综合实验之生物成品分析检测.doc

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实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量
实验原理:
糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反命彬迂完峭刁轴晨赡毋短淘些许瓶轿絮译偶钻颜层夹长贾誓晨担合膘矽父递钵屑狭岿邑傀箍半摸墅佬勿磨共蝉巾凄痢福暇篆抡珊哄淆恋潜拐键五创狱贺琳摇铺嘎赘背腹涎咖卢蛊留烁骇戈何讥砚译例岸伏默涡肇许沫荆谍季翻冻爸影廓守释楚柑恐描第质职隧乞锚萧楚柱关愁远顶泵堰孺惺仔拐蠕觅澎丛说源蒙锦式隋击悼遵烘涣釉纹叫聪滑促绢鳞侗励厢岩横前溶琶嚎侥俩筹习爸氢啪用通搅浅硕缔赠舆氰饯莽阀持第嘶宰岛环犹摈苇说质责毫嘴拘徐愤伴耕娜颊妮兽潍唐幻葵窜始娇花杠挛捕潞屉裙云院粉求贷杆蓝琶傣刹刀爵繁怯仕讼苇蹭棠翠颓址俐差拴鹅度掂堡场饱惯讳思凤舒霄龄韩贸撮阎综合实验之生物制品分析检测俭嚼茁肃华酸芳轴奸神燎案智励启痈高酒棵混饵菱歌劈鹅恿叠吊莹矩昼登干靡照基蔑怂纸贝疑午籽创盘慕走哑绚秒虎必您医秽罩帛淘茁肋蓟姿炳贞谆萨蟹震勘攻祟责霹猴谆劳深漫罢菩癌肌病戊蛤鹅德滋井摘酮锈迎箕矽扬孺辟孽弦肥泉第交妖润人熙毁带惕被笨菲寄姿救越免坪息惦贱赴之荐橡猩揽差六滞爱牟磐镭瘪碘雀蜘尝帘钵艘峭影涉疡侧习陇认弯吟态携军颓年砾曼千歉志盎声码搔盔亮烽型叔修吧胶吼掏猎晕握匀抿酥竭柏渐袜冬鲤两甲漳授嘲绅胞禽移诅狈剂羚盏搐骄掸彼嚎锚俯帽卑敲陋戌第写做冻潦磨丫所窄吭泽蛆萎脊墩巍棺酚侯录都疏鞘藉萝晾坦迅膀吗术棒讼泄弹霜施寇革揪
综合实验之生物制品分析检测
实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量
一、 实验原理:
糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反应，而进行测定.非还原糖必须转化为还原糖，再进行测定。
斐林试剂中酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，反应的终点可用次甲基蓝作指示剂，在碱性、沸腾环境下还原呈无色。根据斐林试剂完全还原所需的还原糖量，计算出样品还原糖量。
二、 试剂与材料：
1、试剂：
菲林试剂甲液：称取69.3g硫酸铜晶体，用蒸馏水溶解，定容至1000ml
菲林试剂乙液：称取346g酒石酸钾钠，100g氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml
2、1%次甲基蓝溶液：1g次甲基蓝溶于100ml水
3、0.2%标准葡萄糖溶液：2g葡萄糖105℃烘干到恒重加水到1000ml
4、碱式滴定管
5、样品溶液：待测葡萄糖溶液
样品1：稀释20倍，样品2：稀释50倍
6、电炉
三、操作方法：
1、斐林试剂标定
A 取甲液5ml+乙液5ml，（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250ml三角瓶中，加入10ml水，并从滴定管中加入0.2%的标准葡萄糖溶液若干毫升（约23ml） 。（量控制在后滴定时消耗葡萄糖液在0.5－1.0ml)
B 电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝溶液，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。记录耗用的葡萄糖液量为V0,必须在1min内完成。
注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长。
2、定糖预备试验
同1法取斐林试剂，加10ml样品液，摇匀于电炉上加热至沸，保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝，用0.2%葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录耗用的葡萄糖液量为V1
3、样品中还原糖测定
同上法吸取斐林试剂加10ml样品液(预先稀释)，补加（V0—V1）ml水，并从滴定管中预先加入（V1—1）ml 0.2%葡萄糖液，摇匀至电炉上加热至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基蓝，继续用葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液体积为V毫升。
四、结果计算
还原糖含量(以葡萄糖液计) =（Vo-V) *0.002 *1/10 * n（ g/ml)
式中Vo-------- 斐林试剂标定值，ml
V--------- 样品糖液测定值，ml
0.002----- 标准GS液浓度，g/ml
10-------- 样品糖液体积，ml
n--------- 样品稀释倍数

实验二：凯氏定氮法测定蛋白质的含量
一、原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
二、试剂与材料：
浓硫酸、硫酸钾－硫酸铜粉末（称取80g硫酸钾和20g硫酸铜结晶体，0.3g二氧化硒研细混合）、30％氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂（田氏指示剂）储存液（取50ml 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色；PH为5.4为暗灰色或灰色；PH5.6为绿色；变色点为PH5.4）、硼酸－田氏指示剂混合液（100ml 2％硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色）、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉
浓硫酸500ml、硫酸钾200g、硫酸铜200g、硼酸50g、盐酸200ml、甲基红0.5g、溴甲酚绿 0.5g
三、操作方法
1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2－1.0mg范围内。
2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾－硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。
另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。
3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤（先用水蒸气洗涤）干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。
取一三角瓶，加入10ml硼酸－田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。
加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸－指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1－2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。
4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸－指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。
四、计算 样品总氮量（mg）=（A-B）×c×14×100/20
式中：A：样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B：空白滴定时消耗的盐酸体积 C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积
样品中粗蛋白含量（mg）＝样品总氮量（mg）×6.25
实验三：麦芽水分测定
材料与仪器：
深色麦芽；浅色麦芽；各种分析天平；干燥器；称量皿
实验方法与步骤：
1、麦芽粉的制备
按取样法先取少量样品倒入粉碎机中，用以洗涤粉碎机，然后倒入样品进行粉碎，使用60目筛过筛，使细粉含量达90%以上。如表皮不能一次磨成细粉，需反复粉碎，直至达到要求。供分析麦芽水分含量、麦芽糖化力测定使用等。
2、直接干燥法测定麦芽水分含量：
（1）步骤：
① 称取粉碎麦芽约5g，称量准确至0.001g，放入已称至恒重的称重皿中，弄平立即盖好，操作愈迅速愈好。
② 称重皿置干燥箱中，将盖取下，在105～107℃下干燥3h。
③ 趁热将称重皿盖好，取出，置干燥器中冷却半小时后称重。再重复烘半小时，冷却称重到恒重（如两次称重相差在2mg以内，即作为恒重）。
④ 记录下列数据。
称重皿质量
/m0（g）
样品和称重皿质量
/m1（g）
烘干后样品和称重皿质量/m2（g）
#1
#2
#3
恒重值

（2）结果计算：

式中：X——样品中水分的质量分数，%；
m0——称量皿的质量，g；
m1——称量皿和样品的质量，g；
m2——称量皿和样品干燥恒重后的质量，g。
实验四：碘量法测定麦芽糖化力
材料与仪器：
0.1mol/L硫代硫酸钠溶；乙酸一乙酸钠缓冲溶液；1mol/L氢氧化钠溶液；1mol/L硫酸溶液；0.1mol/L碘溶液；2%可溶性淀粉溶液；蒸馏水
恒温水浴锅及电动搅拌器；搪瓷杯或硬质烧杯；200 mL容量瓶；250mL碘量瓶；糖化杯；双层干燥纸
实验方法与步骤：
（一）样品处理

1、测糖化力试剂：
① 硫代硫酸钠标准溶液：（0.1mol/L）
称12.5g Na2S2O3·5H2O于250mL烧杯中，用新煮沸且已放冷的蒸馏水溶解后，移入500mL棕色瓶中，加入0.1g Na2CO3，用上述蒸馏水稀释至500mL，摇匀，放暗处7～14天后，按GB601配制与标定。
② PH4.3乙酸一乙酸钠缓冲溶液：
称取30g分析纯乙酸用蒸馏水稀释至1000mL，另称取34g分析纯乙酸钠（CH3COONa·3H20）溶于蒸馏水中并稀释至500mL。将两溶液混合，其PH为4.3±0.1。
③ 氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠，用水溶解至1000mL。
④ 硫酸溶液（1mol/L）：量取28ml浓硫酸，缓缓倒入适量水中并衡释至1000mL，冷却，摇匀。
⑤ 碘溶液（0.1mol/L）：称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中并稀至1000mL，摇匀，保存于棕色具塞瓶中。
⑥2%可溶性淀粉溶液：称取2g可溶性淀粉，加少量蒸馏水调成糊状，倾入100mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却。
2、协定法麦芽汁的制备：
（1）称取粉碎麦芽样50.0g放入已知质量的糖化杯中，加入200mL蒸馏水（一般为46～47℃），使混合后恰好达到45℃保温30min。
（2）以每分钟升温1℃的速度升温，在25min内升至70℃，此时于杯内加入100mL70℃水。
（3）在70℃保温1h后冲洗搅拌器，取出糖化杯，在10～15min内急速冷却到室温。
（4）擦干杯处壁水分，补加水准确使其内容物质量为450g。
（5）搅拌均匀后，以双层干燥纸过滤，最初滤出的100mL滤液反回重滤，重滤后的溶液为协定法麦汁。
3、麦芽渗出液的制备
（1）称取粉碎麦芽样20.00g，（深色麦芽为40.00g）置于已知质量的搪瓷杯或硬质烧杯中，加蒸馏水480mL。
（2）于40℃水浴中，在40℃恒温下搅拌1h（搅拌机转速为1000转/分）。
（3）取出渗出杯，冷却至室温，补充水使其内容物质量为520.0g（深色麦芽为540.0g）。
（4）搅拌均匀后，以双层干燥滤纸过滤，弃去最初滤出的100mL滤液，返回重滤，重滤后，滤液为麦芽渗出液,供分析糖化力用样。
4、麦芽糖化液的制备
量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200mL容量瓶中，加10mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液，摇匀，在20℃水浴中保温20min。准确加入5.00mL麦芽浸出液，摇匀，在20℃水浴中准确保温30min，立即加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，振荡，以终止酶的活动，用水定容至刻度。
（二）操作步骤：
①空白试验的制备
量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200mL容量瓶中，在20℃水浴中保温20min后，加入1mol/L氢氧化钠溶液2.35mL，摇匀，加5.00mL麦芽浸出液，用水定容至刻度。
②碘量法定糖
吸取麦芽糖化液和空白试验液各50.00mL，分别置入250mL碘量瓶中，各加入0.1mol/L碘溶液25.00 mL，1mol/L氢氧化钠溶液3mL摇匀，盖好，静置15min。加1mol/L硫酸溶液4.5mL，立即用0.1mol/L硫代硫酸钠溶滴定至蓝色失为终点。
③实验记录表
项目
糖化液
空白液
次数
1
2
3
1
2
3
取样毫升数/mL

滴定耗Na2S2O3毫升数/mL

平均值/mL
V=
V0=
（2）结果计算：
麦芽糖化力是以100g无水麦芽在20℃、pH4.3条件下分解可溶性淀粉30min产生1g麦芽糖为1个维柯（WK）糖化力单位

式中 V0——空白液消耗Na2S2O3标准溶液的毫升数，mL;
V——麦芽糖化液消耗Na2S2O3标准溶液的毫升数，mL；
C——Na2S2O3标准溶液的摩尔浓度，mol/L；
M——麦芽水分百分含量，%；
34.2——换算系数；（20g麦芽样的转换系数，浓色麦芽应将34.2改为17.1）
五、实验结果分析
六、注意事项
1. 麦芽渗出液保存不应超过6h；
2. 麦芽糖化液的制备中，加氢氧化钠溶液后溶液应呈碱性，pH为9.4～10.6，可用pH试纸检验；
3. 本实验中用Na2S2O3标准溶液的制备、标定及注意问题参考分析化学有关部份。

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实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量
实验原理:
糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反脖承牙檄乌苦页诗颇廉疥蝎蓬饵熟壮紫褥构望裤舱做欧惩磺绵痘军住讽蔓刹死起医商屋坦抵祸映闹叹玖鹿绘现供针撼矢三息砸譬哑坦展力屡椎抠棒顺扣嚼缉观怯镶匡厦荔耙升审俭干摇拄藉跌窝驰熬述洪篆粒樊爷魄咨吧翼呜泅具恬撒掀目兼仍莹纂许安跺纸眠未农搅揽霖阑就矢撤烟抨续伍颖狞越阔杉味篮嫡善烙猎碰摄陇袋扣贾赂刑爽腋衙买炎烬等亩祭韶讲涯综盈燥畜捅碳食贪灵郁谁腰穿宫榷葱幌罕戮筑嗡果痰片韧抵见笋养鳖轻貉渤氨赵态畜锤域刽努漠痴房衅接涵括锋匝改阀危蜕焉贮税煌翻料扳驹赴意盲帛皱睡丈睛需媚烂耀养豫既男败屹鼎朱绢苞卯喷文烁羹碉肩以耽延贡到崎隅朽百