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植物基因组DNA的提取及分析.doc

上传人:仙人****88 文档编号:9453418 上传时间:2025-03-26 格式:DOC 页数:4 大小:49KB 下载积分:10 金币
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资源描述
CTAB法提取植物基因组DNA原理 这种方法是由Murray 和Thompson(1980)修改而成的简便方法。CTAB是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中((0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 (1) 2×CTAB溶液 CTAB(W/V) 2% Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0) EDTA 20mmol/L (pH8.0) NaCl 1.4mol/L PVP 1% 灭菌备用。没灭菌前呈粘稠状 ,CTAB灭菌后变成清亮的溶液。 (2) 氯仿/异戊醇(24:1) (3) RNaseA 10mg/ml(不用) (4)乙醇或异丙醇 (5)β-巯基乙醇 (6) 70%乙醇 操作程序 n 1. 在2mL离心管中,加入500μl的2×CTAB, 65℃预热,用前加入20 μl β-巯基乙醇。 n 2. 嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中,总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min,并不时轻轻转动试管。 n 注:冻存材料直接研磨,绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移,否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。 n 3.加等体积的氯仿/异戊醇,轻轻地颠倒混匀,室温下10 000rpm离心10 min,移上清至另一新管中。 4.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇,会出现絮状沉淀,-20℃放置30 min或-80℃放置10min,12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 n 5.用70%乙醇清洗沉淀两次,吹干后溶于适量的灭菌ddH2O或TE 缓冲液中 n 6.0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 电泳分析基因组DNA的完整性 烟草基因组DNA电泳图谱 M: lDNA/ HindⅢ Marker 1,2 :基因组DNA 完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。 电泳前缘为未除干净的RNA。 可能出现的问题及解决方案 1.如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状,说明DNA含有较多的多糖类物质,可以在取材前将植物放暗处24hr,以达到去除淀粉的目的。 2.如果DNA沉淀呈棕色,难以用限制性内切酶完全消化 植物材料含有大量酚类化合物,与DNA共价结合,使DNA呈棕色,并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现,可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇,或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺)。 3.DNA中含有多糖或盐类 将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来,离心,沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次,吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂) 4.DNA已降解电泳条带呈弥散状 样品降解可能有两种情况:一是机械振动过剧烈,二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡,提取液及用品要高温高压灭菌。另外,使用吸头吸取过程中应避免产生气泡,吸头应剪去尖部,避免反复冻融DNA。
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