高效液相色谱结果分析.pptx

高效液相色谱高效液相色谱结果处理与分析结果处理与分析第二部分第二部分(High performance Liquid Chromatography，HPLC)一、色谱数据处理一、色谱数据处理二、色谱图二、色谱图三、色谱图名词术语三、色谱图名词术语四、色谱峰检测四、色谱峰检测五、五、HPLCHPLC测定步骤与内容测定步骤与内容一一.色谱数据处理色谱数据处理检测器检测器记录仪记录仪积分仪积分仪色谱工作站色谱工作站色谱仪信号输出图色谱仪信号输出图l色色谱谱数数据据处处理理是是通通过过ADCADC转转换换器器,把把模模拟拟信信号号转转换换成成数数字信号字信号,然后采用色谱软件处理给出然后采用色谱软件处理给出色谱图色谱图等信息。等信息。l数据处理原理数据处理原理自动处理自动处理人工修正人工修正 峰的检测峰的检测 数据采集数据采集 基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离 l数据处理方法数据处理方法l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图曲线图,其纵坐标为信号强度其纵坐标为信号强度,横坐标为时间横坐标为时间二二.色谱图色谱图(Chromatogram)样品组分分离示意图样品组分分离示意图三三.色谱图名词术语色谱图名词术语(1)(1)l色色谱谱峰峰(Peak):(Peak):色色谱谱柱柱流流出出组组分分通通过过检检测测器器时时产产生生的的响响应信号应信号.l峰底峰底(Peak Base):(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线.l峰高峰高(Peak Height):(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离.色谱峰色谱峰时间时间(分分)峰高峰高峰底峰底响应值响应值(mV)基线基线l切线峰宽切线峰宽(Peak Width,峰宽峰宽):):在峰两侧拐点处所作切线在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离与峰底相交两点之间的距离.l半半峰峰宽宽(Peak Width at Half Height):):通通过过峰峰高高的的中中点点作作平平行行于于峰峰底底的的直直线线，此此直直线线与与峰峰两两侧侧相相交交两两点点之之间间的的距距离离.l峰面积峰面积(Peak Area):(Peak Area):峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值.三三.色谱图名词术语色谱图名词术语(2)(2)色谱峰的判断色谱峰的判断 (最小面积最小面积)响应值响应值时间时间峰面积峰面积切线切线半峰宽半峰宽切线峰宽切线峰宽三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(3)(3)l保保留留时时间间(T(TR R)(Retention)(Retention time):time):组组分分从从进进样样到到出出峰峰最最大大值所需的时间值所需的时间.l死死时时间间(t(t0 0)(Dead)(Dead time):time):不不被被固固定定相相滞滞留留组组分分的的出出峰峰时时间间.（其其测测定定测测定定通通常常是是使使用用不不被被柱柱子子保保留留而而又又有有紫紫外外吸吸收收的的惰惰性性物物质质，例例如如：正正相相色色谱谱常常用用四四氯氯化化碳碳，反反相相色色谱谱常用常用甲醇、尿嘧啶、甲醇、尿嘧啶、NaNO3NaNO3等）等）.l调整保留时间：调整保留时间：t tR R t tR Rt t0 0l保保留留体体积积(V(VR R)(Retention)(Retention volume):volume):组组分分从从进进样样到到出出现现峰最大值所需的流动相体积峰最大值所需的流动相体积.l死死体体积积(V V0 0)(Dead)(Dead volume):volume):不不被被固固定定相相滞滞留留的的组组分分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.l调整保留体积：调整保留体积：V VR RV VR RV V0 0t tR R F FC C lF Fc c:流动相的流速流动相的流速 mL/min.mL/min.三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(4)(4)l谱谱带带扩扩展展(Band(Band Broadening):Broadening):由由于于纵纵向向扩扩散散,传传质质阻阻力力等等因因素素的的影影响响,使使组组分分在在色色谱谱柱柱内内移移动动过过程程中中谱谱带带宽宽度增加的现象度增加的现象.三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(5)(5)三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(6)(6)l拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰.l前伸峰前伸峰(Leading Peak):Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰.l鬼峰鬼峰(Ghost Peak):Ghost Peak):并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰,亦称假峰亦称假峰.Excellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=4正常前伸三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(7)(7)l基基线线(Baseline):Baseline):在在正正常常操操作作条条件件下下,仅仅由由流流动动相相所所产产生生的响应信号的响应信号.l基基线线噪噪声声(Baseline(Baseline Noise):Noise):由由各各种种因因素素所所引引起起的的基基线线波动波动.l基基线线飘飘移移(Baseline Baseline Drift):Drift):基基线线随随时时间间定定向向的的缓缓慢慢变变化化.基线基线基线噪音基线噪音基基线线飘飘移移峰宽半峰宽标准偏差l标标准准偏偏差差()(Standard()(Standard deviation):deviation):0.6070.607倍倍峰峰高高处处峰峰宽宽的的一一半半，为为便便于于测测量量，改改用用半半峰峰宽宽。目目的的是为了计算柱效率是为了计算柱效率(柱效柱效)。l柱效柱效（理论塔板数）（理论塔板数）：或或三三.液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(8)(8)进样进样图示中塔板数为图示中塔板数为3.3.l 塔板理论塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡类似蒸馏中的气液平衡l峰峰的的检检测测和和判判别别是是依依据据在在基基线线的的讯讯号号水水平平上上，预预设设一一个个“阈阈值值”，超超过过该该值值时时，判判别别为为峰峰可可开开始始检检测测。一一般般采采用下面两种方式判别峰讯号的变化：用下面两种方式判别峰讯号的变化：依依照照信信号号斜斜率率的的变变化检测信号化检测信号依依照照积积分分面面积积检检测测峰信号峰信号四四.色谱峰检测色谱峰检测切线 色谱峰的判断 最小面积五五.HPLC 测定步骤与内容测定步骤与内容1.1.确确定定色色谱谱条条件件:色色谱谱柱柱的的选选择择，流流动动相相、流流速速、检测波长、柱温及进样量等。检测波长、柱温及进样量等。2.2.绘制标准工作曲线绘制标准工作曲线3.3.精密度试验与回收率试验精密度试验与回收率试验4.4.实际样品含量测定实际样品含量测定1.1.确定色谱条件确定色谱条件l 色谱柱的选择色谱柱的选择l 流动相流动相l 流速流速l 检测波长检测波长l 柱温柱温l 进样量进样量2.2.绘制标准工作曲线绘制标准工作曲线l标准曲线是定量分析的根本依据标准曲线是定量分析的根本依据.l药药物物浓浓度度（或或质质量量）与与药药物物在在检检测测器器上上的的产产生生的的信信号号（通常采用峰面积（通常采用峰面积A A）成比例）成比例(正比正比).).l标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度.l标准曲线线性一般采用标准曲线线性一般采用5-95-9点，并非点越多越好点，并非点越多越好!l准准确确度度 指指用用该该方方法法测测定定的的结结果果与与真真实实值值或或参参考考值值接接近近的程度，用百分回收率表示。的程度，用百分回收率表示。l相相对对回回收收率率 直直接接反反映映测测定定结结果果与与真真实实值值的的接接近近程程度度,应应控制在控制在100%100%左右左右(95%(95%105%)105%)。l绝绝对对回回收收率率 模模拟拟生生物物样样品品经经整整个个样样品品处处理理过过程程,而而相相应应标标准准溶溶液液直直接接分分析析,两两者者的的响响应应值值之之比比称称为为绝绝对对回回收收率率。绝绝对对回回收收率率一一般般应应大大于于70%,70%,过过低低说说明明方方法法中中待待测测物物质损失严重。质损失严重。l测测定定回回收收率率R R（recoveryrecovery）的的具具体体方方法法可可采采用用“回回收收试试验法验法”和和“加样回收试验法加样回收试验法”。3.3.准确度准确度(accuracy)(accuracy)(1)(1)回回收收试试验验 空空白白+已已知知量量A A的的对对照照品品（或或标标准准品品）测测定定，测定值为测定值为 M M回收率回收率100%=AMR空白空白X(2)(2)加加样样回回收收试试验验 已已准准确确测测定定药药物物含含量量P P的的真真实实样样品品+已已知量知量A A的对照品（或标准品）测定，测定值为的对照品（或标准品）测定，测定值为M M100%X=APMR 数据要求数据要求 在规定的范围内，至少用在规定的范围内，至少用9 9次测定结果评价，次测定结果评价，如高、中、低三个不同浓度样品各测三次如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.回收率回收率4.4.精密度精密度(precision)(precision)l精精密密度度是是指指在在规规定定条条件件下下，同同一一个个均均匀匀样样品品，经经多多次次取取样样测测定定所所得得结结果果之之间间的的接接近近程程度度,表表示示测测定定的的重重现现性性。用用偏偏差差（d d）、标标准准偏偏差差(SD SD)、相相对对标标准准偏偏差差(RSD RSD)()(变变异异系系数，数，CV CV)表示表示.(1)(1)偏差偏差(d d）：）：测量值与平均值之差测量值与平均值之差(2)(2)标准标准(偏偏)差差(SD(SD或或S S）(3)(3)相对标准相对标准(偏偏)差（差（RSDRSD），），也称变异系数也称变异系数(CV,(CV,有日内有日内变异与日间变异两种变异与日间变异两种)5.5.检测限检测限(limit of detection,LOD)(limit of detection,LOD)l指指在在确确定定的的实实验验条条件件下下，HPLCHPLC能能检检测测出出待待测测物物的的最最低低浓浓度度或或含含量量。(是是限限度度检检验验效效能能指指标标，无无需需定定量量测测定定，只只要指出高于或低于该规定浓度即可要指出高于或低于该规定浓度即可).).(1)(1)信信噪噪比比法法 把把已已知知低低浓浓度度试试样样测测出出的的信信号号与与空空白白样样品品测测出出的的信信号号进进行行比比较较，算算出出能能被被可可靠靠地地检检测测出出的的最最低低浓浓度度或或量量。一一般般以以信信噪噪比比（S/NS/N）3131或或2121时时的的相相应应浓度或量确定检测限。浓度或量确定检测限。(2)(2)非非仪仪器器分分析析目目视视法法 用用已已知知浓浓度度的的被被测测物物，试试验验出出能被可靠地检测出的最低浓度或量能被可靠地检测出的最低浓度或量.l指指样样品品中中被被测测物物能能被被定定量量测测定定的的最最低低量量，结结果果应应具具有有一一定准确度和精密度要求。定准确度和精密度要求。6.6.定量限定量限(1imit of quantitation(1imit of quantitation，LOQ)LOQ)(1)(1)信噪比法确定定量限信噪比法确定定量限，一般以信噪比（，一般以信噪比（S/NS/N）为）为101101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定时相应的浓度或注入仪器的量进行确定.(2)(2)按按19841984年年国国际际纯纯粹粹和和应应用用化化学学联联合合会会(IVPAC)(IVPAC)规规定定：用用仪仪器器所所测测空空白白背背景景响响应应标标准准差差（SDSD）的的1010倍倍为为估估计计值值，再经试验确定方法的实际测定下限再经试验确定方法的实际测定下限.7 7.专属性专属性(specificity,(specificity,或称选择性）或称选择性）l指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情况指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是用于法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.8.8.线性（线性（LinearityLinearity）l在在设设计计范范围围内内，测测试试结结果果与与试试样样中中被被测测物物浓浓度度呈呈正正比比关关系的程度。系的程度。l线线形形通通常常用用最最小小二二乘乘法法处处理理数数据据求求得得回回归归曲曲线线的的斜斜率率（SlopeSlope）来表示。）来表示。l数数据据要要求求：至至少少需需要要五五个个浓浓度度考考察察线线形形，需需提提供供相相关关系系数数、y y截截距距（检检定定的的可可能能偏偏差差）、回回归归斜斜率率及及方方差差等等参参数，应列出回归方程数和线性图。数，应列出回归方程数和线性图。l指指达达到到一一定定精精密密度度、准准确确度度和和线线性性的的条条件件下下，测测试试方方法法适用的高、低限浓度或量的区间。适用的高、低限浓度或量的区间。l范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：9.9.范围（范围（RangeRange）含量测定范围为含量测定范围为80%-120%80%-120%；含量均匀度范围为含量均匀度范围为70%-130%70%-130%；杂质测定应为被测杂质限度的杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%50%-120%；溶出度应为测定范围的溶出度应为测定范围的20%20%。l指指测测定定条条件件稍稍有有变变动动时时，结结果果不不受受影影响响的的承承受受程程度度，为为常常规规检检验验提提供供依依据据。是是衡衡量量实实验验室室和和工工作作人人员员之之间间在正常情况下实验结果重现性的尺度。在正常情况下实验结果重现性的尺度。l分分析析方方法法重重现现性性的的测测定定是是通通过过在在不不同同的的实实验验室室内内不不同同的的实实验验者者对对同同一一样样品品的的分分别别测测试试而而获获得得的的。(获获得得的的这这种种再再与与正正常常检检定定下下的的精精密密度度进进行行比比较较,从从而而确确定定该该法法的的耐用性耐用性,或称粗放度或称粗放度).).10.10.耐用性耐用性(1)(1)鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求.(2)(2)杂杂质质的的限限量量检检查查除除专专属属性性、检检测测限限、耐耐用用性性外外,其其它它都都不要求。不要求。(3)(3)杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。(4)(4)含含量量测测定定及及溶溶出出量量测测定定除除检检测测限限、定定量量限限外外，其其它它都都要求。要求。11.11.应用应用0.20.61.01.41.82.22.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)