p16ink4a基因的分子生物学研究进展.doc

p16ink4a基因分子生物学研究进展
张毅彬

关键词: p16ink4a基因; CDK4 / 6; 细胞周期; 肿瘤发生

【摘要】 抑癌基因p16ink4a在特异地抑制 CDK4及CDK6在控制细胞生长、 抑制肿瘤发生、 促进细胞衰老等方面发挥关键生物学作用, 该基因失活后造成了细胞周期调控失常,使得细胞异常增殖,造成了肿瘤发生、 发展, 本文就近几年来相关它在染色体上定位、 结构以及在细胞增殖、 癌变过程中研究进展作一综述。

p16ink4a基因最早作为肿瘤抑制基因由美国冷泉试验室在1994年发觉, 属于细胞周期依靠性激酶抑制基因INK4家族一员[1], 在正常细胞中含有调控细胞周期作用, 负调整细胞增殖及分裂, 在人类50%肿瘤细胞中发觉有缺失、 突变或者表观遗传上缄默[2]。

1．p16ink4a基因结构和定位

人类p16ink4a基因位于第9号染色体断臂2区1带, 即9P21CDKN2A位点, CDKN2A基因位点包含INK4A和ARF两个重合基因, 因阅读框不一样分别编码蛋白p16ink4a和p14ARF, , p16ink4a基因全长约8.5kb, 由 3个外显子exon1α（126bp）,exon2(307bp),exon3(11bp)加上2个内含子组成, 其编码p16ink4a蛋白由148个氨基酸组成, 定位于细胞核内。

2．p16ink4a与细胞周期调控

在正常增殖组织细胞中, p16ink4a蛋白表示处于一个较低水平, 并经过p16ink4a-CDK4/6-Rb路径调控细胞周期。Rb基因即成视网膜瘤基因, 是一个关键抗癌基因, 细胞中Rb基因在激活状态下可编码Rb蛋白, 并经过Rb蛋白调控转录因子E2F活性, 从而最终调整细胞周期。处于G0/G1期细胞中Rb蛋白处于去磷酸化状态, 并与转录因子E2F组成复合体, 从而阻断E2F与顺式作用元件结合,进而阻遏基因表示。如Rb蛋白与E2F结合后,可阻断编码DNA聚合酶、 胸苷激酶、 二氢叶酸还原酶等相关基因表示,使这些酶类不能合成,DNA生物合成亦受阻, 所以抑制了细胞生长。当在有丝分裂信号激活作用下, G1期细胞中CDK4/6与cyclin D组成复合物, 介导Rb蛋白磷酸化, 磷酸化Rb蛋白失去活性, 释放出转录因子E2F, 转录因子E2F与DNA开启子近端元件结合后,促进转录预始复合物(PIC)组装,使结构基因稳定表示, 细胞经过G1/S期检验点, 从而促进细胞生长。p16ink4a调控作用关键表现在p16ink4a蛋白直接与CDK4/6分子结合, 从而竞争性抑制CDK4/6与cyclin D结合, 保持Rb蛋白去磷酸化状态, 进而使细胞停滞于G0/G1期无法进入S期开启染色体复制以完成增殖活动[3, 4], 除此之外, p16ink4a还能扰乱CDK4/6与其她CDKI结合, 造成这些非p16CDKI释放, 深入抑制细胞周期[5]。当细胞出于部分较显著异常状态时, 如DNA损伤、 原癌基因过分表示及细胞生理性老化时, 就能开启p16ink4a表示[6]。

3．p16ink4a基因与肿瘤

在人类肿瘤中, 在靠近50%肿瘤类型中发觉p16ink4a基因有不一样程度失活[7], p16在不一样肿瘤中失活评定几率以下: 乳腺癌: 20%; 非小细胞肺癌: 65%; 结直肠癌: 30%; 膀胱癌: 60%; 头颈部鳞状细胞癌: 50-70%; 黑色素瘤: 60%; 白血病: 60%; 食道癌: 70%; 多发性骨髓瘤: 60%; 胰腺癌: 85%[8]。在这些肿瘤中, 很多p16失活机制已经被说明, 包含基因纯合性缺失、 杂合性缺失、 点突变以及表观遗传上开启子甲基化[9, 10], p16失活造成细胞过分增殖, 并可使G1期未充足发育细胞提前进入S期, 引发增殖性疾病发生, 而且每一个肿瘤含有自己特有失活类型, 比如48%胰腺癌样本中发觉p16纯合性缺失, 而在胃癌中, p16开启子甲基化是关键原因, 百分比高达34%, p16基因缺失和突变只占2%[11], Chang等人发觉膀胱癌中60%p16基因开启子存在高度甲基化现象[12], Hernandez等分析了4 2例慢性粒细胞白血病(CML)病人p16ink4a 基因外显子2缺失和开启子甲基化情况, 发觉29%淋巴细胞白血病急性变中存在p16ink4a基因纯合性缺失, 而慢性期和髓样细胞白血病中均未发觉缺失, 也未发觉p16ink4a基因开启子异常高甲基化, p16ink4a基因缺失与临床特征无显著相关, 提醒p16ink4a基因缺失是否并不能影响病人预后[13]。Kwong等人分析了亚洲人种喉鳞状上皮细胞癌细胞系p16ink4a失活机制和功效, 发觉了开启子甲基化、 外显子2和3纯合性缺失、 外显子1框移突变造成了其转录失活和蛋白突变体产生[14]。Grafstrom等利用实时定量PCR方法研究了86个病人p16ink4a基因缺失情况及其与预后关系, 发觉纯合性缺失是皮肤恶性黑色素瘤最关键遗传学改变, 且与不良预后亲密相关[15]。另外, 在小鼠肿瘤模型中, p16ink4a和 p14ARF 协同作用缺失已经在部分肿瘤发生模型,包含在对特定致癌物质、 黑素瘤、 恶性胶质瘤和胰腺癌反应中确立。
另外, 尽管大量研究表明p16ink4a作为一个肿瘤抑制基因在肿瘤中表示是下调, 不过也有部分报道认为p16ink4a在肿瘤中有过表示情况, 比如在子宫颈鳞癌和结肠癌研究中, 有报道p16ink4a在肿瘤细胞中过表示现象发生[16], 而且p16ink4a高表示与病毒感染相关, 如在人类乳头瘤病毒HPV相关口腔鳞状细胞癌中, 高风险类型HPV感染口腔细胞后, HPV所表示E7蛋白能与细胞中Rb蛋白结合, 阻止Rb与转录因子E2F结合, 所以E2F含有活性, 引发细胞分裂, 又因为Rb-E2F复合物能负反馈抑制p16表示, 而E7蛋白与Rb蛋白结合后, Rb-E2F复合物不足, 所以造成了p16ink4a高表示[17, 18]。而在非HPV感染头颈部鳞癌中, p16ink4a低表示, 癌细胞分裂活跃, 而HPV感染头颈部鳞癌中, p16ink4a因E7蛋白缘故而高表示[19], 但即使p16ink4a在癌细胞中高表示, 仍无法对抗癌细胞异常增殖[20]。不过, 这种p16ink4a高表示口腔肿瘤对放射疗法敏感性更高, 而且p16ink4a可作为口腔癌临床预后标志物, p16ink4a高表示阳性类型预后较p16ink4a高表示阴性愈加好[21]。另外, 在肿瘤癌前病变组织中也能够监测到p16ink4a高表示, 能够认为这种改变是为了抑制病变继续发展[22]。

4．p16ink4a与细胞衰老

细胞衰老也称细胞老化,通常是指细胞在信号转导作用下不可逆地脱离细胞周期并丧失增生能力后进入一个相对稳定状态。细胞衰老是生物体中普遍存在一个不可逆生长停

滞现象,是器官衰老基础,存在于任何生命任何时期,在不一样情况下其速率与程度有所差
别。己有研究证实基因是细胞衰老关键效应物, 是遗传控制程序中关键步骤, 它经过—定路径调控细胞周期, 影响细胞生物钟细胞寿命和端粒长度, 而非激活端粒酶起作用, 细胞衰老遗传原因有很多个,其中有一个原因是突变癌基因所产生信号造成细胞衰老。现在发觉这种现象与p16ink4a- Rb和p14ARF-p53这2条路径相关, Rb和p53是衰老信号通路网络中 2个关键控制点[23]。
在人类肾脏组织细胞和皮肤细胞衰老过程中都显示出p16ink4a表示上升[24], 提醒这个肿瘤抑制基因在细胞衰老中关键作用。除此之外, 有报道发觉p16ink4a在衰老成纤维细胞中过分表示[25], 在氧化应激和DNA损伤中也有被报道有过表示现象发生[26, 27]。Janzen等发觉p16ink4a表示在HSCs 、 NSCs和胰腺干细胞中都显示了其促进衰老和抗增生能力,这表明在这些干细胞中p16ink4a表示能够经过抑制增生和自我更新而促进衰老,是引发衰老原因之一[28, 29]。Han 等研究发觉p16ink4a蛋白能增加p21蛋白稳定性, p21蛋白则经过转录因子SP1 激活p16ink4a基因表示, 二者协同抑制细胞周期, 细胞周期停滞则是细胞衰老前提, 说明p16ink4a基因可能经过促进p21基因表示造成细胞衰老[30]. 尽管很多汇报显示p16ink4a与细胞衰老有千丝万缕联络, 但现在p16ink4a在细胞衰老过程中完整具体机制还未明了[31]。

5．p16ink4a基因表示调控

作为调控因子, 已知有部分肿瘤相关因子或分子信号通路影响p16ink4a表示。其中最好研究就是经过激活 Ras 及其下游效应器B-Raf突变来诱导 ERK/MAPK通路。已经有研究证实RAS活化可能造成p16ink4a表示,包含ERK介导 Ets1/2活化诱导p16ink4a表示和Jun介导转录因子DMP 1活化诱导p14ARF表示, 另外polycomb 家族 ( PcG) 基因 ( BMI - 1、 Cbx 7、 Mel 18) 等也抑制p16ink4a表示。
在成纤维细胞中,Ets1、 Ets2转录因子可经过与p16ink4a开启子中Ets结合位点(GGCC)结合而使其激活,促进p16ink4a转录。在低代龄(<30代)成纤维细胞中大量存在Ets2对p16ink4a诱导,可被Ras-Raf-MAPK激酶信号所加强,同时可被Id1直接作用所抑制[32]。
E蛋白是一类含有bHLH结构域并经过与E-box结合来激活转录蛋白家族,它包含E12、 E47、 E2-2、 HEB4个组员。p16ink4a开启子内含有2个E-box结构, E蛋白以其bHLH结构域结合这两个E-box,上调p16ink4a转录水平,诱导衰老表型出现。Id1也是E-box结合蛋白序列特异性转录抑制因子[33]。
在细胞中, 含有锌指结构Sp(specificityprotein)家族转录因子与GC盒相互作用, 现在已知有Sp1～Sp88种蛋白质。p16ink4a开启子无TATA盒,其开启子上GC含量丰富,且含有5个Sp家族转录因子结合位点,Sp家族中转录因子Sp1经过与这些GC盒结合来促进p16ink4a转录[24]。
LI等认为p16ink4a开启子-426到-433区域含有一个HMG盒包含蛋白1（HBP1）, 其与p16ink4a开启子结合能上调p16ink4a表示[34]。
哺乳动物AP1蛋白能以同源二聚体或异源二聚体形式组成bZIP蛋白, 包含C-JUN、 junB等等, 在小鼠p16ink4a开启子区域中发觉3个AP1样结合位点, bZIP蛋白与AP1样位点结合后能促进p16ink4a表示[35]。
Id家族可抑制Ets蛋白对p16ink4a转录激活作用。在成纤维细胞中,Ets1和Ets2可经过与p16ink4a开启子中Ets结合位点结合,促进p16ink4a转录,但同时可被Id1直接作用所抑制。所以,在该细胞中即使大量表示Ets2,但可能因为Id1抵消了Ets2对p16ink4a促进作用,使p16ink4a在年轻细胞中只有低水平表示;而在衰老细胞中,Ets2和Id1水平下降,Ets1水平上升,这么仍可使p16ink4a表示显著增加[32]。
甲基化对p16ink4a转录有负调控作用, 其中p16ink4a基因5’端开启子区及第一、 二外显子CpG岛甲基化使其不能完成转录是造成抑癌基因失活关键原因, 如脑部肿瘤、 乳腺癌、 结肠癌、 头颈部肿瘤、 肺小细胞肺癌和非霍奇金病等疾病中都有相关报道[36]。
polycomb 家族 ( PcG) 基因经过染色质修饰调控靶基因转录抑制子, 与细胞增殖、 分化和肿瘤发生有亲密关系, 从生化和功效上它能够分成两个关键关键蛋白复合体PRC1(Polycomb repressive complex 1)和PRC2(Polycomb repressive complex 2), BMi1、 Cbx7、 Ring1b以及Phc2都属于PcG基因, 如BMi1基因靶基因就是CDKN2A位点, 在小鼠模型和细胞试验中, 都确定了BMi1能下调p16ink4a及p14ARF表示[37]。

6．其她

在细胞其她部分活动过程中, p16ink4a也扮有相关作用, 比如细胞凋亡、 细胞侵袭、 血管生成等等, 而且这些活动与它在肿瘤中过表示有一定联络。另外在红细胞发育过程中, p16经过调整bcl-X与NF-KB通路来促进红细胞分化和凋亡[38]。Harada发觉在恶性神经胶质瘤中, p16ink4a能下调VEGF表示, 从而抑制肿瘤血管生成过程[39]。

7．展望

在这篇综述中, 我们简单地叙述了p16ink4a基因结构、 功效、 相关疾病关系以及众多转录因子对其复杂正、 负调控, 尽管在探索P16分子在细胞中相关作用及表示产物功效研究上已经取得一定结果, 但我们仍未全方面了解清楚, 尤其是p16ink4a与细胞衰老发生机制方面还需要更多探索与研究, 拓展其在细胞和机体中以及在更多不一样疾病中相关功效认识, 无疑将有利于大家愈加好掌握细胞生长规律, 这么才能为新诊疗方法和策略指明方向。

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