光学工程光镊技术.pptx

1 光 镊 技 术 陈 荣2010.10E-mail: Tel:[phone]主要内容v引言引言v研究进展研究进展v光镊基本原理光镊基本原理v光镊实验装置光镊实验装置v应用成果与展望应用成果与展望3 光镊技术光镊技术(Optical Tweezers(Optical Tweezers或或Laser Laser Traps)Traps)早期也叫激光捕获术，即利用聚焦的激光早期也叫激光捕获术，即利用聚焦的激光束镊起并操纵细胞、细菌或原子等大约尺度在几束镊起并操纵细胞、细菌或原子等大约尺度在几纳米到几十微米之间的微小粒子的一项技术。纳米到几十微米之间的微小粒子的一项技术。引引 言言4 光镊光镊-光学镊子，顾名思义它是一光学镊子，顾名思义它是一种利用光物理性质实现的工具，它应具有种利用光物理性质实现的工具，它应具有传统的机械镊子或钳子可狭持、操纵微小传统的机械镊子或钳子可狭持、操纵微小物体的功能，故成为光镊或光钳。物体的功能，故成为光镊或光钳。引引 言言5激光束聚焦至直径1um激光光镊对酵母细胞的捕获和操作控制曝光时间在样品上记录下直径变化的点6 传统的机械镊子必须用其前端接触到物体，再施加一传统的机械镊子必须用其前端接触到物体，再施加一定的压力，物体才能被镊住，而后进行翻转，迁移等操纵。定的压力，物体才能被镊住，而后进行翻转，迁移等操纵。而光镊则大不相同，而光镊则大不相同，它使物体受到光的束缚而达到它使物体受到光的束缚而达到“镊镊”的目的，然后的目的，然后通过移动光束来迁移或翻转物体通过移动光束来迁移或翻转物体 与机械镊子相比，它是一种温和的、非机械接触的方与机械镊子相比，它是一种温和的、非机械接触的方式来夹持和操作物体式来夹持和操作物体 尤为重要，在以光镊的光为中心的一定区域内，物尤为重要，在以光镊的光为中心的一定区域内，物体一旦落入这个区域就有自动移向几何中心的可能，尤如体一旦落入这个区域就有自动移向几何中心的可能，尤如微粒被吸光器吸入，或一个飞行物体坠入宇宙黑洞样，光微粒被吸光器吸入，或一个飞行物体坠入宇宙黑洞样，光镊具有镊具有“引力引力”效应。同时光镊又象一个陷阱。效应。同时光镊又象一个陷阱。引引 言言7 同时，同时，“光镊光镊”实际上是以宏观机械镊子对实际上是以宏观机械镊子对光的势阱效应的一种形象和通俗的描绘。对光的势阱效应的一种形象和通俗的描绘。对“光镊光镊”的物理性质，人们采用的物理性质，人们采用“光学势垒光学势垒”“光捕获阱光捕获阱”“光梯度力阱光梯度力阱”或或“光字势阱光字势阱”等等物理术语予以描述。物理术语予以描述。引引 言言8研究进展研究进展v1970年年 贝尔实验室的阿什金就利用多光束激贝尔实验室的阿什金就利用多光束激光的三维势阱成功镊起并移动水溶液中的小光的三维势阱成功镊起并移动水溶液中的小玻璃珠，之后这一激光镊起微粒的技术得到玻璃珠，之后这一激光镊起微粒的技术得到不断改进，所能捕获的粒子越来越小不断改进，所能捕获的粒子越来越小;v19851985年年阿什金开始采用单光束镊起细菌及病阿什金开始采用单光束镊起细菌及病毒等微小生物体毒等微小生物体;9v19871987年年首先使用首先使用514.5nmAr+514.5nmAr+成功镊起病毒成功镊起病毒,紧接着利紧接着利用用1064nm1064nmNd:YAG。但由于活性体对可视波段激光的。但由于活性体对可视波段激光的吸收作用，早期搬运细菌的过程中存在对活细胞损吸收作用，早期搬运细菌的过程中存在对活细胞损伤的问题伤的问题;v后来阿什金发现对于大多数生物细胞和有机体来说后来阿什金发现对于大多数生物细胞和有机体来说红外光是相对透明的，从而采用红外光是相对透明的，从而采用800950nm的红的红外激光配合一定的功率操作可不对细胞组织造成损外激光配合一定的功率操作可不对细胞组织造成损害，之后这一技术在生物领域得到快速发展。害，之后这一技术在生物领域得到快速发展。10三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.1 光的动量与光辐射压力（光压）光的动量与光辐射压力（光压）光的动量是光的基本属性之一光的动量是光的基本属性之一 光不但具有能量而且有动量光不但具有能量而且有动量光子光子 光与物质相互作用光与物质相互作用 交换能量交换能量 动量的传递动量的传递 力，光压力，光压11 根据牛顿第二定律，作用在物体上的力F等于光引起的单位时间内物体动量的变化：这意味着光对被照物体施加一个力的作用，这种由于光辐射对物体产生的力通常称之为光的辐射压力或光压。12 如果光束的作用面积为如果光束的作用面积为S，则单位面积上的光压强为。，则单位面积上的光压强为。可以估算出，太阳光垂直照射时，地球表面的光压为：可以估算出，太阳光垂直照射时，地球表面的光压为：W=0.5达因达因/m2，这个量很小。，这个量很小。但由于激光的高亮度、高方向性，发散角为毫弧度。但由于激光的高亮度、高方向性，发散角为毫弧度。10mW He-Ne激光，辐射亮度为太阳光的激光，辐射亮度为太阳光的1万倍，与原万倍，与原子弹爆炸时亮度相当。子弹爆炸时亮度相当。再将其聚焦到衍射极限光斑，（再将其聚焦到衍射极限光斑，（）时，其压强为）时，其压强为W=106达因达因/m2从而可产生从而可产生108cm/s2=105g的加速度。对的加速度。对于微米数量级的小球来说，这个力非常大，每个光子的于微米数量级的小球来说，这个力非常大，每个光子的动量虽小，但在聚焦后形成的高密度能流下，其力量非动量虽小，但在聚焦后形成的高密度能流下，其力量非常大，此为光摄的能源所在。常大，此为光摄的能源所在。13v 应当注意的是，如此高的能量密度集中于小球上，应当注意的是，如此高的能量密度集中于小球上，当几毫瓦的激光聚焦成当几毫瓦的激光聚焦成1 的衍射极限光斑，会聚的衍射极限光斑，会聚于于 大小的小球上。当小球与外界绝热时，即使有大小的小球上。当小球与外界绝热时，即使有千分之一的入射能量（微瓦数量级），被小球吸收，千分之一的入射能量（微瓦数量级），被小球吸收，这微瓦的能量也会使小球温度在毫秒时间内超过沸这微瓦的能量也会使小球温度在毫秒时间内超过沸点，而被蒸发。点，而被蒸发。v 然而，光镊作用下的小球都是浸入液体中的，球被然而，光镊作用下的小球都是浸入液体中的，球被液体冷却。这时热传导方程与扩散方程形式相同，液体冷却。这时热传导方程与扩散方程形式相同，水中小球温度变化为：水中小球温度变化为：14v r：小球半径，：小球半径，K：水中传导率，：水中传导率，W：小球获：小球获得的功率。经计算，上述同样的功率（微瓦）得的功率。经计算，上述同样的功率（微瓦）下，小球的温升只有下，小球的温升只有1，可以承受。，可以承受。v还应当注意，光摄利用的是光线在小球上的折还应当注意，光摄利用的是光线在小球上的折射效应，而不是吸收效应。这在下面的受力分射效应，而不是吸收效应。这在下面的受力分析中进一步明确。而这里要说明的是光子确实析中进一步明确。而这里要说明的是光子确实可以对小球形成压力。可以对小球形成压力。15三、光镊基本原理三、光镊基本原理 3.2 梯度力梯度力 上面所讲的是光子对小球的压力，该压力上面所讲的是光子对小球的压力，该压力方向沿光传播方向，这里尚未说明它形成光方向沿光传播方向，这里尚未说明它形成光镊作用。那么我们先来观察处在均匀与非均镊作用。那么我们先来观察处在均匀与非均匀光场中的小球的受力情况。见图匀光场中的小球的受力情况。见图1。16图图1梯度力的形成梯度力的形成 17 图图1中假设小球是透明体，这是符合实际情况的。中假设小球是透明体，这是符合实际情况的。因为大部分生物细胞的组成是水分子，特别是对脱了因为大部分生物细胞的组成是水分子，特别是对脱了壁的原生质体，近乎是透明的球状体。这里还假设小壁的原生质体，近乎是透明的球状体。这里还假设小球的折射率大于周围媒质的折射率球的折射率大于周围媒质的折射率,这也是符合大多数这也是符合大多数情况的。情况的。18 根根据据动动量量守守恒恒原原理理，它它（光光线线a）必必须须要要给给小小球球施施加加一一个个向向左左方方向向的的动动量量，即即光光线线a在在小小球球内内折折射射的的结结果果，使小球受到一个向左的力。使小球受到一个向左的力。同同理理，可可以以分分析析，由由于于光光线线b的的折折射射，小小球球受受到到一一个个向向右右的的力力，在在均均匀匀场场中中，两两力力等等值值，其其合合力力（垂垂直直）向下。向下。19 对于图对于图1 A中的均匀光场来说，光线中的均匀光场来说，光线a,b进入小球发进入小球发生折射，既生折射，既2次折射，这里这是折射占主要的量。从图次折射，这里这是折射占主要的量。从图中可知，比如对于光线中可知，比如对于光线a，它向右方折射。，它向右方折射。因为光线是带有动量的，它的方向是沿着光传播的因为光线是带有动量的，它的方向是沿着光传播的方向，可知光线方向，可知光线a最终向右方折射，它的动量由上向下，最终向右方折射，它的动量由上向下，改变为向右方，这是因为小球的折射率造成的，改变为向右方，这是因为小球的折射率造成的，20 显然对于反射光也可以进行类似的分析。光线显然对于反射光也可以进行类似的分析。光线a的反射光，的反射光，使小球受到向右的力，两发射光的合力是垂直向上的，即与两使小球受到向右的力，两发射光的合力是垂直向上的，即与两折射光的效果相反。但反射光的量小，不起主要作用。折射光的效果相反。但反射光的量小，不起主要作用。同理，对于图同理，对于图1 B中的非均匀光场，受力分析的结果是，中的非均匀光场，受力分析的结果是，小球所受到的向左、向右的力并不互相抵消，总的合力把小球小球所受到的向左、向右的力并不互相抵消，总的合力把小球推向光较亮的那一个方向，图推向光较亮的那一个方向，图1 B是把小球推到右下方。这种由是把小球推到右下方。这种由于光场强度不均匀产生的力，称之为梯度力。（由于光场大小于光场强度不均匀产生的力，称之为梯度力。（由于光场大小存在梯度而产生的力）。存在梯度而产生的力）。21 进进一一步步将将该该结结论论推推广广到到更更一一般般的的光光场场强强度度分分布布，特特别别是是存存在在强强度度最最大大点点，即即光光会会聚聚点点附附近近时时，在在该该区区域域中中的的粒粒子子将将受受到到一一个个指指向向最最亮亮点点的的力力。即即对对于于粒粒子子来来说说，不不仅仅有有推推力力，还还有有拉拉力力。粒子将被束缚在最亮点。粒子将被束缚在最亮点。注注意意，上上述述前前提提是是小小球球折折射射率率大大于于周周围围介介质质的的折折射射率率，反反之之，受力将相反，即光场将粒子推向最暗点。受力将相反，即光场将粒子推向最暗点。22三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.3 二维光学势阱二维光学势阱 由由TEM00基模高斯光束所形成的非均匀光基模高斯光束所形成的非均匀光场，是从光束中心向两侧呈梯度分布（高斯场，是从光束中心向两侧呈梯度分布（高斯分布），在这一高斯分布的非均匀光场中的分布），在这一高斯分布的非均匀光场中的小球，将受到一个元对称的，中心最强，两小球，将受到一个元对称的，中心最强，两侧逐渐减弱的梯度力作用，小球将被约束在侧逐渐减弱的梯度力作用，小球将被约束在基模高斯光束的中心轴线附近。基模高斯光束的中心轴线附近。23三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.3 二维光学势阱二维光学势阱 小球在垂直于光线传播方向的横向平面上，小球在垂直于光线传播方向的横向平面上，受到光束缚，被推向光最强处，非均匀光场受到光束缚，被推向光最强处，非均匀光场形成了一个二维光学势阱，此为二维的光钳。形成了一个二维光学势阱，此为二维的光钳。高斯光束可形成二维势阱，二维势阱在某些高斯光束可形成二维势阱，二维势阱在某些情况下可以用于捕获粒子。情况下可以用于捕获粒子。24 由于高斯光束的激光能量在平面是高斯分布，因而即可形成由于高斯光束的激光能量在平面是高斯分布，因而即可形成一个强的二维光学势阱。一个强的二维光学势阱。小球在高斯光束条件下，受到一个指向光轴的力，即将小球小球在高斯光束条件下，受到一个指向光轴的力，即将小球束缚在光轴上。但小球在光轴上下方向，并未受到大的力。因束缚在光轴上。但小球在光轴上下方向，并未受到大的力。因此，小球可以在此，小球可以在Z轴上下自由运动。当然小球还受到向下的重力。轴上下自由运动。当然小球还受到向下的重力。25 利用二维光学势阱可用于捕获粒子：图利用二维光学势阱可用于捕获粒子：图3（几个例子）（几个例子）26图图3 A，利用粒子受沿光束传播方向的光压与粒子自身的重力相，利用粒子受沿光束传播方向的光压与粒子自身的重力相 平衡，粒子被悬浮于某一高度。（注意光压向上，即激光从下平衡，粒子被悬浮于某一高度。（注意光压向上，即激光从下往上照）往上照）图图3 B，利用器皿平衡粒子所受沿，利用器皿平衡粒子所受沿Z方向的光压，而固定粒子。方向的光压，而固定粒子。图图3 C，选用两束相向传播的，完全相同的激光形成双光束激光，选用两束相向传播的，完全相同的激光形成双光束激光势阱束缚粒子势阱束缚粒子。27 二二维维势势阱阱，由由于于在在光光束束传传播播方方向向才才能能束束缚缚粒粒子子，并并且且系系统统较较复复杂杂，效效果果不不理理想想。美美国国贝贝尔尔实实验验室室的的A.Ashkin利利用用强强聚聚焦焦单单光光束激光势阱较理想地解决了这一问题。束激光势阱较理想地解决了这一问题。28三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.4 单光束梯度力光阱单光束梯度力光阱 二维光学势阱实现了对粒子在二维光学势阱实现了对粒子在（垂直）于光传（垂直）于光传播方向上的平面内的束缚，但在光传播的播方向上的平面内的束缚，但在光传播的Z方向，粒方向，粒子一般地受向下的合力和重力（向下），因而在光轴子一般地受向下的合力和重力（向下），因而在光轴方向仍是不稳定的。方向仍是不稳定的。如果光阱在光传播方向上也能产生对粒子的束缚，如果光阱在光传播方向上也能产生对粒子的束缚，则可以形成一个三维的势阱，从而粒子能在光轴上的则可以形成一个三维的势阱，从而粒子能在光轴上的某一个位置达到平衡。某一个位置达到平衡。1986年，美国贝尔实验室年，美国贝尔实验室A.Ashkin利用利用一束强聚一束强聚焦激光实现这一目的。焦激光实现这一目的。29 图图4 三维光学势阱三维光学势阱 30 图图4 强聚焦激光高斯光场中粒子受力图。强聚焦激光高斯光场中粒子受力图。图图4A中，折射光线中，折射光线a、b趋向更平行于光轴（比原光线），趋向更平行于光轴（比原光线），即折射后动量的改变量合成是向下的，因为动量守恒，粒子应即折射后动量的改变量合成是向下的，因为动量守恒，粒子应当受到一个向上的合力。小球被拉向焦点方向。当受到一个向上的合力。小球被拉向焦点方向。31 图图4 强聚焦激光高斯光场中粒子受力图。强聚焦激光高斯光场中粒子受力图。图图4B中中，粒粒子子处处于于焦焦点点之之内内（粒粒子子中中心心0在在焦焦点点之之内内），此此时时折折射射光光线线a、b与与原原光光线线相相比比，更更偏偏离离于于光光轴轴，此此时时折折射射光光线线a、b动动量量的的改改变变的的合合成成应应当当向向上上，因因为为动动量量守守恒恒，粒粒子子应应当当受受到到一一个个向向下下的的力力。即即粒粒子子受受到到一一个个推推力力，被被推推向向焦焦点点方方向向。粒粒子最终在光轴的某一个平衡位置上静止。子最终在光轴的某一个平衡位置上静止。32实实际际上上，图图4A中中，光光照照在在粒粒子子上上还还有有不不少少散散射射，散散射射光光的的合合成成动动量量向向上上，则则粒粒子子受受到到向向下下的的力力，散散射射力力将将粒粒子子向向光光传传播播方方向向推。但散射力小于折射光线产生的力。推。但散射力小于折射光线产生的力。对图对图4B也可作类似分析。也可作类似分析。总总之之，粒粒子子所所受受的的轴轴向向梯梯度度力力在在Z轴轴方方向向上上可可能能是是拉拉力力，也也可可能能是是推推力力。使使粒粒子子处处于于平平衡衡位位置置。当当然然粒粒子子如如果果不不处处在在平平面面的的平衡位置，还可能被拉（推）向平面的光轴位置。平衡位置，还可能被拉（推）向平面的光轴位置。33三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 影响光阱的因素影响光阱的因素a)主要因素：如果在某个方向上要限制粒子的运动，主要因素：如果在某个方向上要限制粒子的运动，就必须使光在该方向上有大的光强梯度就必须使光在该方向上有大的光强梯度b)其它因素：粒子的物理、生物性质其它因素：粒子的物理、生物性质 采用光的波长、功率、会聚后的束腰半径采用光的波长、功率、会聚后的束腰半径 生物粒子大小、吸收系数生物粒子大小、吸收系数 粒子与液体的折射率粒子与液体的折射率 球心与光轴的距离和球心与束腰的距离球心与光轴的距离和球心与束腰的距离34三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 Z方向的捕获力定性分析方向的捕获力定性分析 图图5说明会聚高斯光束在传播方向说明会聚高斯光束在传播方向Z，所受的力所受的力F(Z)与与 的关系。的关系。35 图图5 会聚的高斯光束（会聚的高斯光束（Z）方向上捕获力的分析）方向上捕获力的分析 图图5说明会聚高斯光束在传播方向说明会聚高斯光束在传播方向Z，所受的力，所受的力F(Z)与与 的的 关系，图中关系，图中 为球中心到焦点的距离，是一个变量，而为球中心到焦点的距离，是一个变量，而r为粒子的半径，是一个常量。曲线的坐标原点为束腰（或焦为粒子的半径，是一个常量。曲线的坐标原点为束腰（或焦点）处在位置。点）处在位置。36曲线在曲线在 坐标上交于坐标上交于A、B两点是粒子受力的平衡位置。该平衡位置两点是粒子受力的平衡位置。该平衡位置不处在焦点处，是因为粒子受到了散射力，散射力的方向是向上的，不处在焦点处，是因为粒子受到了散射力，散射力的方向是向上的，F(z)中包含了散射力，在中包含了散射力，在A处，即时，（在焦点上端若干距离），处，即时，（在焦点上端若干距离），F(z)=0，F(z)中的散射力（向上）与梯度力（向下）相抵消。中的散射力（向上）与梯度力（向下）相抵消。图图5的条件是：高斯光束聚焦于小于的条件是：高斯光束聚焦于小于1微米，而粒子直径为几微米。微米，而粒子直径为几微米。37v对图对图5的讨论如下：的讨论如下：a)曲线与水平轴的两交点（曲线与水平轴的两交点（A、B）是粒子在）是粒子在Z轴的平衡点，轴的平衡点，F(z)=0，但两，但两点的情况大不相同，对于点的情况大不相同，对于A点，不论增加或减少均受到与移动方向相反点，不论增加或减少均受到与移动方向相反的力（的力（）、）、所以所以A点是粒子的稳定平衡点。点是粒子的稳定平衡点。而对而对B点，点，即粒子只要偏离即粒子只要偏离B点，就会受到向相同点，就会受到向相同方向的力，而被推向更远，所以方向的力，而被推向更远，所以B点是非稳定平衡点。点是非稳定平衡点。由此可见，单光束势阱在由此可见，单光束势阱在A点附近，（略高于焦点）点附近，（略高于焦点）38b)对应于不同的物理和生物条件，粒子所处的平衡位置不同，一般说来距对应于不同的物理和生物条件，粒子所处的平衡位置不同，一般说来距焦点的距离与小球的半径相近焦点的距离与小球的半径相近c)在在A点右侧近似无限高势垒，在点右侧近似无限高势垒，在A-B之间，粒子均会被推向之间，粒子均会被推向A点。点。d)形成势垒的因素：光束束腰大小，波长，光功率密度，粒子折射率形成势垒的因素：光束束腰大小，波长，光功率密度，粒子折射率39三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 阱力的计算和测量阱力的计算和测量a)计算计算 Roosen与与Ashkin采用几何学分析采用几何学分析 Tom Q等发展了新的动力学方法等发展了新的动力学方法b)测量测量 实验上测量捕获力的方法，是将粒子放在已知实验上测量捕获力的方法，是将粒子放在已知粘滞系数的液体中，用光钳拖动粒子，测出光钳克服粘滞系数的液体中，用光钳拖动粒子，测出光钳克服粒子粘滞力的最大速度，也就是测量小球在光阱作用粒子粘滞力的最大速度，也就是测量小球在光阱作用下通过媒质的临界粘滞力。下通过媒质的临界粘滞力。40三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 阱力的计算和测量阱力的计算和测量 该粘滞力由斯托克斯定律确定，该粘滞力由斯托克斯定律确定，粒子粘滞系数；粒子粘滞系数；r：粒子半径；：粒子半径；v：运动速度，当用红：运动速度，当用红外光作光阱光源时，小球受力的一个实验经验公式为：外光作光阱光源时，小球受力的一个实验经验公式为：，：媒质折射率；：媒质折射率；W：光功率；：光功率；C：光速，：光速，是光被小球完全吸收时，小球所受力。即小球受力是是光被小球完全吸收时，小球所受力。即小球受力是完全吸收表面受力的百份之三完全吸收表面受力的百份之三。41三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 粒子的大小与形状粒子的大小与形状v光钳可操纵的生物粒子都是在光学显微镜下工作，并能用光学光钳可操纵的生物粒子都是在光学显微镜下工作，并能用光学显微镜观察生物粒子，其尺寸在微米量级（显微镜观察生物粒子，其尺寸在微米量级（Mie氏粒子），其氏粒子），其受力分析可采用几何学方法。受力分析可采用几何学方法。v而对于小于微米量级的粒子受力分析复杂，不属几何光学范围；而对于小于微米量级的粒子受力分析复杂，不属几何光学范围；详见详见李银妹李银妹书第六章译文。书第六章译文。v粒子的尺寸应当比高斯光束焦斑大。这样才处于高斯光束的梯粒子的尺寸应当比高斯光束焦斑大。这样才处于高斯光束的梯度场中，受到梯度力的束缚，如果粒子尺寸小于光斑尺寸，则度场中，受到梯度力的束缚，如果粒子尺寸小于光斑尺寸，则光线光线（垂直）作用于粒子，而不是倾斜的照射，这时粒子受（垂直）作用于粒子，而不是倾斜的照射，这时粒子受到推力，将被推出焦点之外。到推力，将被推出焦点之外。42三、光镊基本原理三、光镊基本原理3.5 阱力与束缚条件阱力与束缚条件 粒子的折射率粒子的折射率 和媒质折射率和媒质折射率光光镊镊形形成成的的条条件件是是：粒粒子子的的折折射射率率大大于于媒媒质质折折射射率率。反之受力相反，粒子被踢出光场。反之受力相反，粒子被踢出光场。实际上可通过一个小珠，光镊先镊住透明的小珠，实际上可通过一个小珠，光镊先镊住透明的小珠，再通过小珠去粘住要操纵的粒子。再通过小珠去粘住要操纵的粒子。43四、光镊实验装置四、光镊实验装置44图图图图6 6 光镊实验装置光镊实验装置光镊实验装置光镊实验装置45 图图6 以倒置生物显微镜为基础的光镊装置框图。以倒置生物显微镜为基础的光镊装置框图。它包含捕获光源、捕获聚焦镜、一个合适的样品室，一套它包含捕获光源、捕获聚焦镜、一个合适的样品室，一套可调节光钳与待捕获粒子间距并对粒子进行操作的装置，实可调节光钳与待捕获粒子间距并对粒子进行操作的装置，实现各配件与显微镜光学偶合的器件，以及一套观察和记录光现各配件与显微镜光学偶合的器件，以及一套观察和记录光钳对粒子操作过程，阱中粒子运动状态钳对粒子操作过程，阱中粒子运动状态 瞬息变化的实时监测瞬息变化的实时监测系统。该装置可将激光会聚成光波长量级的衍射极限光斑，系统。该装置可将激光会聚成光波长量级的衍射极限光斑，可产生足够陡的梯度场从而形成一个单光束梯度力阱。可产生足够陡的梯度场从而形成一个单光束梯度力阱。46 2、捕获光源、捕获光源 a)模式选择模式选择 因为高斯分布有利于在平面形成梯度力，所以要用单模光束因为高斯分布有利于在平面形成梯度力，所以要用单模光束 b)工作方式工作方式 捕获过程需要一定时间操作，所以必须用连续或准连续输出捕获过程需要一定时间操作，所以必须用连续或准连续输出的激光的激光47 c)波长选择波长选择 从光镊的形成过程可知，主要起作用的是从粒子中输出的折从光镊的形成过程可知，主要起作用的是从粒子中输出的折 射光。此外，应当避免粒子的吸收峰，否则在强聚焦的光束射光。此外，应当避免粒子的吸收峰，否则在强聚焦的光束下，粒子会因为强吸收而过热，受到损害，避开所要操作粒下，粒子会因为强吸收而过热，受到损害，避开所要操作粒子的吸收带，是光镊所用光源的重要依据。子的吸收带，是光镊所用光源的重要依据。48 c)波长选择波长选择 以下是几种物质的吸收峰：细胞中的叶绿素：可见光以下是几种物质的吸收峰：细胞中的叶绿素：可见光 藻细胞：藻细胞：632.8nm HeNe激光激光 DNA：263nm紫外光紫外光 水水：1.3 微米，微米，10.6微米红外光微米红外光49 如果采用可见光，则激光通过显微系统的各个光学元件入射如果采用可见光，则激光通过显微系统的各个光学元件入射到液体上（粒子是悬浮在液体上），漫反射造成的杂散光将充到液体上（粒子是悬浮在液体上），漫反射造成的杂散光将充满整个视场，严重影响生物样品的清晰度。为了消除此杂散光，满整个视场，严重影响生物样品的清晰度。为了消除此杂散光，可以在观察光通道中加入相应的滤光片，如对可以在观察光通道中加入相应的滤光片，如对632.8nm的激光的激光加一个对该波长高反射的滤光片，但此时照明光中的相当一部加一个对该波长高反射的滤光片，但此时照明光中的相当一部分光被滤掉，从而视场被着色且变暗，而影响观察，所以光镊分光被滤掉，从而视场被着色且变暗，而影响观察，所以光镊光源应尽可能避免用可见光。光源应尽可能避免用可见光。50 d)光功率范围光功率范围 在稳定的捕获下，激光功率与粒子受力成正比，激光功率在稳定的捕获下，激光功率与粒子受力成正比，激光功率大小一方面要考虑能产生稳定的捕获与操作，这依赖于粒子的大小一方面要考虑能产生稳定的捕获与操作，这依赖于粒子的个体性质，与光学系统的质量，不同的生物样品，阈值是不一个体性质，与光学系统的质量，不同的生物样品，阈值是不一样的。另一方面，在满足稳定捕获的条件下，应取最小的激光样的。另一方面，在满足稳定捕获的条件下，应取最小的激光功率以减少光损伤。功率以减少光损伤。几毫瓦到几十毫瓦的能量在微米尺寸上将产生几十到几百几毫瓦到几十毫瓦的能量在微米尺寸上将产生几十到几百皮牛的力，这足以克服微米级粒子的重力，布朗运动或或鞭毛皮牛的力，这足以克服微米级粒子的重力，布朗运动或或鞭毛动力原和原动力蛋白产生的几皮牛的力。动力原和原动力蛋白产生的几皮牛的力。所以实际应用中只需要一个小功率激光器即可。所以实际应用中只需要一个小功率激光器即可。同时应当要求激光功率输出稳定较好。同时应当要求激光功率输出稳定较好。51 e)实用的光钳光源实用的光钳光源 目前采用以下光源：目前采用以下光源：1.1064微米，微米，Nd:YAG，0.1-100mW,光稳定光稳定10%2.激光泵浦激光泵浦 钛宝石，钛宝石，605-1030纳米可调，用波长可纳米可调，用波长可 调较为理想，但价格高调较为理想，但价格高 3.HeNe，632.8nm，514.488nm,可见光，不理想可见光，不理想 4.LD泵浦的泵浦的Nd:YAG，10-350mW-1000mW,稳定性稳定性 0.1%-0.2%,好好 5.LD激光器，（激光器，（GaAlAs）10mW,，780nm，830nm均可调，均可调，52 e)实用的光镊光源实用的光镊光源 A.Ashkim认为认为680-950nm波长，小体积，使用方便，波长，小体积，使用方便，稳定性好，造价低，是理想光源。稳定性好，造价低，是理想光源。53v 3、捕获聚焦镜、捕获聚焦镜v在对激光微束的研究中可知，为保证激光微束的小尺寸光斑以在对激光微束的研究中可知，为保证激光微束的小尺寸光斑以及最大的传输效率，要采用小焦距、大数值孔径的高倍物镜与低及最大的传输效率，要采用小焦距、大数值孔径的高倍物镜与低目镜的组合。如采用目镜的组合。如采用NA=1.25的的100 x物镜就是较理想的捕获聚焦物镜就是较理想的捕获聚焦镜镜v以显微物镜为核心的显微镜光学系统正是光钳微米级操作的显以显微物镜为核心的显微镜光学系统正是光钳微米级操作的显微观察必备装置，通常用一个激光发生器与一台显微镜构成光钳。微观察必备装置，通常用一个激光发生器与一台显微镜构成光钳。v但高倍、大数值孔径的物镜工作距离特别是垂直入射式显微镜但高倍、大数值孔径的物镜工作距离特别是垂直入射式显微镜不利于生物样品的放置，无菌操作以及其它辅助设备的运用。相不利于生物样品的放置，无菌操作以及其它辅助设备的运用。相比之下，倒置的相差生物显微镜较能兼容其它显微操作，但普通比之下，倒置的相差生物显微镜较能兼容其它显微操作，但普通的显微镜的相差物镜最大倍数为的显微镜的相差物镜最大倍数为40X，并且不透紫外光，这将不，并且不透紫外光，这将不利于阱力和用于紫外光工作的其它附加设备。利于阱力和用于紫外光工作的其它附加设备。v因此，最理想的是：配有可选用于紫外到近红外的大数值孔径因此，最理想的是：配有可选用于紫外到近红外的大数值孔径（NA1.25）高放大率）高放大率100X物镜物镜54v 4、操作阱台、操作阱台v阱台就是显微镜中的操作台，它用于承载样品室。操作台在阱台就是显微镜中的操作台，它用于承载样品室。操作台在x、y平面及光轴平面及光轴Z轴方向均可连续调节。由于光钳作用的粒子在级，轴方向均可连续调节。由于光钳作用的粒子在级，相应要求相应要求三维阱台的操作精度在微米或亚微米级三维阱台的操作精度在微米或亚微米级。v普通的显微镜操作作为在普通的显微镜操作作为在Z方向精度为方向精度为2微米（即调焦精度），在微米（即调焦精度），在x、y评脉内操作精度更低，但可满足一般的光钳捕获生物细胞的评脉内操作精度更低，但可满足一般的光钳捕获生物细胞的实验室演示或定性分析。如果要对光钳的力参数进行调整，以及实验室演示或定性分析。如果要对光钳的力参数进行调整，以及对光钳操作细胞过程定量测量，则必须提高机械操作精度。方法对光钳操作细胞过程定量测量，则必须提高机械操作精度。方法是：是：采用精密机械传动结构，配以高精度的步进电机来驱动阱台，采用精密机械传动结构，配以高精度的步进电机来驱动阱台，以实验小于以实验小于2微米的调节精度。采用步进电机调节还可以微米的调节精度。采用步进电机调节还可以实现自实现自动化。动化。v还有采用阱台静止，而调节激光光束的方法，但难度较大，详见还有采用阱台静止，而调节激光光束的方法，但难度较大，详见李李书，译文书，译文55v 5、样品与样品室、样品与样品室v样品样品v样品不仅是被光操作对象，而且是一个积极的参与者，其大小，样品不仅是被光操作对象，而且是一个积极的参与者，其大小，形状，活性，透明对光的折射、吸收影响，因此，每一种样品都形状，活性，透明对光的折射、吸收影响，因此，每一种样品都有其对应的物理参数。有其对应的物理参数。v样品的厚度，应当限制在捕获显微镜的焦深之内，在离焦处所产样品的厚度，应当限制在捕获显微镜的焦深之内，在离焦处所产生的光散射，光弥散影响成像质量。样品应具有良好的透光性生的光散射，光弥散影响成像质量。样品应具有良好的透光性v样品室样品室v光镊常用于分选细胞，分选细胞的样品室在结构上有其特殊的要光镊常用于分选细胞，分选细胞的样品室在结构上有其特殊的要求，如在两样品室之间设置一个略大于分选细胞大小的微管，则求，如在两样品室之间设置一个略大于分选细胞大小的微管，则可用光镊将细胞以一个样品室中输送到另一个样品室中实现分选，可用光镊将细胞以一个样品室中输送到另一个样品室中实现分选，或在一个样品室中设置相应大小的屏障来隔离被分选了的细胞。或在一个样品室中设置相应大小的屏障来隔离被分选了的细胞。56v 6、显微动态监测、显微动态监测v光镊系统必须观察光镊系统必须观察2种运动：种运动：光镊操作样品的运动光镊操作样品的运动样品作为样品作为生物体自身的运动（细胞生长、游动、繁殖）以及在液体中的布生物体自身的运动（细胞生长、游动、繁殖）以及在液体中的布朗运动等，要求实时显示，能够摄影，摄象，朗运动等，要求实时显示，能够摄影，摄象，并且有较好的空间并且有较好的空间成象分辨率与时间分辨率，以及好的色分辨本领。采用一套电视成象分辨率与时间分辨率，以及好的色分辨本领。采用一套电视摄象，录象系统与光镊偶合能基本满足显微动态观察要求。摄象，录象系统与光镊偶合能基本满足显微动态观察要求。v空间分辨率的极限取决于显微物镜的数值孔径，同时也受显微镜空间分辨率的极限取决于显微物镜的数值孔径，同时也受显微镜放大倍数的影响。如果显微镜总的放大倍数不够，表示物镜本身放大倍数的影响。如果显微镜总的放大倍数不够，表示物镜本身的分辨率没有充分利用。这是可以通过摄象机和监视器的电放大的分辨率没有充分利用。这是可以通过摄象机和监视器的电放大予以补偿。（因为，显微镜总的放大倍数与显微镜的传光效率是予以补偿。（因为，显微镜总的放大倍数与显微镜的传光效率是个矛盾，这在以前激光技术中已提及，因此显微镜是采用低倍目个矛盾，这在以前激光技术中已提及，因此显微镜是采用低倍目镜与高倍物镜的组合，其总放大倍数有一定的限制）镜与高倍物镜的组合，其总放大倍数有一定的限制）57 6、显微动态监测、显微动态监测v色彩将提高人的视觉效果且可以区别在同等灰度下的物色彩将提高人的视觉效果且可以区别在同等灰度下的物体。因此，当空间分辨率达到极限时，加上彩色无疑将体。因此，当空间分辨率达到极限时，加上彩色无疑将增强观察效果，提高色分辨率，可以通过彩色摄象、计增强观察效果，提高色分辨率，可以通过彩色摄象、计算机基本以伪彩色处理或用光学显色偏振的方法实现。算机基本以伪彩色处理或用光学显色偏振的方法实现。v时间分辨率的提高，可以通过采用的录象的静放、慢放、时间分辨率的提高，可以通过采用的录象的静放、慢放、以及摄象机的高速快门等功能予以实现。从而获取光钳以及摄象机的高速快门等功能予以实现。从而获取光钳操纵粒子在时间序列上的细微变化。操纵粒子在时间序列上的细微变化。58 7、光耦合器、光耦合器v在光摄的制作系统中，一个重要的问题是如何将光摄光源与显微在光摄的制作系统中，一个重要的问题是如何将光摄光源与显微镜的光学系统相耦合的问题。要求增加的光源与光学元件不影响镜的光学系统相耦合的问题。要求增加的光源与光学元件不影响显微镜原来的成象系统的分辨率、清晰度，并与显微光学系统共显微镜原来的成象系统的分辨率、清晰度，并与显微光学系统共焦。焦。v对一台对一台有外荧光接口的显微镜有外荧光接口的显微镜，利用这一接口，作为激光通道是，利用这一接口，作为激光通道是简单而行之有效的。没有外荧光接口，也可以利用照相接口，但简单而行之有效的。没有外荧光接口，也可以利用照相接口，但这样就无法接摄象机或显微摄影系统，（显微摄影系统对摄象系这样就无法接摄象机或显微摄影系统，（显微摄影系统对摄象系统分辨率更高），这时，应当分别外再开一个接口，耦合入光钳统分辨率更高），这时，应当分别外再开一个接口，耦合入光钳光源。光源。v此外在系统中，还要加入一个与光轴此外在系统中，还要加入一个与光轴45度角放置的光学平板，它度角放置的光学平板，它可反射、透射不同的波长，（镀膜）。附加系统还包括不同光波可反射、透射不同的波长，（镀膜）。附加系统还包括不同光波长的激光与显微共焦所需的修正色差的透镜组，保持外加系统与长的激光与显微共焦所需的修正色差的透镜组，保持外加系统与显微镜共焦的修正光学元件等。显微镜共焦的修正光学元件等。591.3、光阱力的计算与测量v斯托克斯定律：流体力学中的流体力学中的Stokes公式：公式：-液体粘滞系数 -微粒的半径 -粒子运动速度601.3、光阱力的计算与测量v当光镊捕获粒子后，使其在液体中水平移动，移动速度越大，所受到的液体粘滞阻力也越大，如粒子不脱离光镊，而光镊的移动可近似地看作是匀速运动。则此时光阱力与粘滞阻力平横实验可使光镊加快移动速度，在粒子被脱离光镊瞬间的一段过程，将其摄像，然后，以粒子脱离时的一小段距离求出其速度，计算出的粘滞阻力可近似看作是最大阱力。61捕获光捕获光1.模式选择：单模光束 ，因为高斯分布