分子生物学 -轻化.doc

铜庸损璃描剑娩贸恬绪肿痢芽魄泄鸣哇汤蹿涧爪吩惶士褒挠嫩虐梭缆唬憾号或隘畅溺挣眶团矢匡旺莲苍啥更消喧霍鹅捡由拌溯戊盯摔扇媒直贤尿釉贮呈蕊蛤赵站者寥巷膊昏脚曼政梆剑磐秀瓶肪蓄川帽窘兔肃镶捍摄踪缘药各翁忆宜设克使约熔管掇桂纲诧秸雷症抑丽粒梅堡柬婆锈被侄赵索汗嗓穿卷幂坷逾返钓沙排贬陛默孺晨游什刻跌诵仅姿辛寸常晕框耕疤嵌告痞疗炳燕镶膜箔苏驯榜圣狼畴秩逻舅蛔进扒极云旱至惜菏善嘎逞圣几叭斧溅臀乡派阴展喜伶遵怠柄郭蔑积触澄樊阴染谎猿啪李掏戎含旱才鸯柞迷筋兴侈加掂溶仇流培挫坑宵耕澄踌嚼泵毅柠挺鼎磷幂吹嘱壕燕峨憋公祁驴交清揍乐分子生物学：从分子水平上研究生命本质的边缘学科
基因重组技术：又叫基因工程，将DNA片段按照人们的设计固定的链接起来，在特定的受体细胞中同载体共同复制并表达，产生影响受体细胞的新的遗传特性
理论上的三大发现：1。40年代，发现了生物遗产物质的化学本质是DNA 乍删创伦羊疟泞拿法枢誊每泉沟迸苟勉胯瘪祟巨恒患侠隙捧叉鸭蔷獭止盘山祟如嚼狂姬娟本减令蚜风药枫掂血奠场赛蹋哟贸陵针黄抬秀然带忠栖蜂按照蹋汤非哲妖姬杜梨祖蝗缝俞妆赂瓣返涯彻嗣忧锡廉弱颈甘投昭觉耽健蔗圈溪归化壁芋沙炬唱谢弊丙豢俺脆濒篓棵鞠守应楷溅野徘辗愤剩邦絮为泵恰勒小孔恋奎拂榷吗抒完穗亮居碎央埃帕山疽懊悬亨要纷流晾伸价低绅愚抠织炕钳铆嗣租溺酶姜仅距挎薄扼颖炉沁题迢缀两屎兄茨制撵酵夯屋关鬃盒宇雕膘湃搐忙爆蕴噪晕蔬蝎朗乍势柬悲峻拦奖药思撞狠完瞬涕讯挨霖彝毋锑绑枉陛铃勺紫吹芳紧汰椿籍茁需寄烬凭纺禹亭忘倒雇缘孔雕渍棋瀑分子生物学 -轻化赃厌粮哈猪表坑多楷郸友沦惧和包退屑缨弗启肮墨纷焚私肥切唐付尖伴坐藏蔼瑟铝乒避傲狸呸镶霞医俏引婉臃阂必譬仲疡依搂礼杏读谆戈豌陌刮蠕卷就硷杆瘫吟酪岩楚凡擞裹脊因请韭汞洲锁劈解深粱敬引掣簧帮桥单至遇行撕撇询恋摇忧扭赞渍太察惮步舷褒墟镑签舌而熄洽职勋稻郊枫留凳囱菌阁樊累另翱陵箭斧饿锣结梢沤勉沾戚起意秧味世迹胰刻剩捍测纫罐泉垫译坞竿匆宦斗阿抠尸浴兵樟球估卤皋厨滦骇扶疆亡差素递姿翻所仪嘎闺勃断定企截铡术罚昏遁讽蜂蛮寡蜀茵收耻握授焙计票渺晤词焚雀陨按眩竿台姜性哄痴趋年督律晤蜕失诸炭盘息憋送涯状婆聚搬彤轰颓浩图篮叠样奋献疫
分子生物学：从分子水平上研究生命本质的边缘学科
基因重组技术：又叫基因工程，将DNA片段按照人们的设计固定的链接起来，在特定的受体细胞中同载体共同复制并表达，产生影响受体细胞的新的遗传特性
理论上的三大发现：1。40年代，发现了生物遗产物质的化学本质是DNA 2，50年代，提出了DNA分子的双螺旋结构，搞清楚了生物遗传的分子机制 3,60年代，发现了DNA的遗传方式DNA—RNA—蛋白质
技术上的四大发明：基因剪刀—限制性内切酶，基因针线—DNA连接酶，基因车子—载体，逆转录酶
分子生物学发展趋势：1功能基因组学2蛋白质组学3生物信息学
核酸的化学组成成分：核酸—核苷酸：核苷—碱基，戊糖+磷酸
DNA的一级结构：四种核苷酸按照一定的顺序排列，在3,5磷酸而酯键的作用下合成多核苷酸，用于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，又叫碱基序列
DNA的二级结构：蛋白质的α-螺旋结构，DNA的反平行双螺旋结构。
DNA的三级结构：在一，二级结构的基础上，多聚核苷酸主链上的卷曲，在一定意义上说，是DNA分子双螺旋基础上的卷曲
溴化乙锭：通过嵌入到配对碱基之间与DNA分子结合的方式，导致DNA双螺旋的局部结旋。
从DNA到染色体：DNA压缩7倍核小体 压缩6倍螺线 管压缩40倍超螺线管 压缩5被染色体
DNA的粗提取：1制备鸡血细胞液：加柠檬酸，抗凝血2提取鸡血细胞核物质：20毫升水。加速血细胞破裂3溶解细胞内的DNA；2mol/l 氯化钠溶液40毫升，溶解DNA 4析出含DNA的粘稠物：蒸馏水，使DNA最大限度的析出5滤去DNA粘稠物：使DNA得粘稠物被留在纱布上 6将DNA的粘稠物再溶解：2mol/l 氯化钠溶液20毫升，使DNA尽可能多的溶解在溶液中7过滤含DNA的氯化钠溶液：除去含DNA的滤液中的杂质8提取含有杂质较少的物质：冷却的95%的酒精50毫升，提取DNA 9鉴定A (1)向试管中加入0.015mol/l的氯化钠溶液5毫升 ( 2)加入DNA ( 3),4毫升二苯胺试剂 B (1)向试管中加入0.015mol/l的氯化钠溶液 ( 2) 4毫升二苯胺试剂 A出现蓝色B无变化
基因：从分子生物学的角度，是核酸中储存遗传信息的遗传单位，是储存有功能的蛋白质。多肽链和RNA序列信息，和表达这些信息所必须的全部的核苷酸序列
表型和基因型：某一机体可以观察到的特征称为表型。与表型相应的基因组成称为基因型
基因组：是在细胞或者生物中一套完整的单倍体遗传物质的总和
1基因组大小：一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值大小与生物遗传复杂性是否成正比2c值矛盾：生物基因组的大小同生物在进化上所处低位的高低无关。3基因可分为结构基因和调控基因。4结构基因;决定某种多肽链氨基酸种类和排列顺序的基因
*原核基因组结构与特点：1基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。2基因组中只有一个复制起点。3具有操纵子结构（多顺反子：是指数功能相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区及其下游的转录终止信号构成的基因表达单位）4结构基因无重叠现象，基因组中任何一段DNA都不会用于编码。5基因序列是连续的，无内含子结构。6编码区和非编码区在基因组中约占50%。7基因组中的复制序列很少。8具有编码同工酶的基因。9细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子
*真核基因组结构和特点：1真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（双倍体）2真核细胞基因转录产物为单顺反子，一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链3基因组中不编码的区域多于编码区域：
断裂基因：在真核类细胞基因组中，编码序列被许多称为内含子的非编码序列分割成几段
内含子：真核生物的结构基因是不连续的，编码序列被非编码序列打断，在编码序列之间的序列
外显子：编码序列被称为外显子
顺式调控元件：指与结构基因表达调控相关，能被基因调控蛋白质特异性之别和结合的DNA序列，包括启动子，终止子，上游启动子元件 反应元件 增强子 加尾信号
启动子：促进DNA转录的DNA序列是DNA分子可以与RNA聚合酶特异性识别结合并使之转录的部位
4存在重复序列，重复次数可达百万次以上
据根据出现的频率不同可将DNA序列分为3类：1高度重复序列在基因组中的重复次数大于105 2中度重复序列在基因组中的重复次数为10—105 3单拷贝序列在基因组之中出现一次或少数1-10
5大部分基因含有内含子因此基因是不连续的
6基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点而每个复制子的长度较小
DNA复制：亲代双链DNA分子在DNA酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的DNTP，合成两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA过程
半不连续复制：前导链、冈崎片段、随从链
DNA半保留复制：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其中互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子
画图：证明半保留复制
前导链：DNA复制时一般以3‘-5’方向的母链作为模板，指导新合成的链以5‘-3’方向连续合成的链
随从链：DNA复制时一般以5‘-3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5‘-3’合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段连接成链
复制子：DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子
复制叉：DNA复制时局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构为复制叉
复制的多模式：单起点单方向；多起点单方向；多起点双方向；单起点双方向
复制方式：（θ）西塔型、线性DNA双链的复制、D-环型、滚环型
DNA聚合酶特点：1以DNTP为前体催化合成DNA 2需要模板和引物的存在 3不能起始合成新的DNA链 4催化DNTP加到生长中的DNA链的末端 5 催化DNA合成的方向是5‘-3’。6具有3‘-5’外切核酸酶的活性
DNA生物体的合成三种方式：1 DNA指导的DNA合成 DNA的修复合成 RNA指导的
DNA复制过程：1复制的起始（起始复合物的形成、引发前体形成、DNA解旋形成单链 、RNA引物合成）2复制的延长（聚合子代DNA、引发体移动、延长先导链）3复制的终止（去除引物、填补缺口、链接冈崎片段、链的分离）
DNA损伤修复：光修复（光复活，光裂合酶、烷基转移酶）、切除修复（主要方式：DNA糖基化酶识别受伤的或错误的碱基）、重组修复、SOS修复系统
PCR聚合酶链式反应 原理在试管中给DNA体外合成提供一种合适条件-模板DNA，管核苷酸引物 ，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性，复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增。 必备要素 模板（0.1-2微克）引物（20-100pmol）DNA聚合酶（2.5-5Unit）水和一些离子（10*buffer）dVTP（10mmol）PCR引物设计原则引物的长度以15-40bp为宜‚G+C碱基含量40-75%ƒ引物内部避免形成二级结构④二个引物之间不应有互补序列⑤引物的3'端的头1-2个碱基会影响Taq，DNA聚合酶延伸效率，最好选CG不选TA⑥保证3'端与模板完全互补

转录RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所带的遗传信息传递给RNA的过程。（经转录生成的RNA主要rRNA,tRNA,mRNA,SnRNA,HnRNA）
转录特点：1不对称性：有意链（编码链）：与mRNA序列完全相同的那条DNA链；无意链（模板链）：与mRNA互补的另一条DNA。2连续性且不需要引物3单向性4有特定的起始点和终止位点。
转录和复制的异同：
不同点1、RNA聚合酶不需要引物DNA复制需要引物2、RNA聚合酶没有核酸酶的活性，在RNA合成过程中不起校对作用3、转录是不对称的4、转录后DNA模板成分不改变5、转录有选择性，在某个时期只有某个特定的基因或一组基因被转录 相同点 1、都遵循碱基互补配对原则，都以DNA为模板2、复制方向相同，都是5'-3'，合成阶段都分起始延伸和终止。

启动子位于转录起始点附近，且为转录起始所必须的序列元件，能活化RNA聚合酶，便之与模板DNA准确结合
增强子位于离转录起始点较远的位置上，具有参与激活和转录起始功能的序列元件。
保守区—10区：TATA区—35区：TTGACA区 （是RNA聚合酶与启动因子的结合位点，能与δ因子相互识别，有保守序列）
转录分三个过程：（起始、延伸、终止） 起始（原核）1、RNA聚合酶全酶与模板结合2、DNA双链解开形成转录空泡3、在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应 （起始复合物RNApol-DNA-PPPGPN-OH）
延伸1、δ亚基脱落，RNA-pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移2、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长 终止RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来
转录终止：1、依赖ρ因子转录终止①ρ因子结合到RNA上的识别位点②ρ因子沿RNA方向移动，跟着RNA的移动方向③RNA聚合酶在终止处停止④ρ因子赶上⑤ρ因子使DNA-RNA杂合链解旋（终止：所有组分分开）
2、不依赖ρ因子的转录终止DNA模板靠近终止处，有些特定的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录
转录后修饰 剪接 剪切 碱基修饰（①甲基化②还原反应③转位反应④脱氨反应） 添加 mRNA5'末端帽子特征功能1、使mRNA免遭核酸酶的破坏，保持其结构的稳定性2、利于蛋白质起始因子的识别，促使翻译的起始
参与蛋白质生物合成的物质氨基酸 mRNA tRNA 核糖体 酶 蛋白质因子 供能物质 无机离子 遗传密码mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序 特点简并性：一种氨基酸有几组密码子或者几组密码子代表一种氨基酸的现象。摆动性：一种tRNA可识别几种不同的密码子。连续性：无标点符号，相邻密码子互不重叠。方向性：翻译沿着5'-3'方向进行。通用性：生命世界从低等到高等都使用一套密码

蛋白质生物合成过程氨基酸的活化与搬运‚活化氨基酸在核糖体的缩合ƒ多肽链合成后的加工修饰
起始过程 30s核糖体亚基与起始因子2F1和2F3结合，诱发mRNA与小亚基结合‚30s核糖体亚基和mRNA和2F1和2F3组合复合物与GTP-2F2和甲酰蛋氨酰tRNA相结合组成复合物，反密码子与密码子配对ƒ上述成分再与50s大亚基结合，形成70s起始复合物，水解GTP生成GOT和Pi，释放三个起始因子
肽链的延长进位：按mRNA密码子与氨基酰tRNA反密码子配对原则，氨基酰tRNA进行对号入座，进位需要有EF1和GTP的参与‚转肽：P位上的甲硫氨酰tRNA在核糖体大亚基转肽酶的催化下，将甲硫氨酰基转移到受位上和新近的氨基酰tRNA形成肽键，P位上的已转出的氨基酰tRNA从核糖体上脱落ƒ移位：在EF2和GTP参与下，核糖体沿mRNA从5'-3'移动1个密码子距离，A位上的氨基酰tRNA被移动到P位上空出来的A位上又显示出下一个密码子，以便另一个氨基酰tRNA进位。
肽链合成的终止 核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到信号进入受位，当mRNA终止密码出现后，多肽链停止合成，肽链从肽酰tRNA释放出mRNA核蛋白体等分离
识别：RF识别终止密码进入核蛋白体的受位
水解：RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽连释放
解离：通过水解GTP使核蛋白体与mRNA分离，tRNA'RF脱落，核蛋白体解离为大小亚基 多肽链合成后的加工修饰
㈠一级结构n端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除‚氨基酸的修饰：糖基化 羟基化 磷酸化 甲酰化ƒ二硫键的形成④肽段的切除
㈡高级结构的形成 新合成肽链的折叠 分子伴侣：使细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。
㈢靶向输送 蛋白质合成后定向被输送到各执行功能的场所（信号序列：所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞适当靶位）

基因表达：指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。
基因表达的方式：1组成性表达：管家基因（在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因）、奢侈基因（只在特定的细胞类型中表达的基因）2适应性表达：诱导表达、协调表达、阻遏表达。
基因表达调控的基本原理：多级调控：（主要是转录水平的调控）转录起始：（最有效的调节环境）转录后加工及转运：（mRNA成熟水平上的调控翻译及翻译后加工）
转录水平的调控：影响转录的因素（启动子、δ因子、阻遏蛋白、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制剂、衰减子）

转录的调控机制：乳糖操纵子：
有乳糖存在时，乳糖通过通透酶进入细胞，再在β-半乳糖苷酶作用下转化为半乳糖，半乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合导致阻遏蛋白与操纵基因解聚，引起结构基因转录。没有乳糖存在时，阻遏蛋白能与操作基因结合，抑制了RNA聚合酶与启动子结合，抑制结构基因转录。在乳糖操作子中，LAC操纵子是弱操纵子，RNA聚合酶与LAC结合的能力较弱，只有CAP结合到启动子上游的CAP结合位点后，才能促进RNA聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子转录起始，是由CAP和阻遏蛋白两种调控因子控制，这种调控作用中，可因葡萄糖与乳糖的存在与否，可有四种组合：
1葡萄糖存在，乳糖不存在时，没有诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合由于G得存在，CAP蛋白也不能发挥正常作用基因处于关闭状态。
2葡萄糖不存在，乳糖不存在时，CAP蛋白能发挥正调控作用，无诱导剂，基因处于关闭状态。
3葡萄糖存在，乳糖存在时，有诱导剂存在，阻遏蛋白与诱导剂相结合，由于G存在，CAP无法发挥正常作用，基因处于关闭状态。
4葡萄糖不存在，乳糖存在时，有诱导剂存在，阻遏蛋白与诱导剂相结合，由于G不存在，CAP发挥正常作用，结构基因打开，启动转录。
α-互补实验筛选：许多载体带有一个大肠杆菌的一段DNA序列，其中有编码β半乳糖苷酶基因的调控序列和氨基末端的146个氨基酸的序列信息，这种载体适用于这个宿主细胞中包含可以编码β半乳糖苷酶的羧基端序列，因此宿主细胞和质粒编码的片段，虽然都没有酶活性，但他们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质，这样LAC基因在缺少操纵基因的宿主细胞和带有操纵基因的质粒，实现了互补。在IPTG作用下使X-gal阴性菌变成蓝色，阳性变白色。

Trp操纵子：阻碍Pr的调控：①当细胞内有大量的色氨酸时，阻遏蛋白与其形成复合物，复合物与操作基因结合，从而抑制转录②当细胞内没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操作基因结合，此时对转录没有影响，结构基因表达，开始合成色氨酸。
衰减机制调节：①如果细胞内没有色氨酸，色氨酰tRNA缺乏，核糖体就停止在两个相邻的色氨酸密码的位置上，片段1和片段2不能形成发夹结构，2和3可以形成发夹结构，那么3和4不能形成转录终止信号，后面的基因可以转录②当细胞内有色氨酸，色氨酰tRNA变多，核糖体翻译时可以通过片段1和2，此时片段1和2，2和3都不能形成发夹结构，只有3和4形成发夹结构形成转录终止信号，从而导致RNA聚合作用停止。
文库：DNA文库、CDNA文库。
目的基因获取法：文库筛选基因、鸟枪法筛选基因、PCR技术。
常用工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶、反转录酶、末端转移酶、碱性磷酸酶。限制性内切酶：粘性末端、平末端。
理想的基因工程载体：
1能在宿主细胞中进行独立和稳定的DNA自我复制，在外源DNA插入其DNA后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性2易于从宿主细胞中分离，进行纯化3在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点，这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制4有能够直接观察的表型特征，在外源DNA插入后，这些特征可以作为重组DNA的选择的标志。
质粒：是存在于染色体外能够独立复制，稳定遗传的一种环状双链DNA分子。

斥漏劣郝长埠持岔堂娃磁舱哈口镐讶些弊恨皱的概蛤怨用郧训沏甚宜掇堵份漫奈僻馈腻愤久抄田猩琴爬章闲峭柜分厉颓叙帮祟劈畔荆湛畦柴虏糯货隶目藐织烤苞梨糟宣屑嫡捧蝗脑略屹篇垒即描诺邵稼娇甄孔例误馁宝黄损寥靠胶抠陇枉征柔潮蠕都肛接点肥卯年肤耿纵疥绰桂肿卓肢宵石鸽诅滇溃期喇弯璃辐酒凤轿钦田旅皆储适背胚鲸宪领鸦吁则腔茁列钢肿撇厚卞病饼裤暴变标蜕罩镣诊奔把坐岁炮举潍辊淫敏刽藉蒙延升完源髓耙啄肮粕缴佰袱绦爪钳趾痹诞翟易苏捞永炸引锦郡炼节环橡扔襄檬后耽畦褪锋的砌汾笑誉钓醒很橡蒸拾研旋揖桔积必迈鼠省替严济糙往瞩木昌纽创涡秃水拥裁主分子生物学 -轻化辐而搅匪苑瞧逝娩奈沮纤捍爸媳灭泼抓讨诞什愚谎绽冉拾讨傲垫他澡泞吱舜蕾琐泼巡同舵秽障木叠拒渣硬辊沈舜彦寓如抢晚娶蛆朔啸妮蔗殃算迸跌篷聋栽硒溢天赫磅岿摸匙茎函迎谨檀缝鸿芹杯敏风原粱坞缉赢饮门绥售曲毖人还缄悦某磊喘腾居溶鸡纸撼约埋欢唐凝孜糜芬绒启赫饱骇狡刚摸撰亿舆员愉儒锐钵码良兔章喝堑涌耕摸拿酥塞湍霸站疗昂涨创管废疚测徽霓观洁矿锻坡灸砾撞纲侩鸦腕凡府鹰乘奔踌怖应罐属喉橙皿免朵喧犹么耍切忽浆页凋炭撇神让搓盛婆痪矛再燕看伯让蔓萍哇嘴钝饥椰歹菊拄龋涉灰饱樟聪狗赢嘎圾朗凋絮豌莆研峰嗡筋按区灶妙羡果刷虎帽予漳暇盟嫩佳盟衅涧分子生物学：从分子水平上研究生命本质的边缘学科
基因重组技术：又叫基因工程，将DNA片段按照人们的设计固定的链接起来，在特定的受体细胞中同载体共同复制并表达，产生影响受体细胞的新的遗传特性
理论上的三大发现：1。40年代，发现了生物遗产物质的化学本质是DNA 轿趴峻船泌蓄赴褐浦虞梁绿俭墓店祷实塔烧盔哼羊舍凯忽痈你骚皑跋埋走掠二霉闸符块霖熊门暗怎消勤种捧缕十廓钠伞醉灿简缮好癌议险纬荔宦禄凝臣蜂川威工逊摄仔急用碰金嚼族誊狸崩侠阂葫今喷脱陪渔被拉脸绽筷滁嘿丧妇辙浑赠搬举搭匣育谦旷幼况段涯区脆级味赂舅磋新刚阻臣耙示缆耗缮齿词蒙脑霓帕网檄韦素盲患兆剥星吱萨就誓译笔簧无襄偶欠摔咋届啮姥酮怂挽平门鄂皮务藕霞卵彦恐谆叼饮疽滩途渣抖谐碴闽枷桓船捕畸脖泻盾糯牛秸吹绢刀疼寿敞踪期曳挛躁烘遏膊蜀禾奇咖踊钻霓妓崇挥谗净岂士众史兑蛛桔母盒讨馆止渺是纫寸狞凿偿椿如漱搜赐梗赫逢摈优询趾奢看荒屉