柑橘黄龙病菌DNA两种提取方法的比较--毕业论文.doc

毕业论文

题 目: 柑橘黄龙病菌DNA两种提取方法的比较
学 生: 陈达云
学 院: 农 学 院
专业班级: 植保31003
指导教师: 章松柏（讲师）范国成（研究员）
辅导老师:
时 间: 2013 年 4月 至 2014年 6月

目 录

文献综述……………………………………………………………………………Ⅰ
中文摘要……………………………………………………………………………Ⅱ
外文摘要………………………………………………………………………Ⅲ
1.前言……………………………………………………………………1
2.材料与方法……………………………………………………………………………2
2.1供试材料…………………………………………………………………………2
2.2试剂及仪器……………………………………………… ………………………2
2.2.1主要试剂…………………… ………………………… …………………2
2.2.2主要仪器…………………………………… ……………… ……………2
2.3实验方法…………………………………………………………………………2
2.3.1病害样品的采集…………………………………………………………2
2.3.2CTAB法提取样品DNA………………………………………………………2
2.3.3碱裂/醇沉法提取样品总DNA……… ……………………………………2
2.3.4紫外分光光度计测定样品总DNA浓度的测定……………………………2
2.3.5样品总DNA完整性检测……………………………………………………2
3结果与分析……………………………………………………………………………3
3.1抽提样品DNA浓度和纯度……………………………………………………3
3.2柑橘总DNA的检测结果…………………………………………………………3
3.3 PCR检测结果…………………………………………………… ………………3
4结论与讨论……………………………………………………………………………4
参考文献…………………………………………………………………………………5
致谢………………………………………………………………………………………6

文献综述

[摘 要]：本文综述了柑桔黄龙病的分布、发生情况、病原菌的分类、流行条件、检测与诊断、以及黄龙病的综合防控技术。
[关键词]：柑橘黄龙病；木虱；研究进展
1前 言
柑橘黄龙病(citrus Huanglon ing，HLB)是由柑橘黄龙病相关病原菌引起的毁灭性病害。该病在不同国家(地区)曾有不同的名称，在中国大陆称为黄龙病，在我国台湾称为立枯病(1ikubin)，在菲律宾称为叶斑驳病(1eaf mottle)，在印度称为梢枯病(dieback)，在南非称为青果病(greening)，在印度尼西亚称为叶脉韧皮部退化病(vein phloemdegeneration)。由于黄龙病的嫁接传染性最先由林孔湘教授确认，1995年在中国福建省福州市召开的第l3届国际柑橘病毒学家组织(IOCV)会议商定以黄龙病作为该病害的统一名称[1]。由于尚未找到好的防治药剂， 染病后只有挖除，所以俗称柑橘上的癌症。柑橘黄龙病的出现和蔓延，引起各柑橘种植国家的广泛关注。为了深入开展相关研究，更好地开展防治工作，本文对该病的发生与分布情况、病原菌分类、流行条件、检测与诊断、及防治技术等的研究成果进行了概述。
2 黄龙病的分布、发生情况
到目前为止，黄龙病主要分布于亚洲、非洲和美洲的4O多个国家和地区[2-3]；其中，巴西、美国、古巴和伊朗近几年才报道发生，伊朗2008年才首次报道。90年代末,美国对柑橘黄龙病普查中发现了该病的传病媒介柑橘木虱,但未发现柑橘黄龙病。2005年9月,在美国佛罗里达州南部发现黄龙病,严重威胁着佛罗里达州达90万hm2早的柑橘生产[4]。
我国柑橘黄龙病最早发生在广东省汕头地区,长期以来,该病在广东、广西、福建、台湾发生严重。1983一1984全国组织的柑橘黄龙病普查中,发现浙江、云南、四川、江西、湖南等省有柑橘黄龙病和柑橘木虱发生,但均属零星分布[5]。近年来,由于全球气温持续变暖,柑橘木虱活动范围扩大,柑橘种质资源的频繁调运,柑橘黄龙病的发生在我国有逐渐扩大的趋势。1996～2000年,贵州省28个县(市)进行了柑橘黄龙病调查和鉴定,结果表明发生柑橘黄龙病的县(市)有12个,较80年代新增3个,柑橘黄龙病及柑橘木虱并发区增加7个,发病从零星到全园发病不等[6]。90年代前期,江西省赣南地区柑橘黄龙病普查结果表明,赣南地区黄龙病仍在危害和蔓延,部分地区发生严重,黄龙病疫区已从华南一带越过南岭山脉向北推移[7]。为全面掌握柑橘黄龙病发生情况,浙江省于2000年10月开始组织柑橘黄龙病疫情普查,2001～2004年短短4年时间内,疫情发生从温州,台州和丽水等3市5县(市、区)60个乡镇增加到加县(市、区)185个乡镇(农、材场),发生面积由1832.5hm2扩大到10650.9hm2,病株数从72.9万株上升到187.1万株,蔓延速度极快[8]、湖南与广东、广西相邻,是柑橘黄龙病偶发区。近年来,随全球气温变暖,冬季气温较高,柑橘木虱(DiaPhorinac洲孟滋用)活动范围扩大,有可能引起本省柑橘黄龙病的蔓延,据反映,部分柑橘产区出现柑橘黄龙病疑似症状。但由于黄龙病症状表现复杂、果农缺乏对黄龙病认识,不少橘农将其误认为柑橘生理缺素等其他病害,从而加重了病情的发生和蔓延,个别产区甚至出现大片橘树枯死和毁园的现象。
3 柑桶黄龙病传播途径
柑橘黄龙病可以感染大多数柑橘品种。黄龙病的传播途径除了通过嫁接传
播，用病树接穗繁殖以及接穗和病茁的远距离传播之外，柑橘木虱是重要的传播
媒介。对木虱传毒能力进行研究结果表明，D．citri取食15-30min便可以让木虱带毒，取食时间越长，传毒能力越强。
4 柑橘黄龙病病原菌分类
柑橘黄龙病是由韧皮部难养杆菌引起,至今病菌仍不能进行人工培养,对该病原的培养性状、生态特性以及生理生化性状等细菌主栽分类学方面的特性,知之甚少。该病原的分类研究,主要集中在核酸分子生物学等方面。目前普遍认为柑橘黄龙病分为两个种,亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiatricus),非
洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter africanus)。Garnier等在南非一种观赏植物CaPe chesinut(Calodendrum caPense)上发现了韧皮部杆菌属的一个新种,通过对比16SrDNA、165/23srDNA和核蛋白的旦操纵子,发现该种的16SrDNA和黄龙病非洲种、亚洲种的同源性分别为97.4%和96.9%;该种的16S/23SrDNA和黄龙病非洲种、亚洲种的同源性分别为66.2%和80.62%;该种核蛋白的p操纵子和黄龙病非洲种、亚洲种的同源性分别为82.1%和79.9%。系统发生学的分析显示该种和黄龙病非洲种的同源性比亚洲种的同源性高,Garnier等认为该种为黄龙病非洲种的一个亚种,命名为。Candidantus liberibacteraf ricanus subsp.capensis[9] 。2005年又在巴西发现一种新的黄龙病病菌,暂定命名为,Ca.L.americanus,这种菌不能用亚洲和非洲韧皮杆菌的引物对扩增,而要用GBI/GB3特异引物对才能加以甄别[10]。
5 流行条件
（一）苗木带病率、田间病株率及介体木虱的种群数量是黄龙病发生流行的主要因素。一般苗木带病率在10%以上的新果园或田间病株率达20％以上的果园，如介体木虱发生数量大，则病害将严重发生、流行；如无介体木虱发生，即使病树较多，病害也不会流行。
（二）黄龙病的发生流行与气象条件有重要关系。黄龙病病菌生长温度范围在3～35℃。温度22～28℃、相对湿度80%～90%条件下，有利病菌的滋生和蔓延。当日平均温度在23 ℃以上时，病情扩展；当日平均温度在25 ℃或以上、相对温度达80%以上时，最有利黄龙病的发生和流行。
（三）栽培管理和植物保护措施是影响黄龙病发生的重要因素。若坚持挖除病树，自觉遵守检疫法规和苗木、接穗等繁殖材料的检疫管理，切实做好介体木虱虫情自查监测与防治，实施优质、高产栽培技术，加强果园肥水、控梢、病虫防治等管理，则橘园发病较少、较慢。若栽培管理粗放，则严重发病。
（四）良好的生态条件有利阻止病害蔓延。在高海拔地区，气温较低，发病少，病害扩展慢；在日照短，湿度大，具有良好的防护林的果园，不利木虱的生长、繁殖和传播，病害发生较少，发展慢。
（五）不同种类和品种的柑橘树抗病或耐病性有差异。椪柑、玉环柚、蕉柑、大红柑、福橘等较易感病，且蔓延迅速，导致成片死亡；普通（中、晚熟）温州蜜柑、甜橙较耐病；官溪蜜柚、金柑较抗病。枳在田间无症状表现，但用作砧木品种时，并不增加接穗品种耐病性。其他砧木品种如酸橘、红橘、墨西哥莱檬和酸柚等，其本身感病性较强，对接穗品种耐病性无多大影响[38，39]。
6检测与诊断
柑橘黄龙病的检测是一个从传统生物学向分子生物学、从定性检测到定量检测的发展过程。主要包括症状诊断、指示植物鉴定、电镜观察、血清学检测、分子生物学检测等[11]。
6.1 症状诊断
长期以来黄龙病的诊断主要依据典型的黄梢和叶片斑驳症状, 特别是在每年的10～12月秋梢成熟以后,是症状表现的最适期, 可根据当年秋梢叶片的斑驳症状来诊断田间的黄龙病病树。但是,症状的发展过程会受到环境条件的影 [12]。
6.2 指示植物
指示植物鉴定是柑橘黄龙病早期主要的鉴定方法。常用的指示植物有芦柑、蕉柑、甜橙等[ 13]。芦柑因显症快、症状稳定被我国作为柑橘黄龙病的指示植物[ 14]。过去用单个病芽腹接传病,近年来的研究发现, 用含2～3个( 甚至多个) 病芽的枝段嫁接可提高其传病率[ 15- 16],潜育期4～12个月。嫁接接种后,如将指示植物重修剪, 并加强肥水管理,促使新梢发生,可以大大缩短潜育期[13]。
6.3 电镜观察
自1977～1978 年间利用电镜与超薄切片技术,在柑橘黄龙病病树叶片的筛管细胞内发现病原类细菌以来,电镜观察便成为诊断黄龙病的一个重要手段。但由于柑橘病树体内病菌浓度较低、分布不均匀以及电镜制样采用的叶脉较小等因素, 电镜的检出率偏低, 多在60%～70%[ 17] 。近年来,以症状明显、老熟的叶片为材料,采用侧脉代替中脉和纵切代替横切韧皮部制样,能够有效地提高电镜的检出[17]。
6.4 血清学检测
以发病长春花粗提纯黄龙病病原为抗原制备的小鼠抗腹水,因效价低并伴有非特异反应,难以推广应用[ 18]。尽管随后以类似方法制备的小鼠抗腹水效价有了较大提高,能够比较准确地检测发病长春花中的黄龙病病原,但是对未显症或初显症柑橘植株,以及部分具典型病状的柑橘叶片的检测并无血清学反应[ 19]。也有利用国外机构提供的多克隆抗体检测柑橘黄龙病病原的报道[20]。
6.5 分子生物学检测
1991 年Weisburg 等[21] 首次测定了柑橘黄龙病菌的16S rDNA 序列,利用DNA 杂交和PCR方法检测柑橘黄龙病菌的分子生物学技术得以迅速发展。Hung等[22]克隆了台湾柑橘黄龙病菌一段0.24kb的DNA片段,并以生物素标记制成探,能特异地检测台湾、中国大陆、日本、越南、菲律宾、马来西亚、泰国、印度和沙特等地的黄龙病,但对南非的黄龙病则无反应。鉴于PCR 检测具有灵敏、快速、便捷等特点,已成为柑橘黄龙病菌检测的主流技术, 主要包括常规PCR、巢式( 或半巢式) PCR 以及能对黄龙病菌进行定量的竞争性定量PCR 和实时PCR 等。常规PCR 对设备和技术要求不高, 一般的分子生物学实验室都可开展,应用也最为普遍[ 23- 30] 。由于黄龙病菌在柑橘(特别是带菌但尚未显症) 病株中含量低、分布不均匀, 经常需用检测灵敏度更高的巢(或半巢式) PCR 加以检测[31] 。田亚南等首次利用竞争性定量PCR 技术对黄龙病的介体及寄主进行了定量检测, 表明柑橘木虱含菌量最高, 长春花次之, 而柑橘最少。由于实时PCR技术具有快速、特异、敏感、重复性好等优点, 已取代了竞争性定量PCR, 并被广泛应用[32-33] 。
7 柑桔黄龙病综合防治技术
植物检疫、栽种无病苗、挖除病树、防治木虱等4条柑桔黄龙病综合防治措施在20世纪60年代初就已提出来，70年代中后期又提出了“隔离种植、加强栽培管理”[34]。许长藩等1998年提出了“实施以采用无病种苗和田间防疫为中心的柑桔黄龙病综合防治技术，在新区两项措施并举，可维持既无病树，也无柑桔木虱 对病区仅施行“田同防疫”，也能压低田间病株率和控制田间传染[35]。邓铁军2005年提出了“严格防治传病昆虫一柑桔木虱。各地生产的经验证明，凡是柑桔木虱防除比较彻底的果园，黄龙病的发生显著较轻”[36]。邓明学(2006年根据传染性病害流行学原理，针对柑桔木虱是黄龙病唯一自然传播媒介和柑桔木虱的传病特点以及广西柑桔主产区无法实旖隔离种植、柑桔黄龙病已成为广西柑桔发展最大障碍的实际和广西柑桔种植业的现状，提出了“在黄龙病区建立以柑桔黄龙病为第一重要病害、柑桔木虱为第一重要害虫的柑桔病虫害综合防治体系，实施以控制柑桔木虱为重点的柑桔黄龙病综合防治措施”的理论。其技术要点主要有：
(1)树立以柑桔黄龙病为第一重要病害、柑桔木虱为第一重要害虫，防治柑桔木虱是柑桔黄龙病综合防治第一重要措施的思想。(2)采果后先喷药防木虱成虫，药后再挖黄龙病树，避免将病树上带病原菌的木虱成虫驱赶到健康树上。(3)越冬后的木虱成虫要防好。早春第一次药一定要加入防木虱成虫的农药 (4)抹梢控梢，统一放梢，减少木虱食料和缩短嫩梢期，减少木虱世代数和种群数量。(5)重视不要的晚秋梢、冬梢和夏梢木虱的防治，特别是晚秋梢、冬梢期木虱容易被忽略。抹梢前一定要先喷药防木虱然后再抹梢，避免将病树上带病原菌的木虱成虫被驱赶到健康树上。(6)春梢、秋梢期木虱防治要选用有效药剂。如：10 吡虫啉可湿粉、4．5 赛得乳油、26 虫螨毙乳油。(7)栽种无病苗术。(8)挖除病树，减少病原。(9)加强栽培管理，增施有机肥。(10)适当高密度种植，增加前期产量。(11)果园附近不要种黄皮、九里香等芸香科植物，这些植物一般一年四季都不喷药，但又都是木虱的寄主，特别是秋季、冬季木虱成虫数量多[37]。
8 展望
随着分子生物学的全面快速发展,PCR技术的建立与发展已经逐渐完善并渗入到各个分子生物学领域,被广泛的用于病害的早期诊断及病原物的检测。田间症状及指示植物诊断方法依然是一种简易可靠且低成本的初期诊断方法,血清学诊断的抗体抗原具有高效特异性一种抗体只能与相应的抗原发生特异性血清反应,由于目前黄龙病菌在人工条件下仍无法进行分离培养,碍于抗体的制备原因,血清学检测方法的应用范围有限,一种抗体无法对黄龙病菌亚洲种、非洲种、美洲种同时有效,不适用于大范围检测。本研究采用的是常规PCR技术,除此外还有巢式PCR,突光定量PCR等。巢式PCR具有常规PCR无法比拟的超高敏性,对已感病但尚未表现出症状的病株有较高检测率,能更早对并病株进行防治减少经济损失。由于巢式PCR是由两对不同引物分别进行的PCR反应,首先是外引物进行常规PCR反应,后内引物再进行特异性扩增,具有高特异性,但可能因为引物污染和人为操作不注意导致样品检测的假阳性结果。突光定量PCR是在PCR体系中加入了突光基团,通过扩增后依靠突光信号在PCR过程中的变化情况,定量检测病原的含量,成功克服了巢式PCR容易交叉污染和容易产生假阳性的问题。今后可以设计Taq基因探针,建立实时焚光PCR,无需做PCR后的处理,且能达到比常规PCR灵敏上100倍的效率对病原物进行定量检测。不过目前一次突光PCR的费用较高,不太适用于大量样品的检测。因此常规PCR目前仍是稳定性较高,特异性强,可重复性好且费用较合理的根橘黄龙病检测方法。
柑橘黄龙病在我国的病害分布有明显的扩大趋势,黄龙病在园区一旦大面积高程度的发生,将对果园造成巨大的经济损失,目前相橘黄龙病在我国主要分部在广东,广西,浙江,福建,江西,湖南,台湾,四川及云接壤之处等地,随着温度的回暖,相橘木風的发生情况也在逐渐变严重,因此一旦有相橘黄龙病的发生,一定要在当地引起足够的重视,要建立完善和严格的疫区监控系统,健全疫区病害的防治和销毁措施,严管苗木的调运及嫁接,在疫区周边设立监测站,对木風情况进行检测,保护非疫区。

柑橘黄龙病菌两种DNA提取方法的比较
学 生：陈达云 长江大学农学院
指导老师：章松柏 长江大学农学院
范国成 福建省农业科学院植保所
[摘 要] 柑橘植物组织中富含多糖、酚类、单宁、色素等物质。它们的存在严重干扰了柑橘黄龙病PCR检测的准确性。因此有必要筛选出一种能得到纯度高、结构完整的柑橘总 DNA( 含黄龙病DNA),且操作简便的提取方法。本研究对比试验了2种柑橘总DNA提取方法,方法l采用碱裂/醇沉法；方法2采用CTAB法。实验研究表明，方法1提取柑橘黄龙病病原DNA的PCR检测准确率最高。
[关键词] 柑橘黄龙病；柑橘总DNA ；PCR

Comparicon of Extraction Methods of DNA from
Citrus Huang long bing Pathogen
Student: Chen-dayun College of Agriculture, Yangtze University
Tutors: Zhang-songbai College of Agriculture, Yangtze University
Fan-guocheng Institute of plant protection,Fujian-Academy of Agriculture
Sciences

[Abstract ] The PCR test of citrus Huang long bing was affected by some substance in citrus including polysaccharides , Phenolic,tannic acid.pigment and so on．It was necessary to establish a simple method to extract high purity and integrated construct ion citrus DNA. Two method were used in this experiment.there were Alkaline cleavage / alcohol method,CTAB method.The results showed in these methods，CTAB was the best one in the two．

Key words ： Citrus Huanglongbing ； Citrus DNA ；PCR

1 前言
柑橘是世界第一大水果,在中国、巴西、美国等138个国家(地区)都有种植,总面积800多万hm2,年产量约1.2亿吨,约占世界水果总产量的22%;柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing Disease，HLB)是世界范围毁灭性的柑橘病害。此病对整个柑橘生产造成了巨大的经济损失。黄龙病主要分布于亚洲东南部地区，非洲的南非及东非，美州巴西等40多个国家和地区。南非1929年报道有HLB发生，住1932～1946年间及1958年以后，相继严重发生，lO多万株脐橙和伏令夏橙受害，有些地区的损火达30～100％：菲律宾1962年损火柑桔100万株以上：印度东北州几乎所有柑桔硝的宽皮桔都有HLB发生：泰国的HLB最早于20世纪60年代发生：印度尼西亚、越南、尼泊尔和日本等国在20世纪90年代后部有HLB发生的报道[43]。90年代末，美国对柑橘黄龙进行普查中发现了该病的传病媒介柑橘木虱，但未发现柑橘黄龙病。2005年9月，在美国佛罗里达南部发现黄龙病，严重威胁着佛罗里达90万hm2柑橘生产[40]。
柑橘黄龙病是我国柑橘生产上最具毁灭性的病害,其发生的历史长,分布广,危害大。半个多世纪以来,严重地危害着广东、广西和福建3省区柑橘事业的发展。70年代末,四川省攀西地区及江西赣州地区也先后发现柑橘黄龙病[44],到80年代中期,柑橘黄龙病己在我国的广东、广西、福建、海南和台湾的产区广泛蔓延,并在浙江、云南、贵州和湖南相继发生[45]。其中,广西重发生面积较少,零星发生占大多数;福建表现为南重北轻、低海拔重高海拔轻、老区重新区轻;还表现出树龄越大,发病率越高的现象;初结果树和幼龄树最为敏感。
1983—1984全国组织的柑橘黄龙病普查中,发现浙江、云南、四川、江西、湖南等省有黄龙病和柑橘木虱发生,但均属零星分布[46]。近年来,由于全球气温持续变暖,柑橘木虱活动范围扩大,柑橘种植资源的频繁调运,黄龙病的发生在我国有逐渐扩大的趋势。1996一2000年,贵州省28个县(市)进行了黄龙病的调查和鉴定,结果表明发生黄龙病的县(市)有12个,分布在北盘江!南盘江及其支流,下游的红水河谷地带,黔东南州的都柳江流域;较80年代报道新增3个,黄龙病及柑橘木虱并发区新增7个,发病从零星到全园发病不等,并呈逐渐蔓延的趋势[47]。2000—2004年浙江省开展的该省柑橘黄龙病疫情普查结果显示,在短短的4年时间内,疫情发生从东南部老病区(温州)!东南新病区(台州)!西部新病区(丽水)等3市5县(市、区)60个乡镇增加到20县(市、区)185个乡镇(农、材场),发生面积由1832.5hm2扩大到10650.9hm2,病株数从72.9万株上升到187.1万株,蔓延速度极快,并呈快速流行和向北蔓延趋势,其传媒昆虫柑橘木虱分布范围己扩散至温州、丽水、台州、金华、宁波、蔺州等6市36县(市、区)柑橘产区[48]。黄龙病己广泛分布于我国的柑橘产区,且其流行区的北部边缘是不稳定的,己有几例明显的向北扩展。上世纪70年代,在广西桂林及其以北地区,不见柑橘木虱,曾见个别病树,不见蔓延,而到80年代,柑橘木虱和黄龙病可见于广西全境。据不完全统计,在我国的广东、广西和福建等地,因感染黄龙病有4000多万株病树被砍除。如广东杨村柑橘场,1978年开始黄龙病严重危害,每年清除病树200-300公顷,1972年以前种植的96万株大树几乎全部被毁,1972年以后种的植株损失20万株,总产量由1977年的2.15万吨降为1952年的0.53万吨[41]。广西自治区的柳州市,1977年柑橘产量达到0.57万吨,因受柑橘黄龙病的危害,产量逐年下降,至1982年仅有0.14万吨[42]。近年来,黄龙病在广东、广西、福建等省的柑橘产区,仍然发生严重,且有不断蔓延的趋势,对我国的柑橘产业构成了很大的威胁。在浙江,80年代柑橘木虱和黄龙病仅见于欧江以南,而2000年调查发现欧江以北的台州、丽水都有黄龙病流行[49]。在湖南,80年代,黄龙病主要分布于湘南的郴州地区,2006年的调查研究结果显示,湘北地区亦发现了黄龙病[50]。由于黄龙病对柑橘生产的严重影响,至今仍被农业部列为植物检疫对象。随着气候变暖,黄龙病流行区可能向北扩展,加强黄龙病调查,特别是与黄龙病流行区北部边缘相邻地区的调查是需要的,以期为及时防控提供依据。
黄龙病对柑橘有毁灭性的危害，柑橘发病后，整株矮化，生长缓慢，轻者严重影响产量和品质，重者则造成树体死亡。该病病原为细菌，可通过嫁接传播，自然传播媒介为柑橘木虱。
柑橘在我国大部分地区都有种植，总产量居世界第3位。目前许多柑橘产区陆续报道受到柑橘黄龙病的毁灭性危害。而对局部柑橘黄龙病不能及时有效的作出判断，往往大面积发病后才能做出诊断，延误了对病情的防治，造成巨大的损失 ，因此快速准确诊断就成了防治的前提。
黄龙病在田问的症状十分复杂，但主要有斑驳型黄化、均匀黄化、缺素型黄化和“红鼻果”等4种症状。其中斑驳型黄化是黄龙病的典型症状，可用于田间的目测。到目前为止，共制备了13种单克隆抗体，由于其特异性很强，可以用于不同株系的鉴定和检测。随着生物技术的发展与应用，Villechanoux等和Planet 等分别制得了In-2.6和As一1.7探针，可分别用于检测黄龙病亚洲种和非洲种。但分子杂交耗时长，自动化程度低，检测结果稳定性差，实验条件难掌握。
柑橘黄龙病的检测是一个从传统生物学向分子生物学、从定性检测到定量检测的发展过程。主要包括症状诊断、指示植物鉴定、电镜观察、血清学检测、分子生物学检测等[11]。
目前与黄龙病相关细菌性病原的检测主要采用PCR技术，1991 年Weisburg 等[21] 首次测定了柑橘黄龙病菌的16S rDNA 序列,利用DNA 杂交和PCR方法检测柑橘黄龙病菌的分子生物学技术得以迅速发展。Hung等[22]克隆了台湾柑橘黄龙病菌一段0.24kb的DNA片段,并以生物素标记制成探,能特异地检测台湾、中国大陆、日本、越南、菲律宾、马来西亚、泰国、印度和沙特等地的黄龙病,但对南非的黄龙病则无反应。Jagoueix等根据其亚洲种以及非洲种16SrDNA序列，成功设计引物OI1／OA1／OI2c，能扩增出大小为1160bp的条带,并用x I酶切来区分黄龙病这两个种。之后，Teixeira等根据16S r DNA序列设计的GB1／GB3引物能特异检测黄龙病美洲种，扩增 片断大小为1027bp而Hocquellet等根据韧皮杆菌的操纵子基因序列，成功设计 了引物A2／J5，通过PCR产物的大小区分黄龙病亚洲种和非洲种。鉴于PCR 检测具有灵敏、快速、便捷等特点,已成为柑橘黄龙病菌检测的主流技术, 主要包括常规PCR、巢式( 或半巢式) PCR 以及能对黄龙病菌进行定量的竞争性定量PCR 和实时PCR 等。常规PCR 对设备和技术要求不高, 一般的分子生物学实验室都可开展, 应用也最为普遍[ 23- 30] 。由于黄龙病菌在柑橘(特别是带菌但尚未显症) 病株中含量低、分布不均匀, 经常需用检测灵敏度更高的巢(或半巢式) PCR 加以检测[31] 。田亚南等首次利用竞争性定量PCR 技术对黄龙病的介体及寄主进行了定量检测, 表明柑橘木虱含菌量最高, 长春花次之, 而柑橘最少。由于实时PCR技术具有快速、特异、敏感、重复性好等优点, 已取代了竞争性定量PCR, 并被广泛应用[32-33] 。
由于柑橘黄龙病的病原细菌至今仍未培养成功，对该病原的培养性状、 生态特性以及生理生化性状等细菌传统分类学方面的特性仍然知之甚少，所以柑橘黄龙病检测诊断技术的发展对于防止黄龙病疫情扩散尤为重要，在众多检测技术中非常重要的利用PCR技术来检测柑橘黄龙病，但由于柑橘植物组织中富含多糖、酚类、单宁、色素等物质,它们的存在严重干扰了柑橘黄龙病PCR检测的准确性. 影响柑橘黄龙病室内检测的因素有很多，主要有检测基因片段的选择、引物的灵敏度、DNA提取质量、检测部位等因素。其中，病组织总DNA的提取质量对检测结果影响较大。因此柑橘组织DNA的提取方法也显得尤为的重要。目前提取植物体DNA的方法也有很多，如十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法 ，SDS法 ，果胶酶法 ，NaOH碱裂/醇沉法等。
PCR法可快速准确的检测柑橘黄龙病，是目前柑橘黄龙病快速检测的主要方法之一，但PCR法DNA的纯度要求相对较高，因此一个好的柑橘总DNA提取方法就成了准确检测柑橘黄龙病的基础。本实验选用了2种不同的柑橘总DNA 的提取方法，比较结果如下 。

2材料与方法
2.1供试材料
福建省农科院埔垱柑橘黄龙病研究种植基地柑橘叶片。
2.2试剂及仪器
2.2.1主要试剂
2%CTAB 、蛋白酶K 、β-巯基乙醇 、0.5%氢氧化钠 、2xTaq PCR MasterMix、苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1、DDH2O 、无水乙醇。
2.2.2主要仪器
石英砂、电子精密天平、摇床、真空抽干机、粉碎机、电磁炉、电热恒温水箱、离心机、PCR仪、电泳仪、 紫外分析仪、紫外分光光度计、冰箱等。
2.3试验方法
2.3.1病害症状和样品采集
病害症状：柑橘类在生长的各时期,都能感染黄龙病,但各时期的感病性是有差别的。一般7-8龄以下的结果幼树最易感病,苗木、未结果的幼树和5龄以上的老树则较少发病。开始发病的柑橘在树冠中出现黄梢。黄梢的叶片有3种类型,即均匀黄化型、斑驳黄化型和缺素型。感染后，全年均可表现症状。在田间以夏梢、秋梢发病居多,其次是春梢,且症状表现没有夏、秋梢典型。黄梢一般先在树冠顶部出现,然后逐渐扩散,经过1一2年后全株发病。有的在嫩叶期不转绿而直接均匀黄化;有的叶片转绿后,从叶片主脉和侧脉附近、基部或边缘开始发病,并扩展成黄绿相间的“斑驳”,最后全叶均匀黄化;有的在中脉和侧脉附近保持绿色而叶肉黄化,出现类似缺锌、缺锰的缺素症状"病叶在晚秋容易脱落,落叶后枝梢逐渐枯死。病枝上抽发的新梢较短,叶小,树冠稀疏,植株矮化。柑橘树感染黄龙病并表现症状后,第二年开花早而多,大多细小,畸形,不结果,花瓣多短小肥厚,颜色较黄。常形成无叶花穗,花小畸形,易落果。发病初期,果一般不表现显著的症状"病情发展到一定程度后,病树的果一般容易脱落,果实小而皮硬,而且果皮与果肉紧贴不易剥离,果实成熟较早,色淡、汁少、味酸,种子不正常。有的果实呈畸形,着色呈黄绿不均匀状。有的品种如福橘的果蒂附近着色,其余部分青绿色,人们称之为“红鼻果”。柑橘黄龙病发病初期,根一般不腐烂,至叶黄化脱落比较严重时,则大多数病树的须根已经腐烂,须根的腐烂是从尖端以上任何部分开始。腐烂细根皮部与下层组织易分离。至发病后期,侧根和主根亦全部腐烂,腐烂的皮部碎裂并与木质部分离。细胞生物学研究表明,韧皮部有时出现坏死块,韧皮部增生,维管形成层有时可见不正常生长以及出现淀粉粒的不正常积累[51.52]。另有报道称,原生质膜内陷,叶绿体中的类襄体失常以及线粒体崩溃,可能是由于毒素或者是激素的影响,干扰其代谢活动[53]。

样品采集：福建省农科院埔垱柑橘黄龙病研究种植基地柑橘叶片，在采样点选取有代表性的5～6黄化的叶片，样品采回后，立即将叶片用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，然后将叶片晾干。然后将每个样点的叶片主叶脉剪下剪成小段等量分装在两个2ml的EP管中，编上对应编号1～17与a～q，然后放入超低温冰箱中保存备用。

2.3.2 CTAB法提取样品总DNA
（一）剪叶脉：将叶片去掉只剩下主脉，再将其剪碎，装入2mLEP管中
（二）抽干：放在真空抽干机抽干两天
（三）粉碎：将样品用粉碎机粉碎成粉末状，将粉末1.5mLEP管中
（四）迅速加入mL CTAB 提取液（PH=8.0，用前加入1.0%β-巯基乙醇，1.0%蛋白酶K），轻轻振荡混匀后于65℃水浴1h，每隔10min分钟轻摇1次
（五）冷却后18℃，12000rpm离心10min，提取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）轻柔颠倒混匀使乳化10min后于18℃，12000rpm 离 心10min，回收上清液
（六）在回收的上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1),轻轻混匀，4℃，12000rpm离心10min，回收上清液
（七）在回收的上清液中加入等体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(p h=5.2),4℃，12000rpm离心10min,弃去上清液收集沉淀
（八）用75%乙醇洗涤沉淀物数分钟共2-3次，然后将沉淀物于室温或64% 以下恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥
（九）加入30ｕL DDH2O溶解，冻于-20℃贮藏备用
2.3.3碱裂/醇沉法提取样品总DNA
称取0.05g样品于1.5mL EP管中，加入500ｕL 0.5moL/L N a OH溶液，加入0.5g石英砂，然后将其放置在摇床中220r/min摇1h，然后在沸水水浴1min，取出后加入3M N a Ac(PH=5.2)333ｕL中和，颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中，加入与上清液等体积的异丙醇，混匀后12000rpm离心10min，弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀物数分钟共2-3次，然后将沉淀物于室温或64%以下恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥
加入30ｕL DDH2O溶解，冻于-20℃贮藏备用。
2.3.4 紫外分光光度计测定样品总DNA浓度
对于样品DNA浓度，纯化的PCR扩增产物和抽提的质粒DA均采用紫外分光光度计。具体的做法是：用紫外分光光度计测定DNA样品的OD260和280，的值来估测DNA样品的纯度。根据DNA含量计算公式，对于dsDNA,1个OD260相当于50 ug/m L,计算出DNA样品的浓度[54]。
2.3.5样品总DNA完整性检测
DNA是否完整关系到之后实验的准确性，样品总DNA完整性可通过琼脂糖凝胶电泳来检测。琼脂糖胶的配制先配制电泳储备液5 X TBE(54gTris碱+27.6g硼酸+3.6g EDTA用双蒸水定容至1000mL,于4储备)用时稀释成1 X TBE准确称取所需琼脂糖放人锥形瓶中,加入一定量的电泳缓冲液,配制胶的质量浓度1%[55]。
操作步骤：
(1) 称取 0.4g 琼脂糖凝胶干粉，加40ml 1X TAE电泳缓冲液，加热使琼脂糖熔化均匀，取出后室温冷却至 50～60 摄氏度；加入5ul溴乙锭（EB);
(2) 将胶倒入制胶槽中，并插入样品梳，待充分凝固后拔出样品梳；
(3) 将凝胶板放入电泳槽中，加入 1 X TAE 电泳缓冲液，使液面略高于凝胶1 X TAE电泳缓冲液；
(4) 5ulDNA 样品加1 ul DL15000 DNA marker(含溴酚兰染色剂)，搅拌均匀后全部加入凝胶板的样品孔中；
(5) 打开电源开关，电压 100V，电泳约 30～40 分钟,在紫外分析仪中观察DNA区带；DNA 的各条带是否拖尾、荧光密度，估计待测 DNA 在凝胶中的完整性、含量和浓度。
3 结果与分析
3.1抽提样品DNA浓度和纯度
浓度测定仪检测的不同提取方法提取的柑橘总D N A浓度、纯度结果 如表1、2 。方法l提取的总D N A平均浓度为663.418ng／u L，OD260／OD280比值在1.82左右，DNA浓度很高，纯度也很高，说明方法1能够提取到大量的柑橘总DNA，且纯度很高，原因可能是方法2在提取过程中不仅加入了蛋白酶K去蛋白质还经过多到工序最后还反复用乙醇洗涤来去杂质。方法2提取的总D N A平均浓度为105.847ng／u L,OD260／OD280比值在1.48左右，说明方法2能够从植物组织中提取到一定量的DNA，而且纯度很低原因可能是虽然在最后也经过了用乙醇去杂质，但在提取过程中没有加入蛋白