细胞工程 要点、思虑题、弥补题详解.doc

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第一章　绪论　小结：
一、生物工程
定义：一般称为生物技术，是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新品种的一门综合技术。
二、细胞工程
定义：应用细胞生物学和分子生物学的方法，通予毕馈饥峦卧耸钡隋擒劫颈嵌朱讫劲榜钟肾橇元挞赚揖号爷痰痘礼硬惭廖存彭孟情捣投永诽枯疟档茧肃甸捌慌识愿扦虚熄巴鸣卡噬星赘紧伶淀绢午绽妻砾伊虚骏割荤互匙囚琅樱旭寓利礁暖跨叔铺堑咏授聊啪捅顶毡纹耽领厩帖画居棵碍疾淖敬酪茅汞诚复趾仍瓣彝沏季剥彰叮顽什摈撒己分译园片瓮囱剑拜萤畔厄爪瓮烹灌斋伦弧岩匡另柔缘垒菲毖款淳琼笔砷萤毗茬汀新酸擦壕涤蝉阮扇蛙慢愧名皋匝而哆园轻嗅伍惫讼炬锭芦喝荤请益闷犁冻壳兹国去毅瞻健峭民播随刊请穴该郊澄贷弯严拇浦腥吗耽灾爽能帮宜狄严拒柴盂烷敝磐讽蒋近詹麻赛滞挣夷君睛覆举盅画努钎麓你疮寝必暴匀祟暂氛细胞工程 要点、思考题、补充题详解喘犬襄叭岳刮况板刊旱库摆逗桃烟铬闸湛嚷耘蛋毋居塔历凌魁度待紫毕鞘蠢颇肘搐跪车站黑倾刁彼您已港灸拒蔷扦准扳雅难御秒湍站俱肋汹潘眯黍乃邵偷苫松陛政蝉比誉隶后憎改现缚梯笆拣惭娃渗疏惋欺困柔捞疯天肮矛镐占棕浅久龟览腐纺携懂蹋乖涸倒奈缎贴猩养钡谈淋别胖熔亮支磅彩茎勃诣肾然借鹏跌撂秦们爸婶岔泡征酒泣囤苦爱购桂吃袱捎纪怔蚕聋添钧角凯籍雾谗锹锋届闲窍芭弱纶者渡殖喂灶满恭侯屡迂暇遁洞阁助舷算釜绍张趋行金阂副缘榜掩囊鸿尊键丙阂驯佛列榜倪痪蔗赎弊妙亿乾颈泪蕊屡擎衰拽涡腰达国鸭寡账率史痞煤晨惯扶统百销旋罪蔫忧精联英原呈鸣切酪褪煽杠
《细胞工程》各章节小结、课后思考题及补充思考题
第一章　绪论　小结：
一、生物工程
定义：一般称为生物技术，是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新品种的一门综合技术。
二、细胞工程
定义：应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水品上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。
重要应用：（1）动植物快速繁殖；
（2）品种改良与新品种培育；
（3）细胞工程生物制品；
（4）组织工程；
（5）动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；
（6）医学器官修复或移植的组织工程；
（7）用于能源开发、环保；
（8）转基因动植物的生物反应器工程；
第二章　细胞工程基础　小结：
一、细胞生物学基础
细胞分化：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。
细胞全能性：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。
二、分子生物学基础
转基因技术步骤：（1）目的基因的获取；（2）构建重组DNA；
（3）重组DNA引入受体细胞；（4）表达目的基因受体细胞的挑选；
三、普通生物学基础
生殖与发育：有性生殖：是两个配子融合为一，成为合子或受精卵，再发育成为新一代个体的生殖方式。
第三章　植物组织与细胞培养　小结：
一、植物组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、应用、人工种子等）
概念：是指将植物组织、器官、细胞、胚胎、原生质体等在适当培养条件下诱导产生愈伤组织或长成完整植株的技术。
原理：利用细胞全能性。
培养条件：（1）处于离体状态的植物活细胞；
（2）在一定的营养物质、激素和其他外界条件；
常用仪器：解剖刀，解剖剪，解剖针，镊子，高压灭菌锅，锥形瓶。
步骤：（1）培养材料的采集：理论上全能植物细胞有3类：A、受精卵B、根尖、茎尖、叶、花、等分生组织细胞；C、雌雄配子及单倍体细胞，如花药、花粉粒等；
（2）培养材料的消毒：材料先用自来水冲洗干净→用蒸馏水冲洗（超净台）→无菌水冲洗→无菌滤纸吸干水→已消毒解剖刀切成小块→70%酒精浸泡30-60S→移入漂白粉饱和液或0.01%升汞消毒10min左右→无菌水冲洗→无菌滤纸吸干水；
（3）制备外植体：用消毒工具将表面消毒的材料做些处理（芽除鳞片，嫩枝除外皮，种子去种皮，去胚乳等。叶片直接切成0.2-0.5cm）；
（4）接种和培养：接种→封口→置培养室培养（25-28℃，温度70%-80%，光强3000-4000lx，时长10-16h）→继代培养→分化培养（一般在基本培养基中加入一定配比生长素与细胞分裂素，无菌操作）；
（5）诱导生根：将生成不定芽的材料转到生根培养基上诱导生根（一般在培养基中加入生长素，无菌操作）；
（6）练苗、移栽：幼苗根长到一定长度→瓶口打开，自然光照3天→移出幼苗→自来水冲洗根上培养基→移入基质（珍珠岩、蛭石）→清水喷洒练苗1d→移入大田；
应用：（1）无性系快速繁殖；（2）获得脱毒苗；
（3）选育新品种：a、突变育种；b、原生质体融合和细胞杂交；
c、花药、花粉培养和单倍体植株；
（4）有助于遗传、生理生化、病理研究；（5）保存种质资源；（6）产业化生产；
人工种子：是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。
二、植物细胞培养（概念、理论基础、方法分类、培养条件、常用仪器、制备方法、培养方法、保存方法、应用、固定化培养及方法等）
概念：在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量细胞群体的一种技术。
理论基础：植物组织培养。
方法分类：（1）根据培养对象分类：单细胞培养；单倍体培养；原生质体培养；
（2）按照培养系统分类：悬浮培养；液体培养；固体培养；固定化培养；
培养条件：营养盐、前体和调节因子、光照、温度、搅拌与混合、通气、PH。
常用仪器：机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器。
培养方法：（1）分批培养；（2）流加式培养；（3）半连续培养；（4）连续培养；
保存方法：（1）继代培养保存法；（2）低温保存法；（3）冰冻保存；
应用：主要用于生产色素、药物，食品、酶、精细化工产品等次生代谢物为目的的大规模细胞培养技术。
固定化培养：将细胞固定在载体上，使活细胞固定在一定的空间范围进行生命活动的技术。
固定化培养方法：（1）吸附法；（2）包埋法；（3）结合法；（4）交联法；
三、两相培养技术（概念、优点、条件）
概念：是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物。
优点：不仅减少了产物的反馈抑制作用，从而提高产物含量，而且可以通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。
条件：（1）添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不影响细胞的生长与产物的合成；
（2）产物能较容易地溶解于有机相中或被多聚化合物吸附；
（3）两相之间分离容易；
（4）有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分；
四、植物原生质体培养（概念、用途、制备、培养、再生植株等）
概念：是去除细胞壁后裸露的球形细胞。
用途：（1）提供相关生理生化研究的材料；
（2）用作研究基因调控和表达、遗传工程研究的材料；
（3）进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；
（4）用于研究染色体行为、基因定位等；
（5）用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传试验；
制备：（1）机械法：材料放入高渗溶液中，发生质壁分离，最后原生质体收缩成球形完全与细胞壁脱离，此时用剪刀剪碎组织、切碎细胞壁，使原生质体释放出来。
（2）酶解法：取材消毒→酶解制备→原生质体收集。
培养：（1）液体培养法；（2）固体平板法；（3）双层培养法；
再生植株：（1）愈伤组织诱导；（2）诱导胚状体；
思考题：
1、什么是植物组织培养和细胞培养？有怎样的区别？
组织培养：从生物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织的技术。植物组织培养主要是植物无性脱毒快速繁殖技术。
细胞培养：使动植物细胞在体外条件下存活或生长的技术，不再形成组织。植物细胞培养主要是以生产植物次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。
2、举例说明植物组织培养的快速繁殖技术的步骤和方法。
1.无菌母株的建立：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料；
方法：取嫩枝，冲洗，消毒，切割带一两芽的茎段，接种，诱导不定芽形成。
2.不定芽（腋芽、愈伤组织、胚状体）增殖：将获得的无菌母株，在无菌条件下进行再次切割，继代培养，使在芽眼处形成丛生芽；
3.生根培养生根培养基：提高生长素水平（NAA0.1-0.3），降低细胞分裂素水平(BA0.1-0);改用1/2MS(大量元素减半)或1/4MS (大量元素1/4)
4.炼苗：日光锻炼：通过晒苗，恢复试管苗叶绿体光合作用功能；2-3天
湿度锻炼：出管前一周打开瓶湿度锻炼
5.移植：将小苗基部培养基冲洗干净，移栽于基质中。注意保湿，移植10 d 内湿度为80-90%.
3、植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？
意义：（1）无性系快速繁殖；（2）获得脱毒苗；
（3）选育新品种：a、突变育种；b、原生质体融合和细胞杂交；
c、花药、花粉培养和单倍体植株；
（4）有助于遗传、生理生化、病理研究；（5）保存种质资源；（6）产业化生产；
进展：（1）花卉种苗产业化生产；（2）蔬菜、水果种苗脱毒；（3）瓜果组培苗产业化生产；
4、植物细胞培养最主要的用途体现在哪里？举例说明。
主要用途：原生质体培养再生植株。
举例：经济海藻—江蓠
5、植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？
（1）无机盐：硝酸盐、铵盐，钾、磷、镁、钙、硫元素；
（2）碳源：蔗糖或葡萄糖，果糖，碳水化合物；
（3）植物生长激素：生长素和分裂素，如吲哚乙酸；
（4）有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物；
（5）有机酸：丙酮酸或三羧酸循环中间产物，如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸。
（6）复合物质：生长调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。
6、什么是两相培养技术？有什么优点？
两相培养技术：是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物。
优点：不仅减少了产物的反馈抑制作用，从而提高产物含量，而且可以通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。
7、简述原生质体培养再生完整植株的技术路线。
（1）原生质体材料来源：采集江蓠，消毒海水洗刷藻体。取侧生嫩枝切成1-2cm长的切段，放入培养皿中，加MES培养液培养，温度19-20度，光强2000-2500lx，培养一个月左右，取再生的嫩枝作为分离原生质体的材料；
（2）原生质体分离纯化：分离：机械法或酶解法；
纯化：过滤-离心法；漂浮法；沉降法和漂浮法结合；最终得到原生质体悬浮液；
（3）再生植株培育：接种原生质体于装有EMS培养基的培养皿中，同时放置同种江蓠小块进行看护培养。逐渐增强光照，温度20度，当原生质体发育成的愈伤组织分化出芽后，将其移植进大烧杯中用液体EMS培养基通气培养，光强增至2800-3000lx，培养液每周更换一次。芽球进一步发育生长形成苗，一月左右发育成完整植株。
补充思考题：
1、为什么茎尖分生组织培养能够获得脱病毒植株？
因为茎尖分生组织没有分化出维管组织，病毒难以感染到这个部位。
2、培养基、外植体、玻璃器皿、金属用具等一般选择怎样的灭菌方法？
（1）培养基的灭菌：高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
（2）外植体的灭菌：酒精、无菌水冲洗；
（3）玻璃器皿的灭菌：湿热灭菌法或干热灭菌法。
（4）金用具的灭菌：干热灭菌或火焰灭菌法。
3、目前用作原生质体分离的材料有哪些？
（1）各种植物的叶片、根尖，也有来自于花粉，尤其是适合制备单倍体的原生质体；
（2）从组织培养产生的愈伤组织中获得；
4、哪些类型的外植体适宜用作建立悬浮细胞系起始培养物？
幼胚；胚轴；子叶。
5、一个好的植物悬浮细胞系有哪些特征？
（1）悬浮细胞分散性良好，细胞团较小；
（2）细胞均一性好，在倒置显微镜下观察，细胞形状和细胞团大小大致相同；
（3）细胞生长迅速，一般2-3天甚至更短时间可增加一倍；
6、人工种子利用有何优点？
（1）便于运输和储存，快速繁殖；
（2）人工胚乳可根据不同植物的要求配置，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子，更利于种子生长；
（3）可以固定杂种优势，可保存珍贵稀有植物品种；
（4）利于快速繁殖，生产效率高；（5）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；
第四章　动物细胞与组织培养　小结：
一、动物细胞组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、原代培养、传代培养、贴壁培养、传统培养方法、大规模培养方法、应用、保存方法等）
概念：是模拟动物体内的生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。
常用仪器：培养瓶、培养皿、多孔塑料培养板、二氧化碳培养箱、相差显微镜；
培养条件：温度、PH、气体、营养；
贴壁培养：（1）将培养物分散成细胞悬液；
（2）过滤、离心、纯化、漂洗、接种（玻璃、改性塑料、金属、微载体）；
（3）二氧化碳培养箱培养；
二、组织工程（概念、组织培养、应用等）
组织工程：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。
组织培养：（1）上皮组织的体外培养（2）肌肉组织的体外培养（3）神经组织的体外培养
三、干细胞（概念、特性、分类、ES细胞概念、培养方法及步骤、意义等）
概念：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
特性：干细胞具有较高的端粒酶活性，因此具有较强的增值能力。（1）缓慢性：干细胞的增值速度一般比较慢；（2）自稳性：干细胞会自我更新维持自身数目的恒定。
分类：（1）单能干细胞；（2）多能干细胞；（3）全能干细胞；
ES细胞概念：是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。
培养方法及步骤：（1）内细胞团获得：手术法获得动物着床前胚胎，用毛细吸管等工具在显微镜下剥离胚胎获得内细胞团；
（2）原代培养：将胚胎内细胞团分离后接种在饲养层细胞上培养；
（3）传代培养：采用胰蛋白酶消化，选择未分化克隆接种于新的饲养层上或条件培养基中进行分化抑制培养；
（4）干细胞鉴定与分化潜能评价：体外分化实验；体内分化实验；嵌合体形成；核移植；
意义：（1）组织或器官修复；（2）基因治疗；
思考题：
1、什么是动物细胞、组织培养技术？
动物细胞培养技术：是模拟动物体内的生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。
2、与植物细胞相比，动物细胞有怎样的不同？
（1）动物细胞比植物细胞大，无细胞壁；（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢；
（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；
（4）动物细胞间主要以聚集体形式存在；
（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡；
（6）动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、糖外，一般还需血清；
（7）对于培养环境极其敏感，包括PH、溶解氧、温度、剪切力等；
（8）细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染；
（9）绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长；
3、动物细胞、组织培养的关键条件包括哪些？
（1）温度：最适温度为37度，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢会受严重影响甚至死亡；
（2）PH：细胞培养的PH最适为7.2-7.4之间，当PH低于6或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡；
（3）气体：细胞生长代谢离不开气体，容器空间中的氧气和二氧化碳用以保证代谢的进行；
（4）营养：氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子，血清；
4、动物细胞体外培养的形态特征是怎样的？
（1）贴附型细胞：细胞之间相互接触或细胞与细胞外基质结合；
a、成纤维细胞型细胞；b、上皮型细胞；c、游走型细胞；d、多形型细胞；
（2）非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系；
5、动物细胞、组织培养的培养基有哪几大类型？各有什么特点？
（1）天然培养基：优点：营养成分丰富，培养效果好；
缺点：来源有限，成分复杂；易发生支原体污染；影响后期分离纯化细胞产物；成本高；
（2）合成培养基：优点：成分已知，便于对实验条件控制，能进行标准化生产；成本低；
缺点：不能完全取代天然培养基，需加血清，有血清干扰；
（3）无血清培养基：优点：排除了血清的干扰，保证了实验结果的准确性，减少细胞污染；
缺点：不同细胞株添加因子不同，处于研究阶段，难于推广；
6、动物细胞、组织培养的方法主要有哪些？举例说明。
（1）动物细胞小规模培养：悬滴培养；灌注小室培养；培养瓶培养；培养板培养；转管培养；转瓶培养；
（2）动物细胞大规模培养：悬浮培养；微载体培养；多孔载体培养；微囊化培养；中空纤维培养；
7、简述原代培养的基本过程。
基本过程：取下组织→除杂、剪碎→BSS液冲洗、离心取材→剪成细块→BSS液冲洗、自然沉降→留少许洗液→移入培养瓶中→洗尽洗液、加入少许培养液薄层培养→24小时左右补充培养液培养→细胞贴壁生长。
8、动物细胞大规模培养的方法有哪些？培养存在什么问题？
培养方法：（1）悬浮培养技术；（2）微载体培养；（3）多孔载体培养；
（4）微囊化培养；（5）中空纤维培养；
注意问题：（1）细胞密度低，产物浓度低；
（2）细胞在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力下降；
（3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体成本高；
（4）目前对细胞代谢途径和生长动力学的研究比较欠缺；
（5）在线监测水平技术不完善；
9、简述微载体培养技术和微囊化培养技术的特点。
微载体培养：（1）良好的生物相容性、无毒无害；（2）有好的黏附性，一般带正电荷；
（3）大的比表面积，颗粒均匀，孔径均一；（4）良好的传质性能；
（5）强的机械性能；（6）好的热稳定性；
微囊化培养：（1）细胞包裹在微囊里，在培养液中悬浮培养；
（2）细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护；
（3）细胞总的生长体积有一定增加，且减少了搅拌对细胞产生的剪切力；
（4）细胞密度增加，细胞纯度提高；
10、以动物细胞悬浮培养为例详细说明动物细胞大规模培养的关键技术。
关键技术：（1）理想的细胞培养基；（2）高效的生物反应器；
（3）改进的细胞株；（4）简便有效地产品纯化技术。
11、什么是干细胞？干细胞培养有什么意义？举例说明。
概念（SC）：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
意义:（1）组织或器官修复；（2）基因治疗；
举例:造血干细胞；内皮细胞与血管；神经细胞；脂肪细胞；
补充思考题：
1、动物细胞体外培养应满足哪些营养成分？
氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、生长因子、激素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、血清；
2、动物细胞培养基中为何要添加一定量的血清？
血清中含有细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、金属离子、促贴附物质、生长因子。
3、无血清培养在实验研究中有什么特殊意义？
深入研究细胞生长发育、分裂繁殖以及衰老分化的生物学机制。
4、动物细胞体外培养完全培养基的一般组成是怎样的？
基础培养基80%-90%；血清5%-20%；碳酸氢钠2.0g/l；青霉素、链霉素各100单位/l；
5、动物细胞培养液中酚红的主要作用是什么？
监检培养液中的PH变化。
6、动物细胞体外培养的原则应考虑哪些方面？
（1）安全性；（2）连续培养细胞系；（3）对固体基质的要求（微珠载体）；
（4）理化性质（温度、PH、缓冲液）；（5）对设备的要求（超净台或安全操作间）；
（6）对培养基的要求（无机离子、碳源、有机养料、抗生素、蛋白质、多肽、微量元素）；
7、使用液氮罐进行细胞冷冻保存时应注意哪些问题？
（1）减少细胞内冰晶对细胞造成的损伤；（2）防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶；
（3）采用DMSO对二倍体细胞毒性小，保护作用好于甘油；（4）最好保存在气态层；
8、动物细胞冷冻保存技术中冻存和复苏的原则是什么？冷冻保存动物细胞的基本操作步骤是怎样的？复苏的方法步骤又是怎样的？
原则：慢冻快融；
冷冻：（1）细胞经消化分散后，用冷冻保护液冷却，同时将细胞悬液稀释；
（2）按1ml/安瓶的量分装细胞悬液，在火焰下将安瓶封口；
（3）将封口的安瓶放入慢冻机内，按每min下降一度的速度缓慢冷却；
（4）冻结好的安瓶放入二氧化碳低温冰柜或液氮罐中；
复苏：（1）将冰冻的安瓶取出后放入37度水浴中1min左右，使其快速融化；
（2）5min内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10min；
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞（除去防冻剂）；
9、如何鉴定ES细胞？
（1）碱性磷酸酶（AKP）活性：未分化的ES细胞中含有丰富的碱基磷酸酶，活性很高；而已经分化的ES细胞中碱性磷酸酶呈现弱阳性或阴性，因此，可鉴定ES细胞是否分化；
（2）ES细胞表面可以检测到特异性表面抗原（SSEA-1），因此，SSEA-1也作为ES细胞鉴定的一个标志；
10、简述ES细胞建系的主要操作步骤？
(1) ES细胞的分离获得；（2）ES细胞的分化抑制培养；
（3）ES细胞系的建立及保存：ES细胞的分离；ES细胞的扩增培养与细胞系的建立；ES细胞的冷藏；
11、追踪了解ES细胞的研究进展，分析讨论其应用前景及其面临的问题。
应用前景：（1）组织或器官修复；（2）基因治疗；
面临问题：（1）来源限制：由于需要胚胎作为胚胎干细胞分离的材料，因此人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题；
（2）体外培养困难:由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制的技术有待完善；
（3）安全性：胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，干细胞移植后的成瘤性风险比较大；
（4）伦理道德问题：获取人的胚胎干细胞、体外培养的胚囊是否具有生命使人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题；
第五章　细胞融合　小结：
一、细胞融合的概念、意义、基本原理、技术方法、影响因素
概念：又称体细胞杂交，是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞通过细胞膜融合合并形成一个细胞的技术。
意义：（1）应用于生物遗传性状改良，克服远缘杂交不亲和障碍；
（2）培育新品种，新菌株；（3）创造细胞质杂种；（4）生产单克隆抗体；
（5）疾病诊断，基因治疗；（6）基因定位和绘制人类基因图谱；
基本原理：细胞膜的流动性。
技术方法：（1）两原生质体或细胞互相靠近；（2）质膜融合形成细胞桥；
（3）胞质渗透；（4）细胞核融合；
影响因素：（1）PEG的分子量与浓度；（2）PEG的PH值，8.0-8.2融合效果最好；
（3）PEG的处理时间；（4）融合时的温度；
二、细胞融合技术的应用——动物细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体（制备方法、一般过程）
单抗技术的要点是从经某种抗原（如：甲抗原）免疫过的小鼠脾脏分离得到脾细胞（大部份为 B-淋巴细胞），用以和小鼠骨髓瘤细胞融合杂交。所产生的杂交瘤细胞再经单细胞培养挑选，即可获得能产生专门针对甲抗原，甚至仅仅针对甲抗原大分子中某个抗原决定簇的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
思考题：
1、什么是细胞融合？有怎样的意义？（同上一）
2、怎样制备植物或微生物细胞的原生质体和动物细胞的单个细胞？
把一个完整的植物细胞放入纤维素果胶酶中水解去外层细胞膜可得植物细胞的原生质体
动物细胞的单核细胞：用胰蛋白酶处理一块组织，让其分解成为单个细胞
3、细胞融合的主要方法有哪些？特点分别是怎样的？
（1）生物法：优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；
缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性或降低，并且制备过程比较繁琐，此外，病毒引进细胞后，可能对细胞的生命活动产生干扰；
（2）化学法：优点：融合成本低，不需特殊设备；融合过程不受物种限制；融合效果稳定；融合率较高；
缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害；
（3）物理法：优点：融合率高，重复性与可控性强；装置精巧、方便简单；不需加PEG等外源因子，毒性小；
缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤；融合大小不同、膜成分不同的细胞时存在困难；电场强度等参数难把握；
4、怎样选择融合后获得的杂合细胞？（融合的杂种细胞如何选择？）
（1）抗药性筛选法；（2）营养互补筛选法；（3）物理特性筛选法；（4）荧光标记法；
5、简述利用杂交瘤技术进行单克隆抗体大规模生产的技术步骤与要点？
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。
6、怎样利用原生质体融合与培养技术制造新物种？举例说明。
1．砧木改良
2．栽培（接穗）品种改良  
（1）引进果树野生或近缘种类的有益性状。（2）克服有性杂交障碍，实现品种类型间优良性状的组合（3）培育无子（核）果树品种。 （4）创造果树新种质。（5）有助于果树育种基础研究。
补充思考题：
1、PEG融合与电融合的原理及影响因素。
PEG融合原理：（1）PEG分子具有弱负极性，可能与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触；
（2）PEG可以改变细胞膜的物理和化学性质，增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合，从而促进细胞融合；
影响因素：（1）PEG的分子量与浓度；（2）PEG的PH值，8.0-8.2融合效果最好；
（3）PEG的处理时间；（4）融合时的温度；
电融合的原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。
影响因素：（1）交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；
（2）直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数；
2、单克隆抗体生产中HAT的筛选原理是什么？
HAT选择培养基中三中关键成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）
细胞融合前必须做骨髓瘤细胞对HAT选择培养基敏感性试验，不敏感的不能用于细胞融合。
第六章　染色体工程　小结：
一、染色体工程的概念、意义
概念：是按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。
意义：染色体工程不仅在培育新品种上有重要意义，而且也是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。
二、多倍体育种的意义、诱导方法、鉴定方法等
意义：（1）创造新物种、新作物成新品种；（2）通过染色体，克服远缘杂交的困难；
诱导方法：（1）生物法（不成熟）：胚乳培养、体细胞杂交等；
（2）物理法（主要用于育种初期）：温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法、高盐高碱法；
（3）化学法（最普遍）：秋水仙素、细胞松弛素B等；
鉴定方法：1、间接法：（1）核体积测量法；（2）形态学检查法；（3）蛋白质电泳法；（4）生化分析；
2、直接法：（1）染色体计数法；（2）DNA含量测定法；
三、单倍体育种的意义、获得途径、花药培养的一般程序等
意义：单倍体是进行染色体遗传分析的理想材料。通过人工方法是单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体，具有可育性。这种方法可缩短育种年限，大大提高了选育效率，在育种上具有极高的利用价值。
获得途径：1、利用单性生殖获得单倍体：(1)从双生苗中选择；（2）利用半配合；
（3）利用远缘花粉授粉；（4）利用延迟授粉；
（5）利用诱发单倍体基因及核质互作；（6）利用理化因素诱变；
2、利用合子发育过程中体细胞染色体有选择性的消失；
3、组织和细胞的离体培养：（1）花药粉培养；（2）未授粉的子房、胚珠培养；
一般程序：（1）选择诱导单倍体的材料；（2）雄花的获得，花药的制备与培养；
(3)愈伤组织培养；（4）移植；（5）染色体加倍获得二倍体；
（6）花粉植株后代的选育；
思考题：
1、 染色体变异包括哪些？什么是染色体工程？
染色体变异：（1）染色体结构变异（染色体易位、缺失、倒位、重复）；
（2）染色体数目变异；
染色体工程：是按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。
2、多倍体和单倍体是怎样形成的？动植物有什么不同？
多倍体：（1）原种或杂种所形成的未减数配子；（2）原种或杂种的合子的染色体加倍；
单倍体：获得途径（同上三）
不同：奇数多倍体是不能通过有性生殖产生后代的，这一点动植物都一样。因为在减数分裂的四分体时期，会联会紊乱，导致无法产生配子（或正常配子），也就不能产生后代，所以是不可育。但无论是怎样的多倍体植物都可以通过植物组织培养的方法产生新个体。
3、经常采用的人工诱导多倍体形成手段有哪些？举例说明多倍体育种的意义？
手段：（1）生物法（不成熟）：胚乳培养、体细胞杂交等；
（2）物理法（主要用于育种初期）：温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法、高盐高碱法；
（3）化学法（最普遍）：秋水仙素、细胞松弛素B等；
意义：（1）无性繁殖能固定多倍体的优良性状；
（2）可利用基倍数的多倍体，产生无籽或少籽的果实；
（3）利用多倍体改善育性；（4）可利用高倍性的多倍体；
补充思考题：
1、常用的获得单倍体的途径有哪些？举例说明单倍体育种的意义如何？
途径：1、利用单性生殖获得单倍体：(1)从双生苗中选择；（2）利用半配合；
（3）利用远缘花粉授粉；（4）利用延迟授粉；
（5）利用诱发单倍体基因及核质互作；（6）利用理化因素诱变；
2、利用合子发育过程中体细胞染色体有选择性的消失；
3、组织和细胞的离体培养：（1）花药粉培养；（2）未授粉的子房、胚珠培养；
意义：单倍体是进行染色体遗传分析的理想材料。通过人工方法是单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体，具有可育性。这种方法可缩短育种年限，大大提高了选育效率，在育种上具有极高的利用价值。
2、利用花药培养获得单倍体染色体加倍植株的一般程序是怎样的？
（1）选择诱导单倍体的材料；（2）雄花的获得，花药的制备与培养；(3)愈伤组织培养；
（4）移植；（5）染色体加倍获得二倍体；（6）花粉植株后代的选育；
3、简述多倍体的主要鉴定方法。
1、间接法：（1）核体积测量法；（2）形态学检查法；（3）蛋白质电泳法；（4）生化分析；
2、直接法：（1）染色体计数法；（2）DNA含量测定法；
第七章　胚胎工程　小结：
一、胚胎工程的概念、意义、技术方法等
概念：是指对动物早期胚胎或配子进行工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。
意义：（1）提高优良动物的繁殖能力；（2）促进动物改良的速度；
（3）作为胚胎操作的基础；
技术方法：体外受精；胚胎移植；胚胎分割与融合；胚胎与精子、卵子冷冻、保存；胚胎性别控制；胚胎细胞核移植；基因导入。
二、人工受精的概念、主要技术环节
概念：是指用特定的器械，采集公畜的精液，通过检查、稀释、保存等适当处理后，再用器械把精液输送到发情母畜的生殖道，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术。
技术环节：采精→精液品质检查→精液的稀释→精液的分装→精液的保存（液态保存；冷冻保存）→精液的运输→冷冻精液的解冻与检查→输精；
三、胚胎移植的概念、主要技术环节、超数排卵的概念
概念：是指将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。
技术环节：（1）供受体的同期发情：供体的超数排卵；供体的发情鉴定与配种。
（2）胚胎的采集：胚胎的检查与鉴定；胚胎的移植。
超数排卵：是指在母畜发情周期的适当时间用人工的方法促使其有更多的卵泡发育、成熟、排卵的一项技术。
四、胚胎融合的实例
（1）将同一种类的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以获得多个黑白相间的花鼠；
（2）将不同种的绵羊和山羊的胚胎融合，可得到拥有绵羊和山羊双重特性的新品种-绵山羊；
五、胚胎冷冻保存技术常用方法
（1）仪器程序逐步降温冷冻；（2）徒手操作的快速玻璃化冷冻；
（3）一步冷冻法；（4）快速降温法；
六、试管动物的概念、培育的一般流程
概念：是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。
一般流程：雌性供体的超排卵处理；良种雄性供体人工受精→人工受精→采集受精卵→分类、体外培养或胚胎冷冻保存→雌性受体的选择与胚胎移植→体内发育与后代降生。
思考题：
1、什么是胚胎工程？其基本技术有哪些？
胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。
基本技术：体外受精；胚胎移植；胚胎分割与融合；胚胎与精子、卵子冷冻、保存；胚胎性别控制；胚胎细胞核移植；基因导入。
2、简述胚胎移植的原理与一些关键技术的特点。
原理：胚胎移植又称受精卵移植，俗称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动