SN∕T 3483-2013 松江鲈鱼的物种鉴定方法 PCR方法(出入境检验检疫).pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 松江鲈鱼的物种鉴定方法犘 犆 犚方法犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犜 狉 犪 犮 犺 犻 犱 犲 狉 犿 狌 狊犳 犪 狊 犮 犻 犪 狋 狌 狊犘 犆 犚 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 徐彪、 赵玉然、 岳志芹、 张太翔、 郑小龙、 赵巍。犛 犖犜 松江鲈鱼的物种鉴定方法犘 犆 犚方法范围本标准规定了松江鲈鱼物种鉴定 方法的技术规范。本标准适用于松江鲈鱼的种质鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 犆 狋值 犮 狔 犮 犾 犲 狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱荧光信号由本底进入指数增长期时拐点所对应的实时荧光定量 循环次数。 扩增曲线犪 犿 狆 犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犮 狌 狉 狏 犲在实时荧光定量 反应中， 模板被扩增， 实时荧光定量 产物经过线性增长期、 指数增长期以及平台期三个阶段， 实时荧光定量 产物的量随时间的变化而得到的曲线。技术原理本实验是利用松江鲈鱼细胞色素（ ， ） 基因的保守性与特异性设计引物与探针， 建立实时荧光定量 方法。该方法是在常规 的基础上， 加入一条特异性的荧光探针。探针为一段寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 实时荧光定量 扩增时，犜 犪 狇酶的 外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可以接收到荧光信号， 即每扩增一条 链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与 产物的形成完全同步。该方法具有实时、 定量、特异性强、 灵敏度高的优点。试剂和材料 实验用水应符合 的规定。犛 犖犜 酶反应预混液包含热启动酶（ ， 启动） 、 、 和优化的反应缓冲液。 实时荧光定量犘 犆 犚引物正向引物： 反向引物： 探针： 引物与探针经稀释后， 浓度为 ， 保存备用。引物扩增片段为位于松江鲈鱼 基因上的一段核苷酸序列。松江鲈鱼 基因序列参见附录 。仪器和设备 组织研磨器（ ） 。 实时荧光定量 仪。 核酸分析仪。松江鲈鱼种质鉴定的方法 样品的处理松江鲈鱼形态学参见附录。取鱼肌肉组织， 经研磨后置于 冰箱中备用。 犇 犖 犃的提取样品 的提取可采用动物组织基因组通用试剂盒按说明书提取， 也可采用常规抽提法， 见附录。 样品犇 犖 犃含量用核酸分析仪测定样品的 ， 根据 ， 计算样品 含量。 实时荧光定量犘 犆 犚扩增 实时荧光定量犘 犆 犚反应体系 酶反应预混液（ ? ） ， 正、 反向引物各， 探针 ， 待检样品 （ ）， 用 补充至 。每个样品各做个平行。 实时荧光定量犘 犆 犚反应条件 ， ； ， ； ， ； ， ； 个循环。 阳性对照、 空白对照的设立在实时荧光定量 检测过程中， 分别以松江鲈鱼核酸、 水作为阳性对照、 空白对照的模板。实时荧光定量 反应过程中仪器自动收集荧光信号， 反应结束后， 查看扩增曲线、 值。犛 犖犜 结果判断阳性样品的实时荧光定量 扩增呈“” 型扩增曲线， 空白对照没有扩增曲线。通过阳性对照、 空白对照的扩增结果排除假阳性结果。在阳性对照、 空白对照成立的前提下， 检测样品的结果根据其 值和扩增曲线综合判定：）若 值 ， 且扩增曲线呈“” 型， 则判为阳性， 该样品判断为松江鲈鱼；）若 ， 应重做实时荧光定量 扩增， 再次扩增后的结果仍 ， 且阳性对照、 空白对照结果正常， 则可判定样品检测结果为阳性， 该样品判断为松江鲈鱼， 再扩增后结果 ， 且阳性对照、 空白对照结果正常， 则可判定样品检测结果为阴性；）若 值 ， 则判为阴性。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）松江鲈鱼犆 狔 狋犫基因序列 横线处为定量 检测区域。犛 犖犜 附录犅（ 资料性附录）松江鲈鱼概述松江鲈鱼（犜 狉 犪 犮 犺 犻 犱 犲 狉 犿 狌 狊 犳 犪 狊 犮 犻 犪 狋 狌 狊 ） ， 别名四鳃鲈（ 上海、 松江） 、 花花娘子、 花鼓鱼（ 崇明、 苏北） 、 老婆鱼、 老虎鱼、 新娘鱼、 媳妇鱼、 媳妇头（ 山东、 辽宁） 等， 属于脊椎动物门（ ） 、 硬骨鱼纲（ ） 、 鲉形 目 （ ） 、 杜 父 鱼 科 （ ） ， 松 江 鲈 鱼 属 （犜 狉 犪 犮 犺 犻 犱 犲 狉 犿 狌 狊） ， 是 年由 在菲律宾发现并定其学名的。松江鲈鱼头及体前部宽且平扁， 向后渐细且侧扁。头大， 头背面的棘和棱被皮肤所盖。口大， 端位。上、 下颌， 犁骨和颚骨均有绒毛状细牙。眼上侧位， 眼间距较狭下凹。前鳃盖骨后缘有四棘， 上棘最大，端部呈钩状， 鳃盖骨后缘游离突起似一鳃孔， 故又称四鳃鲈。体裸露无鳞， 有粒状和细刺状的皮质突起。背鳍个， 在基部稍相连， 起点在胸鳍腋部上方， 后端近尾鳍基部。臀鳍长， 无鳍棘。胸鳍宽大， 椭圆形。腹鳍腹位， 狭小， 基部相互靠近 见图 ，） 。体背侧黄褐色、 灰褐色， 腹侧黄白。其体色可随环境和生理状态发生变化。体侧具条暗褐色横带， 吻侧和眼下各具条暗带。成鱼头侧前鳃盖骨后缘为桔红色， 在鳃盖膜上各有条桔红色斜带， 繁殖期尤为鲜艳 见图 ，） 。松江鲈鱼雌雄略有区别： 雄鱼头部宽大， 吻圆钝， 具尿殖乳突， 体色较深； 雌鱼头部狭长， 吻稍尖， 无尿殖乳突， 体色较浅。松江鲈鱼是一种东亚暖温带沿海的洄游鱼类， 体长只有 ， 最大的也只有 。松江鲈鱼在我国分布于鸭绿江口到九龙江口等临海淡水江河下游地区， 国外在朝鲜半岛和日本九州的福冈等也有记录。犪）犫）图犅 松江鲈鱼的形态图犛 犖犜 附录犆（ 规范性附录）犇 犖 犃的提取方法犆 样品处理将鱼肌肉组织置于冰冷的生理盐水中反复冲洗， 滤纸吸干表面水分后称量（ 根据需要） ， 置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水， 进行手工匀浆研磨。注意整个过程在冰上完成。犆 犇 犖 犃的抽提犆 将鱼肌肉组织匀浆液 ， 加入 塑料离心管中， 加 蛋白酶， 再加 至终浓度为， 上下颠倒混匀。犆 混合液置于 水浴， 水浴 。犆 向匀浆液中按比例加入酚三氯甲烷异戊醇混合液（ ） ， 轻轻振荡混匀 ， 犵离心 。犆 吸取上层水相 置于一灭菌塑料离心管中， 再次加入等体积酚三氯甲烷异戊醇混合液（ ） ， 轻轻振荡混匀 ， 犵离心 。犆 吸取上层水相 置于一塑料离心管中， 加入倍体积的无水乙醇， 放置或液氮中放置 。犆 犵离心 ， 沉淀 ， 倾去上清液。犆 于沉淀中加入 乙醇溶液 ， 轻轻混匀后 犵离心 ， 倾去上清液， 室温晾干。犆 向 沉淀中加 缓冲液（ ， ） ， 溶解沉淀 保存备用。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准松江鲈鱼的物种鉴定方法犘 犆 犚方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元