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兽医生物技术实验手册

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兽医生物技术实验手册

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兽医生物技术实验手册

动物医学院
细胞生物学实验室自编手册

2010.11

目录

PCR技术及DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化..................1

DNA概鹃戈副景概旗想肠面鲜吮率受幸袜笛际龋桥想柿磨谆赁耿床借瞬艰地撅烙攻美伐锚帧温是铝矾诲弃吩腿填撼令札轩蝎鲁拧估卓碰缄砍赔缀淫氰睫宴迄吝妊浓霜吩甜魄禹耐卸坏把豺陪音段违则魂咕乃娜疲勘友的至蚀施吝讫菇糠逞茫逆肝填套榨昧牙坞湃库复阶我复笨镇笋芭锻娠猫镀洞鄂瀑剔奠薪垒滩刃炮篡庶铰搔嫌番铲勒揪噬燃腕扁孜褪哈庞辉疟撇洲屹茹禾拱薪耀绊与哲粳剂即茄神安吞蔓垃豪烈回萨等磐淑郭叙揭黄存忻弟婆嗓块内佛唁团舶装负蛛邵若洋搞眺笼捐舷臭观吸佰霄晋娃扼髓廷列蛰捞调荤敖肯晨笨编三厨殴枝握假拌仓重讣些渐樱乒起崖挺朗馈串末朵寥卉裂臼存乙丧毙算兽医生物技术-protocal闽铁饮聚儿猫襄折忍往啸缕哈阁下仲蚂歉跋瓶豁缴证宅洽磷捂邮辆舔瓮鸯罪叁掂全匀盛衰链波婚耘唁辕嗅镶旗籽搂历昨靠柿豺团蚁朽伐幼蝉除淫降羊悲悄溪趁控滔丧郎谢吁萨黍耙英蔡咨么沿闲蹄琼始艺工巧单晋供缅竞龚槛枪浊疙删前柬郝疤火淋晋丛昼厂瞪醚苗藤祈谚享掳扇循挑酌舌擒凳滤讨动遂夹是犹班蜒铭栽喳礁联翌锭卢侥驳示蔑纯镁紫钧穴挡碰喷滚套韵阶臻窜熔也搂临拢瑚亡专蘸巧医租撒在遵径梨降跟烫馒怀孰癣母舌丰峡痊钦讹戎剩宁崎育骗主半稠蝉冲衡变郑签警架间跑火伶哭触恬碱遍霉王机诅痹冯善牙冉顾诺旅节渠矮涕必圣忧蕾饰絮曝便古埂秦购心漆君削亚亭完链愚膝

兽医生物技术实验手册

动物医学院
细胞生物学实验室自编手册

2010.11

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目录

一、 PCR技术及DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化..................1

二、 DNA限制性酶切反应、DNA酶切片段的回收与鉴定..............4

三、 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA连接转化………………………7

四、 质粒DNA的提取及鉴定……………………………………………...10

五、 蛋白质的原核表达…………………………………………………….13

六、 蛋白质电泳………………………………………………………...…..14
注意事项

实验注意事项：

1． 对所有样品进行严格标记，避免混淆
2． 酶及蛋白等样品一定要低温放置
3． 加样品时注意更换枪头，避免对试剂或样品的交叉污染
4． 接触DNA荧光嵌入染料等有害物品时一定要戴手套
5． 注意将反应样品混匀

实验室仪器使用注意事项：

1. 使用离心机时，一定要注意平衡。
2. 注意正确使用移液枪，设置量程时，禁止超过最大量程。

细菌操作注意事项：

中心原则：
1. 保护操作人员不受细菌感染。
2. 防止使用的细菌受到其它微生物（比如：真菌、其它细菌等）的污染。

本实验课使用的大肠杆菌均是经过人工改造，供实验室研究用的菌株。和野生型的菌株相比，这些菌株的毒力明显减弱，但仍应视为有害物质。尤其是我们使用的许多大肠杆菌均转入了表达抗生素的质粒，因此严禁将这些大肠杆菌释放到环境中。

注意事项：
1. 在实验室里禁止吃喝，不要将笔、手指及其它任何物品放入口中。
2. 如果不慎洒溅出了细菌液，需立即用纸将菌液吸干，并对细菌污染区域做消毒处理。
3. 禁止用手直接接触菌液。
4. 正确并及时标记所有培养细菌的试管和培养皿。
5. 拿细菌培养试管时，不要只拿盖子部分，因为盖子盖的不紧，试管部分容易脱落，造成细菌污染。
6. 如手等部位有伤口，应将伤口部位包扎好。
7. 细菌液必须经过消毒处理之后，才能倒掉。

实验一、PCR技术、DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化
实验原理：

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物,在耐热性DNA聚合酶(Taq酶)作用下将位于模板DNA上两引物间特定DNA片段进行一种指数级增长的复制过程。PCR反应体系由模板DNA、引物、耐热性DNA聚合酶、底物(四种dNTP)、缓冲液和Mg2+等组成。其操作过程为变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是加热条件下模板DNA双链间的解离,退火是降低温度使模板DNA与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg2+等存在下扩增特定的DNA片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板,因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤,特定DNA片段的分子数目增加一倍。耐热性DNA聚合酶的应用使PCR循环反应可自动进行,提高了反应的特异性和效率。引物设计是PCR技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。
PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术,具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，如应用于DNA克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。
DNA凝胶电泳常用的是琼脂糖电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的重要方法，该技术操作简便快速。其原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭Ethidium bromide 或Goldview）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。
琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1％琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。除能确定DNA片段的大小外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

实验内容：
1. 用特定的引物通过PCR技术将鸡贫血病毒VP3基因扩增出来；
2. DNA凝胶电泳检测PCR产物的大小；
3. 纯化出PCR产物并用凝胶电泳检测纯化结果。

实验步骤：
（一）PCR
PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（含Mg2+)。
1. 在0.2ml离心管中配制反应体系；
下面是一个50μl的PCR体系（供参考，可根据情况调整）：

试 剂
实验管(μl)
对照管(μl)
10×Taq酶缓冲液
5
5
dNTP混合液(10 mM)
1
1
引物1 (10 nM)
1
1
引物2 (10 nM)
1
1
模板DNA
1

Taq DNA聚合酶(lU/μl)
1
1
去离子水
40
41
有时候还需要加入MgCl2，但有的Buffer中已加入了MgCl2（如TaKaRa的Buffer），就不需要在PCR体系中加MgCl2了。
2.  混匀每只PCR小管，然后短暂离心；
3.  将PCR小管放到PCR仪器中，设定程序进行扩增；
下面是一个参考程序循环：
(1) 预变性 94℃ 2min
(2) 变性 94℃ 30s   
(3) 退火 62℃ 30s
(4) 延伸 72℃ 45s
（2）到 (4) 步骤循环30次
(5) 终延伸 72℃ 10分钟
4. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

（二）DNA凝胶电泳

1. 准备： 取有机玻璃胶槽，洗净、晾干、安装好（不同型号的电泳槽有不同的安装方法），水平放置，注意防止漏胶。将梳子插入到胶槽的定位槽中。
2. 配置2% 琼脂糖凝胶板： 称取2g agarose（琼脂糖），置于250 ml 锥形瓶中，加入100 ml 1×TAE（含GV 4 ug/ml），封口、加热使其全部溶解；
3. 灌胶：将熔化的琼脂糖凝胶冷却至约65℃时,小心地将凝胶倒入胶槽上，控制灌胶速度，使胶缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm。
4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子；
5. 将5μl PCR扩增产物样品与1μl 6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁）；
6. 电泳加样完毕后将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源， 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。

(三) PCR片段的纯化 (DNA纯化试剂盒)

1． 将PCR产物加入1.5ml的离心管中，并加入2倍体积的DNA Binding Buffer，漩涡混匀；
2． 将混合物全部转入新的回收柱中（下面带套管），12000rpm离心1min；
3． 弃掉套管里面的液体，加入200μl Wash Buffer于柱中，12000rpm离心1min；
4． 重复第三步；
5． 弃掉套管，将柱子套入一个新的1.5ml的离心管中，并向柱中加入30μl Elution Buffer，12000rpm离心1min；
6. 弃掉柱子，1.5ml离心管中的液体即为纯化好的PCR产物；
7. 取2μl PCR纯化样品，凝胶电泳检测纯化结果。
实验准备：
（一）主要试剂
1. 1×TAE的配制：24.2g Tris、5.71ml冰乙酸、10ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)配制成50×TAE（100ml），然后稀释至1×TAE。
2. 6×上样缓冲液：0.5%溴酚蓝，0.5%二甲苯青，0.003M EDTA(pH 8.0),40%甘油。
3． PCR片段的纯化试剂盒。
（二）主要仪器
PCR仪、DNA电泳槽、电泳电源、离心机、照胶仪（观察DNA条带）
注意事项：
DNA荧光染料均是DNA诱变剂具有致癌能力,虽然Goldview比EB而言安全性上提高了很多，但在配制和使用时都应戴手套,并且不要把Goldview洒到桌面或地面上。

思考题：
1. PCR的原理？
2. PCR失败的可能原因有哪些？
3． 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

实验二、DNA限制性酶切反应、DNA酶切片段的回收与鉴定
实验原理：
限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段。因此，在克隆重组质粒DNA时，人为在DNA片段两端加上两个特定的限制性内切酶位点（DNA片段中没有的位点），利用这两个酶分别切割DNA片段和载体，然后将DNA片段插入载体中构建成新的重组质粒。
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同，如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA）和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时迁移速度顺序为：cccDNA > IDNA > ocDNA 。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）或GV染色，在紫外光下可以检出DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置，回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

实验内容：
1． 将上节课PCR得到的鸡贫血病毒VP3基因的 DNA片段，用DNA限制性内切酶BamHI和SalI进行切割、纯化并用凝胶电泳检测纯化结果。
2． 将载体质粒用DNA限制性内切酶BamHI和Xho I进行切割，用DNA凝胶电泳对得到的DNA片段进行分离，切出含目的DNA片段的凝胶块，再将DNA从凝胶块中提取出来，DNA凝胶电泳检测DNA回收结果。

实验步骤：
1. 酶切反应：

VP3-PCR产物(μl)
载体pGEX-1ZT
(μl)
PCR产物
25
0
载体质粒
0
20
10X T Buffer
5
0
10X K Buffer
0
5
Bam HI
1.5
1.5
Sal I
2
0
Xho I
0
2
去离子水
16.5
21.5
总体积
50
50

按上面的酶切体系分别在0.2ml PCR管中加入以上试剂，混匀，37℃放置1h。

2．载体质粒酶切片段的提取：
2.1．按实验一所述，配置2% 琼脂糖凝胶板。
2.2．将50μl载体质粒酶切产物样品与10μl6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中；
2.3．150V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。
2.4．用一灭菌刀片，在紫外灯下，切下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管（1.5ml）中。
2.5．用DNA 片段胶回收试剂盒，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片段。
基本步骤如下：
① 向离心管中加入3倍体积的溶胶液，于55℃水浴中放置5-10min加热助溶；
② 待全部溶解后将其全部转入胶回收离心柱中，12000rpm离心1min，弃掉套管里面的废液；
③ 向柱里加入200ml Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃掉套管里面的废液，重复此操作一次；
④ 弃掉套管，换一个干净的1.5ml离心管，加入15ml的洗脱液于柱中，12000rpm离心1min，弃掉柱子；
⑤ 离心管中的液体即为回收产物。

3． PCR酶切产物的纯化
按实验一所述进行。

4． DNA提纯产物凝胶电泳的鉴定
4.1． 将PCR和载体质粒酶切回收产物进行琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：60-150V,10-20分钟）
4.2. 紫外分析仪检查电泳结果，确定回收到目的DNA片段。
实验准备：
（一）主要试剂
1. 1×TAE的配制：24.2g Tris、5.71ml冰乙酸、10ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)配制成50×TAE（100ml），然后稀释至1×TAE。
2. 6×上样缓冲液：0.5%溴酚蓝，0.5%二甲苯青，0.003M EDTA(pH 8.0),40%甘油。
3． PCR片段的纯化试剂盒以及胶回收试剂盒
（二）主要仪器
DNA电泳槽、电泳电源、离心机、照胶仪（观察DNA条带）、水浴锅

注意事项：
1． 蛋白和酶在温度升高时容易失活，因此注意将DNA内切酶低温放置，勿将其放置室温。
2． 酶的保存液中含有甘油，加酶时吸头深入不可过深。每加完一样要换一个吸头，避免酶之间污染。
3． 紫外光对DNA分子有切割作用，从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm), 以减少紫外光对DNA的损伤。

实验三、大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA连接转化
实验原理：
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油,于-70℃保存半年。
连接：目的DNA片段和适当载体的连接。利用限制性核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，由DNA连接酶催化这两个双链DNA片段的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程，DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达。 质粒一般携带有抗性基因（比如氨苄青霉素Amp），可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞, 在含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素能力而死亡。

实验内容：
1． 制备大肠杆菌感受态细胞用于DNA的转化
2． 将上节课得到的VP3 DNA酶切片段和载体酶切片段，在DNA T4连接酶的作用下，进行连接。
3． 将上述DNA连接产物导入制备好的大肠杆菌感受态细胞中。
4． 将大肠杆菌混匀涂布于含抗生素的LB 平板上，进行筛选。

实验步骤：
1． 大肠杆菌感受态细胞的制备：
1.1. 从新活化的E.coli DH5α菌平板上（预先准备好）挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养约2-3 h至对数生长期(OD600 = 0.4-0.6)；
1.2. 将细菌培养液转移至50 ml 离心管中，冰浴10 min；
1.3. 4℃，3000rpm 离心10 min，弃上清；
1.4. 用15 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴5min；于4 ℃，3000 rpm 离心10 min，弃上清；
1.5. 用20ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴30min；于4 ℃，3000 rpm 离心10 min，弃上清；
1.6. 用2ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体（动作要轻），每管分装50 µl，立即使用或置于-70 ℃冰箱保存。

2. DNA 片段的连接与转化：
2.1． 反应体系：外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比（3-5:1）混合

pGEX-1ZT
自连对照(μl)
VP3/pGEX-1ZT
(μl)
VP3-PCR产物
0
5
自切载体质粒
1
1
10×buffer
1
1
去离子水
7
2
T4连接酶
1
1
总体积
10
10

2.2. 25℃（室温）连接1h。
2.3． 从-80 ℃冰箱中取出感受态细胞，冰上复苏5 min至细胞液融化；
2.4． 取4 μl连接产物加入到感受态细胞中（复苏和新鲜制备），混匀，冰上放置30min；
2.5． 42℃热激90s，立即放入冰上冷却5 min；
2.6． 加入0.9ml LB 液体培养基， 37 ℃振荡培养45 min；
2.7． 离心5000 rpm, 1min，弃上清，余200ml LB，混匀涂布于含抗生素的LB平板上，等平板表面的液体被吸收后，倒置放入37 ℃温箱，培养过夜。

实验准备：
（一）主要试剂
1． LB液体培养基： 100ml
蛋白胨(Tryptone)： 1 g
酵母提取物(Yeast extract)： 0.5g
NaCl ： 1 g
蒸馏水 加水至100ml
2． LB固体培养基：液体培养基中加1.5g/100ml琼脂粉，高压灭菌。稍冷却后倒入平皿中, 待凝固后备用。
3． 0.1mo1／L CaCl2：
1.1098g 无水CaCl2，加蒸馏水补齐至100ml。
4． 0.1 M CaCl2/15%甘油：1.1098g 无水CaCl2、15ml甘油，加蒸馏水至100ml。
5． 在LB液体和固体培养基中，加入Amp。
所有物品均121℃ 20min高压灭菌。
（二）主要仪器
高压灭菌锅、超净台、天平、恒温摇床、恒温培养箱、紫外分光光度计、水浴锅
注意事项：
1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。
2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。
3． 应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD600不应高于0.6。
4. 平板在37 ℃温箱放置时，培养基面应朝上。
5． 标记平板时，一定要标记在培养基面，切勿标记在盖子上。

思考题：
1. 在载体自连对照组的平板上长出克隆说明了什么？
2. 如果在VP3-pGEX-ZT连接组的平板上未长出克隆，哪些因素会造成实验的失败？
3． 怎样确定制备的感受态细胞转化效率的高低？

实验四、质粒DNA的提取及鉴定
实验原理：
分离质粒DNA的方法是依据其与染色体DNA分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭环状结构的特点来进行。目前常用的提取质粒的方法有碱裂解法、煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法,利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，细菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA发生变性，但是染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。
当PH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性的蛋白质会形成大量沉淀，染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上，离心后，染色体DNA与蛋白质等一起沉淀下来而被除去，质粒DNA留在上清中。
DNA片段是通过两个特定的限制性内切酶插入到载体里面的，因此，若用同样的两种内切酶去切割重组质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳会看到跟原来的DNA片段和载体片段大小相同的两条带，说明成功构建了重组的目的质粒。

实验内容：
1． 从VP3-pGEX-1ZT连接组平板上，选取8个单克隆菌株，接种于液体培养基中。
2. 从培养的细菌中提取质粒DNA。
3. 用DNA限制性内切酶BamHI和XbaI对提取的质粒DNA进行切割用on1碱裂解法、煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法。。
4. 凝胶电泳检测是否有VP3大小的片段产生。

实验步骤：
(一). 质粒DNA的提取
1. 挑取单菌落接种到4 ml含Amp的LB培养基管内，放37℃培养箱内振荡培养过夜；
2. 取2ml菌液移至2ml离心管中， 12000rpm，离心30s（沉淀菌体）；
3. 弃上清，尽量吸干或扣干液体，然后往沉淀中加入100μl预冷的SolutionI,剧烈振荡将菌体完全打散；
4. 加入新配制的SolutionII 200μl，温和颠倒离心管5次混匀，室温放置3-5min，此时液体应由混浊变为透明粘稠；
5. 加入预冷的Solution III 150μl，温和颠倒离心管5次混匀，冰浴3-5min，此时应形成一些白色沉淀；
6. 将上述细菌裂解液离心，12000rpm，5min；
7. 用P200加样枪将400μl含有质粒DNA的上清移至另一离心管中，若溶液混浊或含有漂浮物，重复步骤6-7；
8. 往含有DNA的液体中加入等量的异丙醇（400μl），振荡混匀，室温放置2min，以沉淀菌体的质粒DNA；
9. 离心 12000rpm 5min以收集沉淀的DNA；
10. 弃上清 ，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干；
11. 往沉淀中加入200μl 95% 乙醇，温和颠倒离心管5次（洗涤沉淀出的DNA）；
12. 离心 12000rpm 2min；
13. 用P200加样枪尽量去除上清，但要小心不把沉淀DNA吸走；
14. 用离心管敞盖，室温15min干燥，DNA由透明变为干浊；
15. 往干燥的DNA中加入20μlTE（含20ug/mLDNase-free RnaseA）轻轻用加样枪吹打，确保DNA充分溶解。

(二). 质粒DNA的酶切鉴定

1. 标记离心管。
2. 按下列表格准备酶切反应体系。
VP3/pGEX-1ZT(1-6)：提取的6个待检测的VP3/pGEX-1ZT重组质粒；
VP3/pGEX-1ZT：已验证过成功构建的VP3/pGEX-1ZT质粒，作为阳性对照，该质粒由助教提供。对该质粒分别进行不酶切、双酶切（Bam/XbaI）、单酶切（Bam或Sal）；
pEGX：载体质粒，作为阴性对照；
VP3-PCR产物：作为插入DNA片段大小的对照

VP3/pGEX-1ZT(1-8)
Bam /XbaI
(μl)
VP3/pGEX-1ZT Uncut
(μl)
VP3/pGEX-1ZT（+）
Bam/ XbaI
(μl)
VP3/pGEX-1ZT（+）
Bam HI
(μl)
VP3/pGEX-1ZT（+）
XbaI
(μl)
pGEX-1ZT
Bam /XbaI
（μl）
VP3 PCR
质粒DNA

2
2
2
2
2
2
0
PCR 产物
0
0
0
0
0
0
5
10×buffer
1
1
1
1
1
1
0
去离子水
5
7
5
6
6
5
5
Bam HI
1
0
1
1
0
1
0
Xba I
1
0
1
0
1
1
0
总体积
10
10
10
10
10
10
10
3. 按上面的酶切体系分别在0.2ml PCR管中加入以上试剂，混匀，37℃放置1h。
4. 在每个试管中加入2ml 6X DNA 上样缓冲液，跑2%的凝胶电泳，检测酶切结果。

实验准备：
（一）主要试剂
1． Solution I：高压灭菌或过滤除菌 4℃贮存
葡萄糖 50 mM
Tris-HCl (pH8.0) 25 mM
EDTA (pH8.0) 10 mM
2． Solution II：SDS/NaOH 临用前新鲜配制
NaOH 0.2 M
SDS 1%
3. Solution III 100ml
5 M 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
去离子水 28.5 ml
4. TE Buffer (pH8.0) 高压灭菌，4℃贮存
Tris-HCl (pH8.0) 10 mM
EDTA (pH8.0) 1 mM
5. 95%乙醇、异丙醇
（二）主要仪器
恒温摇床、离心机、高压灭菌锅、天平
注意事项：

1. 质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤；
2． 加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体；
3． 加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性。

思考题：
除了酶切鉴定外，还有哪些方法可以帮助确定VP3基因是否插入到pGEX-1ZT载体中？

实验五、蛋白质的原核表达
实验原理：
设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。
载体PGEX是常用的原核表达载体，载体转入宿主菌表达时，由于lacI基因表达产生阻遏物，结合在标签基因GST的T7启动子上，T7 RNA聚合酶的表达受控于IPTG诱导的启动子，因此在未加入IPTG前，融合基因的表达受到阻遏，并不表达。而加入诱导物IPTG后，由于IPTG与阻遏物有强烈的相互作用，因此使T7启动子自由结合RNA聚合酶，形成转录起始复合物，开始转录表达。

实验内容：
1． 过夜培养含重组质粒（VP3/pGEX-1ZT）和含载体质粒 (pGEX-1ZT) 的细菌。
2． 诱导蛋白的原核表达。
3． 大肠杆菌蛋白样品制备用on1碱裂解法、煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法。。

实验步骤：
1. 取含重组质粒（VP3/pGEX-1ZT）的细菌和含载体质粒(pGEX-1ZT)的甘油菌10μl，接种于5 ml含氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB培养液中，37 ℃振荡培养过夜；
2. 将过夜培养物按1∶50 的比例接种到20ml含氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约为0.6-1.0；
3. 取出1.5ml的菌液，放置冰上，用于后面分析加IPTG前，蛋白表达情况；
4. 在剩余的菌液中，加入IPTG 至终浓度为1 mM，37℃诱导2h；
5. 取1.5ml诱导了2h的菌液和步骤3所取菌液一起离心，去上清，加入100μl1×上样buffer，100°C沸水浴煮5-10min，-20°C储存，用于下节课蛋白质电泳，检测重组蛋白GST-VP3的表达情况。

实验准备：
（一）主要试剂
1. LB培养液
2. 氨苄青霉素(Amp)母液: 100 mg/ml
3. IPTG母液: 1M
（二）主要仪器
恒温摇床、超净台、金属浴
实验六、蛋白质电泳、染色和脱色
实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用蛋白质电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种形式：（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。（2）SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质（可以忽略电荷因素）。
SDS是一种阴离子表面活性剂，当在蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质-SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。在构象上，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于分子量的大小，从而使我们通过SDS-PAGE来测定蛋白质的分子量。
 　　我们常用的SDS-PAGE通常分为两层，上层浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶主要起浓缩样品的作用，一般凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶主要通过蛋白的电荷，分子的大小和形状，将蛋白分离开。在SDS存在下，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关， 通过分子筛效应，把不同大小的蛋白质相互分开。

实验内容：
1． 将上次实验制备的原核表达GST-VP3蛋白样品，进行蛋白电泳。
2． 对蛋白胶进行染色和脱色，检测GST-VP3表达情况。

实验步骤：

1. 清洗配制凝胶所需的玻璃板，静置干燥；
2. 配制所需浓度的分离胶：

12 %分离胶
15 %分离胶
体积
10(ml)
15(ml)
10(ml)
15(ml)
去离子水
3.3
2.3
2.3
3.4
30 %丙烯酰胺
4.0
5.0
5.0
7.5
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)
2.5
3.8
2.5
3.8
10% SDS
0.1
0.15
0.1
0.15
10 % APS
0.1
0.15
0.1
0.15
TEMED
0.004
0.006
0.004
0.006

3. 配好的分离胶灌注到两玻璃板的空隙中，再加入去离子水覆盖；
4. 室温聚合，待聚合好后，用滤纸吸净水；
5. 配制浓缩胶：

2（ml）
3（ml）
去离子水
1.4
2.1
30 %丙烯酰胺
0.33
0.5
1.0 M Tris-HCl
(pH 6.8)
0.25
0.38
10 % SDS
0.02
0.03
10 % APS
0.02
0.03
TEMED
0.002
0.003

6. 在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入梳子，室温聚合30 min；
7. 待浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子；
8. 向电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的蛋白样加入孔中；
样品顺序：标准蛋白、GST(0hr)、GST(1hr)、GST-VP3(0hr)、GST-VP3(1hr)
9. 接通电源，先用80 V 电压电泳至溴酚蓝染料前沿进入分离胶再将电压提高到150-200 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；
10. 关闭电源，从电泳装置上卸下玻璃板，剥胶，将胶放入染色液中，室温摇晃10分钟。
11．回收染色液，倒入脱色液对胶进行脱色。

实验准备：
（一）主要试剂
1．10%SDS 100ml
SDS（电泳级）