高效液相.pptx

2024/4/2 周二第第十十章章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、高效液相色谱高效液相色谱仪仪HPLC二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点feature of HPLC三、流程及主要部件三、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC第一节第一节第一节第一节高效液相色谱的高效液相色谱的高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器特点与仪器特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPLC2024/4/2 周二第一节第一节 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器与经典液相色谱法比较与经典液相色谱法比较与气相色谱法比较与气相色谱法比较高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点2024/4/2 周二 高高效效液液相相色色谱谱(HPLC)是是以以溶溶剂剂液液体体为为流流动动相相的的色色谱谱方方法法。按按照照固固定定相相不不同同可可分分为为：液液液液分分配配色色谱谱；吸吸附附色色谱谱(液液固固色色谱谱)；离离子子交交换换色色谱谱；尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)。早早期期液液相相色色谱谱，包包括括Tswett的的工工作作，都都是是在在直直径径15cm,长长50500cm的的玻玻璃璃柱柱中中进进行行的的。为为保保证证有有一一定定的的柱柱流流速速，填填充充的的固固定定相相颗颗粒粒直直径径多多在在150200 m范范围围内内。即即使使这这样样，流流速速仍仍然然很很低低(1mL/min)，分析时间仍然很长！，分析时间仍然很长！2024/4/2 周二 当当加加压压增增加加流流速速(真真空空或或空空气气泵泵)时时，尽尽管管分分析析时时间间减减少少，但但柱柱塔塔板板高高度度Hmin也也相相应应增增加加了了！或或者者说说柱柱效效下下降降了了。为为了了解解决决分分析析时时间间及及柱柱效效问问题题，人人们们认认识识到到：最最为为有有效效地地增增加加柱柱效效的的唯唯一一方方法法是是减减小小填填充充物的粒径（物的粒径（310 m）！）！直直到到60年年代代，由由于于在在高高压压下下操操作作的的液液压压设设备备、高高效效固固定定相相以以及及高高灵灵敏敏检检测测器器的的出出现现及及发发展展，才才彻彻底底解解决决了了分分析析时时间间及及柱柱效效的的问问题题。即即所所谓谓的的高高效效液液相色谱技术才真正得到广泛应用。相色谱技术才真正得到广泛应用。2024/4/2 周二1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高高速速：HPLC采采用用高高压压输输液液设设备备，流流速速大大增增加加，分分析析速速度度极极快快，只只需需数数分分钟钟；而而经经典典方方法法靠靠重重力力加料，完成一次分析需时数小时。加料，完成一次分析需时数小时。高高效效：填填充充物物颗颗粒粒极极细细且且规规则则，固固定定相相涂涂渍渍均均匀匀、传传质质阻阻力力小小，因因而而柱柱效效很很高高。可可以以在在数数分分钟钟内内完完成数百种物质的分离。成数百种物质的分离。高高灵灵敏敏度度：检检测测器器灵灵敏敏度度极极高高：UV10-9g,荧荧光光检测器检测器10-11g。2024/4/2 周二色谱柱色谱柱:柱长柱长/cm 10 25 10 200 柱内径柱内径/mm 2 10 10 50固定相粒度固定相粒度:粒径粒径/m 5 50 75 600 筛孔筛孔/目目 2500 300 200 30色谱柱入口压力色谱柱入口压力/MPa 2 20 0.001 0.1色谱柱柱效色谱柱柱效/(理论塔板数理论塔板数/m)2 103 5 104 2 50进样量进样量/g 10-6 10-2 1 10分析时间分析时间/h 0.05 1.0 1 20高效液相色谱法高效液相色谱法经典液相经典液相(柱柱)色谱法色谱法项目项目高效液相色谱法与经典液相高效液相色谱法与经典液相(柱柱)色谱法的比较色谱法的比较2024/4/2 周二2.HPLC与与GC的比较的比较分分析析对对象象及及范范围围：GC分分析析只只限限于于气气体体和和低低沸沸点点的的稳稳定定化化合合物物，而而这这些些物物质质只只点点有有机机物物总总数数的的20%；HPLC可可以以分分析析高高沸沸点点、高高分分子子量量的的稳稳定定或或不不稳稳定定化化合合物物，这这类类物质占有机物总数的物质占有机物总数的80%。2024/4/2 周二流流动动相相的的选选择择：GC采采用用的的流流动动相相中中为为有有限限的的几几种种“惰惰性性”气气体体，只只起起运运载载作作用用，对对组组分分作作用用小小；HPLC采采用用的的流流动动相相为为液液体体或或各各种种液液体体的的混混合合，可可供供选选择择的的机机会会多多。它它除除了了起起运运载载作作用用外外，还还可可与与组组分分作作用用，并并与与固固定定相相对对组组分分的的作作用用产产生生竞竞争争，即即流流动动相相对对分分离离的的贡贡献献很很大大，可可通通过过溶溶剂剂来来控控制制和改进分离。和改进分离。操作温度：操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下进行通常在室温下进行。2024/4/2 周二有机溶剂或一定有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液值的缓冲溶液按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子色谱离子色谱体积排阻色谱体积排阻色谱全多孔固全多孔固体吸附剂体吸附剂固定液固定液+载体载体高效微粒离高效微粒离子交换剂子交换剂不同孔径的不同孔径的多孔性凝胶多孔性凝胶固定相固定相流动相流动相分离原理分离原理平衡常数平衡常数不同极性不同极性有机溶剂有机溶剂不同极性有不同极性有机溶剂和水机溶剂和水不同不同 pH 值值的缓冲溶液的缓冲溶液吸附系数吸附系数(KA)分配系数分配系数 (KP)选择性系选择性系数数 (KS)分布系数分布系数 (KD)吸附吸附 解解吸吸溶解溶解 挥发挥发可逆性的可逆性的离子交换离子交换多孔凝胶的多孔凝胶的渗透或过滤渗透或过滤方法方法项目项目第一节第一节 高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述 高效液相色谱的分类高效液相色谱的分类2024/4/2 周二 高效液相色谱的应用范围和局限性高效液相色谱的应用范围和局限性应用范围应用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物，子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物，化工产品及环境污染物等等。化工产品及环境污染物等等。方法局限性：方法局限性：使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱比气相色谱的程序升温复杂比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器缺少通用的检测器 分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解的生物活性样品的生物活性样品2024/4/2 周二一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph2024/4/2 周二液相色谱仪（液相色谱仪（2）2024/4/2 周二液相色谱仪（液相色谱仪（3）2024/4/2 周二液相色谱仪（液相色谱仪（4）2024/4/2 周二二、二、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2024/4/2 周二三、流程及主要部件三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程2024/4/2 周二2.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2024/4/2 周二4.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2024/4/2 周二第第十十章章液相色谱分析法液相色谱分析法一、一、影响分离的因素影响分离的因素factors influenced separation二、分离类型的选择二、分离类型的选择choice of separation types三、液相色谱的应用三、液相色谱的应用application of HPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparative liquid chromatography第四节第四节第四节第四节影响分离的因素与操影响分离的因素与操影响分离的因素与操影响分离的因素与操作条件的选择作条件的选择作条件的选择作条件的选择high performance liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition2024/4/2 周二一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2024/4/2 周二 液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。2024/4/2 周二 2.2.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s时时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2024/4/2 周二二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of separation types2024/4/2 周二三、三、HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。2024/4/2 周二2.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2024/4/2 周二四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。2024/4/2 周二2.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。2024/4/2 周二3.3.制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm。2024/4/2 周二习题习题 9.用长用长15cm 的的ODS 柱分离二个组分，已知柱分离二个组分，已知在实验条件下柱效在实验条件下柱效n=2.84 104m-1。用苯磺酸钠。用苯磺酸钠溶液测得死时间溶液测得死时间tM=1.31min，二个组分的保留时，二个组分的保留时间分别为间分别为tR1=4.10min 及及 tR2=4.38min。（。（1）求）求k1，k2，R。（。（2）若增加柱长至）若增加柱长至30cm，分离，分离度可否达到度可否达到1.5？2024/4/2 周二解：解：2024/4/2 周二(2)已知已知2024/4/2 周二习题习题 10.在某一柱上分离一样品，得以下数据。在某一柱上分离一样品，得以下数据。组分组分A、B 及非滞留组分及非滞留组分 C 的保留时间分别为的保留时间分别为2min、5min 和和1min。求。求 （1）B 组分停留在固定相中的时间是组分停留在固定相中的时间是A组分组分的几倍？的几倍？（2）B组分的分配系数是组分的分配系数是A 组分的几倍？组分的几倍？（3）当柱长增加一倍时，峰宽增加多少倍？）当柱长增加一倍时，峰宽增加多少倍？2024/4/2 周二解：解：2024/4/2 周二2024/4/2 周二请选择内容请选择内容第一节第一节 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器feature and instrument of HPLC第二节第二节 基本原理与主要分离类型基本原理与主要分离类型basic principle and main separating type第三节第三节 固定相与流动相固定相与流动相stationary phase and mobile phase 第四节第四节 影响分离的因素与操作条件选择影响分离的因素与操作条件选择factors influenced separation and choice of operation condition结束结束结束结束