成。采取超声波处理可使菌丝体分散, 甚至成为游离单菌体, 从而有利于菌体代谢和活性物质分泌。同时, 超声波处理还可降低发酵液粘度, 有利于氧气和营养物质传输。试验结果显示, 当超声处理时间为 2 min 左右时其效果最好, 既不引发细胞死亡, 又能显著提升 Monacolin K 产量。
液态发酵法所用基质混合和扩散较为均匀, 有利于氧气和其它营养成份传输与扩散, 且易于添加一些特定成份以抑制桔霉素生成。但现在中国采取液态深层发酵法生产红曲发酵液中, Monacolin K含量较低且不稳定, 甚至出现依靠添加由土霉素发酵取得 Monacolin K 或直接添加合成药品洛伐她丁来控制产量现象。所以, 红曲液态发酵工艺及产品质量控制需深入加以规范。
3 提取工艺
国际上对洛伐她汀首次报道来自A.Endo. 1976年,东京大学酵试验室Akira Endo从泰国食品中分离出来Monascus菌株(Monascus-rubberNo.1005),经发酵产生洛伐她汀.其培养基组成为:6%葡萄糖、 2.5%蛋白胨、 0.5%玉米油、 0.5%氯化氨.经28e需氧培养10 d,所得发酵液经处理可得到无色洛伐她汀晶体.其提取工艺见图1.

图1 最早洛伐她汀提取工艺
但该工艺数次采取溶媒萃取法,并大量使用有害溶媒,对劳动者及环境都会造成极大危害。
王健[10]等经过试验研究确定了从洛伐她汀发酵液中提取洛伐她汀最好工艺条件。试验表明乙醇作为溶剂时, 其最好工艺条件: 浸提温度 45℃, 物料比 5∶1(乙醇 /mL∶菌丝 /g), 浸提时间 4h, 闭环温度 80℃, 闭环时间 5h。本工艺简便、 收率高, 适适用于工业化生产。
周慧[11]等提出了采取超临界CO2流体萃取, 95％乙醇超声洗涤纯化方法。经过试验确定优化萃取工艺为萃取压力25 MPa、 萃取温度55 ℃、 夹带剂用量2.0 mL·g－1、 萃取时间100 min; 优化纯化工艺为95％乙醇为洗涤溶剂, 洗涤4次, 每次用量 2 mL·g－1, 所得洛伐她汀纯度＞98％。该方法优势在于摒弃了大量有机溶媒, 仅使用乙醇一个溶剂, 不会对人体及环境造成危害; 工艺简便, 省去了结晶与重结晶步骤; 降低了成本, 适合工业化生产需求。
4 洛伐她汀分析检测方法
4.1 硅胶薄层层析法测定（TLC）
毛宁等[12]经过试验发觉, 若用发酵滤液粗提浓缩物, 最终提取结晶以及结晶剩下滤液点样, 用薄层层析检测 结果几乎一致, 所以只需对发酵滤液粗提浓缩物进行薄 层层析定量或定性检测。
TLC定性试验: 取硅胶GH25420g, 加0.5%CMC Na50ml, 用铺板器铺成1mm厚, 20cm×20cm薄层板, 室 温晾干, 105℃活化1h, 置干燥器中备用。展开剂: 二氯甲烷 : 丙酮（9: 1）, 称取固态样品5g, 用100ml乙酸乙酯在索氏提 取器上回流提取1h, 提取液浓缩至5ml, 取50μl点样, 或直 接取发酵滤液粗提浓缩物50μl点样, 同时用Monacolin K标 准品（美国Merch企业）点样作对照, 展开15cm, 取出晾 干, 紫外灯下观察斑点位置。Monacolin KRf值应为0.47, 分 别挖取与标准品相同Rf值斑点和相同面积空白硅胶 作参考, 置10ml具塞试管中, 加乙酸乙酯5ml, 猛烈振荡 2min, r/min离心15min, 取上清液低温蒸干, 加5ml环已 烷重新溶解, 观察在200～300nm范围内紫外吸收图谱, Monacolin K在231nm, 238nm及247nm下有特征吸收峰。
TLC定量分析: 精密称取标样适量, 加乙酸乙酯 配成1ml含10mg溶液, 精密吸收该液5, 10, 15, 20, 25μl点 于薄层板上, 展开, 分别刮取Monacolin K斑点和相同面积 空白硅胶, 按以上制成环乙烷溶液, 在247nm下测定光密度。标准样微克数与光密度分别为横, 纵坐标作标准曲 线。按以上将样品提取液50μl点于同一板上, 将斑点取 下制成环乙烷溶液测定光密度, 依据光密度从标准曲线上 查得对应Monacolin Kμg数。
4.2 HPLC定性加定量检测
高嘉安[6]等用高效液相色谱仪检测粗提浓缩物, 出现多个杂质峰, 它们位置远离Monacolin K峰, 对测量值没有 影响, 所以只需对发酵液粗提浓缩物进行检测。所用仪 器为Beckman126型高效液相层析仪, 分离管为0.76cm× 30cm, C18μm Bondapak微径管柱, 流动相为79%甲醇和21% 磷酸, 流速1ml/min, 紫外检测波长: 237nm, 标准品同上。
怎样对发酵样品进行简便有效预处理是定量分析一个关键问题。发酵液预处理方法:取6mL发酵液,加入14mL甲醇,摇床振荡(30℃,200rpm)2.5一3h后,离心(8000r/min)20min,上清液用有机滤膜过滤后进样。
文镜[13]等建立了用RP-HPLC-PDA检测器测定功效红曲中Monacolin类化合物总含量检测方法, 其优势是能够在缺乏Monacolin化合物标准样品情况下对功效红曲中Monacolin类化合物进行定性、 定量分析。用75%乙醇超声提取功效红曲中Monacolin类化合物, 高效液相色谱仪以甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（v∶v∶v）为流动相, 用反相C18柱（4.6×250mm, 5μm）分离提取液中Monacolin类化合物, 并用二极管阵列检测器检测。在此试验条件下, 功效红曲提取液中各Monacolin类化合物能够得到良好地分离。用检测器同时给出各Monacolin类化合物紫外吸收光谱图定性, 用外标法依据各Monacolin类化合物峰面积定量。对方法正确度、 精密度、 线性关系进行考察; 对5种功效红曲样品进行检测均取得良好结果。
5 桔霉素
在红曲霉发酵晚期, 易产生次级代谢产物桔霉素, 桔霉 素是毒性很强真菌毒素, 对肾脏有毒害作用, 而且还发觉 有致畸作用, 但并非全部红曲菌都会产生桔霉素, 例 如; 日本用从毛红曲霉, 红色红曲霉, 单色红曲霉能够生产出不含桔霉素产品, 而且桔霉素产生是否与生产方 法相关, 生产工艺条件还决定桔霉素含量, 比如许赣荣 等筛选得到数株低产桔霉素红曲菌种。由此看来, 只 要筛选出适宜菌种并优化发酵工艺, 使桔霉素产生受 到抑制, 得到高Monacolin K含量而且不含或少含桔霉素 红曲产品是可能实现。也有些人认为红曲霉发酵产品是 一个混合物, 不能认为因为其中存在桔霉素, 就否定红曲制 药正常作用, 其剂量原来就小, 在一定范围内, 人体食用仍然是安全[14]。
现在红曲中桔霉素检测方法关键有 HPLC-紫外检测法、 HPLC-荧光检测法、 酶免疫法等。紫外检测最低检测浓度通常为 1mg/ml, 而荧光检测最低检测限可达 0.60ng, 更适适用于功效性红曲中微量桔霉素检测。酶免疫法测定桔霉素灵敏度亦较高, 但所需试剂价格昂贵, 未能普及应用[15]。
样品预处理对于降低色素在桔霉素测定中干扰亦很关键。许赣荣等[16]以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7:3:1）为提取溶剂, 将红曲样品超声波提取 3 次后, 桔霉素提取效率最高, 同时提取红曲色素最少, 为正确检测功效性红曲中微量桔霉素提供了很好样品预处理方法。
6 中国外工业化生产情况
1987年美国开发新一代降胆固醇药品--美降之投放 市场, 并于1989年进入中国, 随即美国开发了vastatin系列 降胆固醇药品, 其关键成份就是Monacolin K或J。受日 本、 美国研究工作和中国历代对红曲药用功效启示, 1991 年, 张茂良等人开始了对红曲研究。1995年开发出新 型天然降血脂药品--血脂康, 该药利用红曲发酵后综 合提取物制成, 未对发酵产物进行提纯, 除含有降胆固醇物 质Monacolin K外, 还保留其她多个有效成份。同年, 中 国科学院成都地奥制药企业生产脂必妥片, 是一个新型中成药, 关键成份是红米曲。多年来, 高血脂以及相 关心血管疾病已成为影响中国人民身体健康关键疾病 之一, 血脂偏高病人高达800万人, 引发这些疾病关键原因是高胆固醇, 对含Plonacolin K类药品现在中国 刚开始生产, 在产率和提取得率上与发达国家有较大差 距, 而且副作用普遍反应较大, 这类药品关键靠进口, 价格较贵, 如美国生产Lovostatin, 年销售额高达20亿美元。所以, 加大对Monacolin K研究开发含相关键现实意义。

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