锌离子影响朊蛋白错误折叠机制研究.doc

分类号 密级
UDC 编号

武 汉 大 学
博 士 学 位 论 文

锌离子影响朊蛋白错误折叠
机制研究

：潘锴
指导教师姓名、职称：梁毅 教授、博导
：生物学 生物化学与分子生物学
：结构生物学

二〇一五年九月

Classified number: Secret grade:
UDC: Thesis number:

Wuhan University
Doctor of Philosophy Thesis

Mechanisms for Zinc Modification on Prion Protein Misfolding

Student name: Pan Kai
Name and Title of Adviser: Prof. Liang Yi
Faculty and Specialty: Biology, Biochemistry and Molecular biology
Research Area: Structural biology

September, 2015

郑重声明
本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，否则，本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明。
学位论文作者（签名）：
年月日

论文创新点
本文系统研究了锌离子影响朊蛋白聚集的分子机制，发现锌离子可以改变朊蛋白的聚集途径和聚集体的结构，野生型朊蛋白的聚集途径分为典型的四个阶段：无定形聚集体、原纤维、成熟纤维和片段化的纤维；加入100 mM锌离子后野生型朊蛋白则快速形成不溶于Sarcosyl的寡聚体，然后形成短棒状的聚集体。然而与野生型朊蛋白不同的是，八肽重复序列缺失的朊蛋白在加或不加锌离子的情况下都可以形成典型的纤维。因此锌离子改变朊蛋白聚集的途径和聚集体的结构主要通过锌离子与朊蛋白八肽重复序列的相结合，进而导致其N端的柔性区域和C端的球状区域相互作用来实现。本文还将紫外和硫黄素T荧光同时联合使用，并通过紫外吸收光谱的波峰和波谷的比值来反应蛋白质的结构变化，用这三个参数作图可以划分朊蛋白聚集过程的不同阶段。上述研究有益于阐释锌离子在prion疾病中的作用，并有助于解释锌离子修饰朊病毒株型的分子机制。
本文运用Western Blot和激光共聚焦显微技术证实了锌离子可以在神经细胞中引起朊蛋白的聚集，并通过免疫电镜发现这些聚集很可能是寡聚体。本文还通过加入高浓度的维生素c来诱导神经细胞死亡，探讨了锌离子所引起的朊蛋白聚集和神经细胞死亡的关系，神经细胞的死亡是锌离子所导致的朊蛋白聚集的必要条件。
目录
中文摘要 I
Abstract III
第一章 前言 1
1.1 朊病毒假说及其证实 1
1.2 Protein X 4
1.3 种间屏障和朊病毒株 5
1.4 细胞型朊蛋白概述 8
1.5 细胞型朊蛋白的生理功能 10
1.6 朊蛋白与锌离子 10
1.7 锌离子的生理功能和稳态 11
1.8 锌离子对细胞凋亡的影响 13
1.9 锌离子和神经细胞的死亡 14
1.10 离子和蛋白质聚集 16
1.11 Prion-like蛋白和神经退行性疾病 22
第二章 锌离子对人朊蛋白聚集途径和聚集体结构的影响 25
2.1 摘要 25
2.2 引言 25
2.3 实验材料和仪器 26
2.3.1 实验材料 26
2.3.2 主要仪器 26
2.4 实验方法 27
2.4.1 朊蛋白的原核表达与复性纯化 27
2.4.2 ThT荧光法检测纤维生长动力学 31
2.4.3 Sarcosyl-soluble SDS-PAGE实验 31
2.4.4 透射电镜观察聚集样品 32
2.4.5 等温滴定量热法测定锌离子和朊蛋白及其突变体的结合 32
2.4.6 圆二色光谱法测定蛋白的二级结构 33
2.4.7 圆二色光谱法测定蛋白质的热稳定性 34
2.4.8 傅里叶红外光谱法分析聚集体的二级结构 34
2.5 实验结果 35
2.5.1 人野生型朊蛋白及其突变体的分离纯化 35
2.5.2 ThT荧光法监测锌离子对人野生型朊蛋白及其突变体的聚集动力学的影响 36
2.5.3 Sarkosyl-soluble SDS-PAGE实验检测锌离子对人野生型朊蛋白及其突变体的聚集动力学的影响 39
2.5.4 透射电子显微镜观察锌离子对朊蛋白所形成聚集体形态的影响 41
2.5.5 高分辨率透射电子显微镜观察人野生型朊蛋白的聚集过程 42
2.5.6 等温滴定量热法研究锌离子和朊蛋白的结合 45
2.5.7 检测锌离子对朊蛋白及其突变体热稳定性的影响 49
2.5.8 检测锌离子对朊蛋白及其聚集体的二级结构的影响 51
2.5.9 蛋白酶K酶解实验检测朊蛋白聚集体的抗酶解能力 56
2.5.10 ThT-UV同步检测朊蛋白纤维生长动力学 59
2.6 讨论 62
第三章 锌离子对细胞水平朊蛋白聚集的影响 66
3.1 摘要 66
3.2 引言 66
3.3 实验材料和仪器 67
3.4 实验方法 67
3.4.1 相关缓冲液的配方 67
3.4.2 Western Blot对细胞内可溶于Sarcosyl的朊蛋白的检测 68
3.4.3 激光共聚焦显微镜观察样品制备 69
3.4.4 免疫电镜 70
3.5 实验结果 71
3.5.1 Western Blot检测细胞内溶于Sarcosyl的朊蛋白 71
3.5.2 Annexin V-FITC/PI双染观察锌离子对细胞毒性的影响 72
3.5.3 激光共聚焦显微镜观察细胞中朊蛋白的聚集情况 73
3.5.4免疫电镜观察细胞内朊蛋白聚集体的形态 75
3.5.5 NAC可以保护细胞免受异常锌离子的影响 76
3.5.6 维生素c对锌离子的细胞毒性没有保护作用 77
3.5.7 锌离子导致的细胞死亡和朊蛋白聚集关系研究 78
3.6 讨论 81
参考文献 84
攻读博士学位期间发表的论文目录 111
致谢 112

104
中文摘要
Prion疾病是一类由朊蛋白错误折叠所引起的可传染的致死性神经退行性疾病，在许多哺乳动物身上都有发生，包括疯牛病、羊瘙痒症和人克雅氏病。其发生机制通常认为是错误折叠的病理状态朊病毒蛋白PrPSc诱导细胞正常状态朊蛋白PrPC转变为PrPSc，PrPSc的积累会导致神经退行性疾病的发生。由于朊蛋白疾病可以像病毒一样具有传染性，因此人们把该疾病的传染源称作朊病毒。通过几十年的研究已证实，朊病毒的主要成分就是PrPSc，然而该领域还有许多悬而未决的问题，比如PrPC是如何向PrPSc转变的？有哪些因素会影响PrPC的错误折叠？可引起不同病理特征的不同朊病毒株是如何形成和遗传的？由于锌离子和朊蛋白都能高度富集在神经突触间隙处，锌离子和朊蛋白可能具有重大的联系，因此本文以此为背景研究了锌离子影响朊蛋白错误折叠的分子机制。
本论文的第一部分主要在体外研究了锌离子是如何影响朊蛋白的错误折叠的。PrPSc在病人脑部可形成淀粉样纤维，在体外运用不同的手段也可以使重组的朊蛋白形成淀粉样纤维，并且它们具有很多相似的性质，因此常常用体外的方法研究蛋白的错误折叠。本文运用ThT荧光检测、Sarcosyl可溶SDS-PAGE实验，并结合透射电子显微镜观察的结果，发现人野生型朊蛋白的聚集可以分为四个阶段：无定形聚集、原纤维、成熟纤维和片段化的纤维；而在100 mM锌离子存在的条件下人野生型朊蛋白则会快速形成不溶于Sarcosyl的寡聚体，然后形成短棒状的聚集体。本文通过圆二色光谱、傅里叶红外光谱、蛋白酶K酶解等方法，发现这两种聚集体的构象也不相同。而人朊蛋白八肽重复序列缺失突变体在0 mM和100 mM锌离子条件下都可以形成典型的纤维，并且构象没有明显的变化。等温滴定量热的实验证实了无论在生理条件还是在变性条件下，锌离子都是主要和朊蛋白的八肽重复序列结合。因此我们推测锌离子是通过和朊蛋白八肽重复序列相结合，使朊蛋白的柔性N端和球状C端相互作用，降低了朊蛋白的稳定性，从而导致朊蛋白以一种不同的方式聚集。
接着，本论文的第二部分进一步在细胞内研究了锌离子对朊蛋白聚集的影响，通过Western检测、激光共聚焦荧光观察的方法发现200 mM的锌离子可以使细胞内的朊蛋白聚集，通过免疫电镜的方法发现这些聚集体主要为寡聚体，形态上类似于体外获得的100 mM锌离子条件下人野生型朊蛋白快速形成的寡聚体。通过引入高浓度的维生素c诱导细胞死亡，本文初步发现了锌离子所引起的朊蛋白聚集和细胞死亡的关系，细胞的死亡是锌离子所导致的朊蛋白聚集的必要而非充分条件。
我们的实验具体研究了锌离子对朊蛋白聚集的影响，并阐释了其影响的机制。锌离子的异常可能会加速朊蛋白的聚集并改变朊蛋白的聚集途径，这对理解朊蛋白疾病的病理机制是有益的，锌离子还可能作为一种修饰机制改变朊蛋白聚集体的构象，可能对形成不同的朊病毒株有重要作用。
关键词： 朊蛋白，朊蛋白疾病，锌离子，蛋白质聚集，蛋白质构象变化
Abstract
Prion diseases are a group of transmissible fatal neurodegenerative disease which caused by misfolding of prion proteins. It may happen on many mammals, including bovine spongiform encephalopathy, scrapie, human creutzfeldt-jakob diseases and so on. Prion diseases are caused by the conformational change of cellular prion protein PrPC into pathological prion protein PrPSc, and PrPSc could convert PrPC to PrPSc. At last, the accumulation of PrPSc could lead to neurodegenerative diseases. Because prion diseases could be transmissible like viruses, the infectious source is called prion. According to decades of study, though it has been proved that the main constitute of prion is PrPSc, there are still many problems remained to solve in this field, like how PrPC convert to PrPSc, what other factors could affect the misfolding of PrPC, how prion strains form and propagate. As both zinc and prion protein could accumulate in the synaptic gap, which could be a big relationship, we studied how zinc affects the aggregation of human prion protein.
The first part of the work is focused on how zinc affects the aggregation of human prion protein in vitro. PrPSc can form amyloid fibrils in the brain of patients, and recombinant prion protein can also form amyloid fibrils in vitro by different methods. They have many similar points, so it is normal to use in vitro methods to study the misfolding of prion proteins. As revealed by thioflavin T binding assays, Sarkosyl-soluble SDS-PAGE, and transmission electron microscopy, aggregation of wild-type PrP in the absence of Zn2+ undergoes four steps: amorphous aggregates, profibrils, mature fibrils, and fragmented fibrils. In the presence of 100 mM Zn2+, however, aggregation of wild-type PrP undergoes another pathway in which wild-type PrP forms oligomers quickly and then forms short-rod aggregates. Unlike wild-type PrP, the octarepeats deletion mutant PrPDocta forms typical mature fibrils either with or without zinc. As evidenced by isothermal titration calorimetry, Fourier transform infrared spectroscopy, and proteinase K digestion assays, Zn2+ strongly binds to wild-type PrP monomers with the first binding constant exceeding 107 M-1 under denaturing conditions, and changes the conformation of wild-type PrP aggregates remarkably, but weakly binds to PrPDocta with binding affinity around 104 M-1 and has no obvious effects on the conformation of PrPDocta aggregates. Our data demonstrate that zinc significantly changes the aggregation pathway and the conformation of wild-type PrP aggregates mainly via interaction with its octarepeat region.
In the second part of the work we have studied how zinc affects the aggregation of prion protein in cells. Through the observation of confocal and detection of Western Blot, we have found that 200 mM zinc could induce the aggregation of human prion protein in cells. Furthermore, we confirm by immune electron microscopy that the aggregates formed in cells are mainly oligomers, which are similar to those quickly formed in vitro in the presence of 100 mM zinc. By adding a high concentration of vitamin c into the cells to induce cell death, we have preliminarily found the relationship between prion protein aggregation caused by zinc and cell death. Cell death is a necessary but not a sufficient condition for prion protein aggregation.
Our work has studied how zinc affects prion protein aggregation, and elucidated the mechanism. The abnormal zinc can accelerate the aggregation of prion protein and change the aggregation pathway. Our findings could explain how zinc modifies pathological PrP conformation associated with prion diseases and link abnormal aggregation of prion protein modified by zinc to pathogenesis of prion diseases and prion strain diversity.
Key Words: Prion protein, prion diseases, zinc, protein aggregation, protein conformational change

第1章 前言
1.1 朊病毒假说及其证实
朊蛋白疾病是一类朊蛋白错误折叠所导致的神经退行性疾病。目前所发现的朊蛋白疾病都具有传染性和致死性。它可以在人与多种动物中传播(Collinge, 2001)。早在1930年左右，一些家族性克雅氏症患者就已经被发现(Prusiner, 1998)，但许多年过去了，这一现象一直没有得到重视，克雅氏症一直被当做一种神秘的、罕见的神经退行性疾病(Hsiao et al., 1989; Masters et al., 1981; Prusiner, 1989)。最早发现的人的传染性朊蛋白疾病是库鲁病（kuru），发现于新几内亚的食人族部落。1966年，人们成功地用库鲁病的病原体感染了猴子(Gajdusek et al., 1966)，证实了这是一种具有传染性的病原体。其主要发现者Gajdusek因此获得了1976年的诺贝尔生理和医学奖。随后人们还成功地用克雅氏症的病原体和遗传性的GSS综合症（GSS）的病原体感染了灵长类(Masters et al., 1981)。上世纪90年代的疯牛病使朊蛋白相关疾病引起了人们关注乃至恐慌(Bradley, 1991)，甚至当人们食用有病的牛肉后感染上了一种新型克雅氏症（variant CJD）(Hill et al., 1997; Will et al., 1996)，这对畜牧业及相关经济甚至人类的健康都产生了严重的威胁。
朊病毒的发现与确证经历了一个漫长而曲折的过程。虽然它具有病原体的一些基本特征，但人们始终分离不到传统意义上的病原体，它还具有一些让人们迷惑不解的特征。Alper等人用大剂量的紫外线和电离辐射照射并不能破坏病原体的感染性(Alper, 1993; Alper et al., 1967)，并且他们发现只要极少剂量的病毒体(~2×105 Da)就具有感染性(Alper et al., 1966)。由于以上这些特征，人们推测这类疾病的感染原可能是蛋白质(Pattison and Jones, 1967)。1967年，Griffith通过理论研究，推测了三种蛋白质成为感染源的途径(Griffith, 1967)。人们通过几十年的努力，想分离出羊瘙痒症的病原体，最后，Prusiner通过一系列的证据证实了朊病毒假说，并且，他将这种感染性蛋白因子命名为朊病毒（prion）(Prusiner, 1982)。Prusiner因此获得了1997年的诺贝尔生理和医学奖。
尽管朊病毒假说被提出，并且在朊蛋白领域出现了两次诺贝尔奖，但是关于朊蛋白的研究一直没有停止，其中还有大量的问题没有解决。而朊病毒假说本身也需要有更丰富的证据。图1-1中显示了在证实朊病毒假说的历程中一些重要的里程碑(Soto, 2011)。在证实朊病毒为病原体的过程中，人们提取了具有蛋白酶抗性的朊蛋白PrPSc，并且证实了蛋白质浓度和感染性滴度是一致的(Bolton et al., 1982; Gabizon et al., 1988)。人们发现破坏蛋白质的结构，或者采用PrP的抗体可以降低朊病毒的感染性(Gabizon et al., 1988)，这更加证明了朊病毒是蛋白质的可能性。哺乳动物编码PrP基因（PRNP）以及相应mRNA的解出(Chesebro et al., 1985; Oesch et al., 1985)，表明了PrP是宿主体内一种正常表达的蛋白质，主要在大脑中表达，并且它的表达状况在正常动物体内和被感染的动物体内没有什么区别，PrP在体内存在两种形式，正常的细胞型PrP（PrPC）和病理型PrP（PrPSc）(Basler et al., 1986)。这两种蛋白质的化学组分完全没有区别，它们的不同很可能包含在它们的三级结构中(Stahl et al., 1993)。随着PRNP基因的解出，遗传性的朊蛋白疾病的致病原因得到了解释，原来它们的PRNP基因存在突变(Collinge, 2001; Hsiao et al., 1989)，另外，过量表达突变的Prnp基因的小鼠也会患上传染性神经退行性疾病(Hsiao et al., 1990; Jackson et al., 2009; Nazor et al., 2005; Sigurdson et al., 2009; Telling et al., 1996a)。一个支持朊病毒假说的强有力的证据是Prnp-/-对朊病毒具有抗性，不会表现出患病的症状，也观察不到病原体的增殖(Bueler et al., 1993)。体外的研究也为朊病毒假说提供了强有力的支持。最初Caughey和他的同事们在体外用纯化的PrPSc诱导PrPC获得了少量的具有蛋白酶K抗性的PrPres(Kocisko et al., 1994)。随后Soto和他的同事们发明了新的体外复制朊病毒的方法-蛋白质错误折叠循环扩增（protein misfolding cyclic amplification, PMCA）(Saborio et al., 2001)。这种方法可以有效地在体外扩增朊病毒，并且可以保持朊病毒完整的生物学、生化以及结构特性(Castilla et al., 2005)。它证明了朊病毒在体外可以无限扩增，新形成的朊病毒可以以一种自催化过程诱导正常结构的PrPC转变为PrPSc。有一点需要注意的是，尽管PrPSc被高度纯化，但仍然夹杂磷脂、糖类，甚至是核酸，或许还有未知的protein X(Prusiner, 1998)。因此，尽管有了强有力的证据，但是人们对朊病毒假说还是持有一定的怀疑，人们认为除非能通过纯的正常的朊蛋白形成朊病毒，否则不能完全证实朊病毒假说(Soto and Castilla, 2004)。这样的研究持续了许多年，2004年有报道称可以通过细菌表达的重组PrP进行错误折叠后制造出“合成朊病毒”(Legname et al., 2004)。但这个研究的缺陷是实验所采用的都是过量表达PrP的转基因小鼠，而非野生型，并且这些小鼠发病的潜伏期都很长。之后，该研究小组又做了一系列这样的研究，甚至还发现了对蛋白酶K敏感的朊病毒(Colby et al., 2009; Colby et al., 2010; Legname et al., 2005)，不过采用PrP过量表达的转基因小鼠一直是他们研究的缺陷。基于PMCA反应，有大量的成果验证了朊病毒假说，他们所用的材料越来越纯粹，无论是作为PMCA反应的底物，还是触发反应的种子。最初，PMCA刚刚发明的时候，人们需要以大脑匀浆作为底物，从患病动物大脑中提取的PrPSc作为触发反应的种子(Castilla et al., 2005)，到后来，仅仅需要大脑匀浆作为底物，不需要种子(Barria et al., 2009; Deleault et al., 2007)或以重组PrP体外形成的纤维为种子(Makarava et al., 2010)，或者，以重组PrP作为底物，PrPSc作为种子(Atarashi et al., 2007; Kim et al., 2010)，到最近，马继延小组只以重组PrP作为底物，其中仅仅加入了RNA和磷脂，无需种子就制造出了具有较强感染性的朊病毒(Wang et al., 2010)，这也成为验证朊病毒假说的最强有力的证据。

图1-1 对朊病毒本质研究的历史(Soto, 2011)
1.2 Protein X
虽然朊病毒假说基本上被证实了，人们也在体外重新合成了朊病毒，但是朊病毒的复制究竟需不需要其他的辅助因子呢？这个问题首先的提出是源于对表达两个物种朊蛋白转基因小鼠感染朊病毒情况的研究(Telling et al., 1994; Telling et al., 1995)。Prusiner将影响朊病毒复制的未知因子命名为Protein X，然而之后的研究并没有证明该辅助因子是蛋白质，它可能是一些其他的成分。因此Protein X成了影响朊病毒复制的各种辅助因子的代称。有一些研究表明辅助因子对朊病毒的复制来说是必要的，比如利用PMCA的方法无法以高度纯化的仓鼠PrPC和PrPSc为原料制造出朊病毒，而加入大脑匀浆后就可以了(Abid et al., 2010; Deleault et al., 2005; Saborio et al., 1999)。这说明在朊病毒复制的过程当中需要有辅助因子的协助。有研究表明RNA或者聚阴离子是辅助因子(Deleault et al., 2005; Deleault et al., 2010; Deleault et al., 2003; Geoghegan et al., 2007)，然而最近有文章指出在PMCA反应体系中去除核酸、蛋白质、磷脂中的任意一种并不会阻止朊病毒的复制，加入核酸、肝素、白蛋白或者脂肪酸都能使朊蛋白的体外扩增速率有所增快，这表明上述因子可能对朊病毒的复制都起着类似的作用，是可以相互替代的(Abid et al., 2010)。这些辅助因子对朊病毒的复制必不可少，Soto总结了辅助因子在朊病毒复制过程中可能扮演的5种角色：（1）辅助因子可能会影响朊病毒所携带的生物学信息。即使它不是朊病毒的组成成分，也可能帮助决定朊病毒的三维结构从而影响朊病毒株的性质；（2）辅助因子可能具有催化的功能。它可能会同时与PrPC和PrPSc相互作用，或者与PrPC相结合使其更容易变成错误折叠的结构，从而有利于PrPC向PrPSc的转化；（3）辅助因子有可能帮助稳定新形成的PrPSc的结构；（4）辅助因子有可能有助于新形成的PrPSc聚合体的片段化；（5）辅助因子有可能增加朊病毒的生物学稳定性，使其在生物体内不容易被质量控制体系清除。

1.3 种间屏障和朊病毒株
朊蛋白疾病有许多种类（见表1-1）(Prusiner, 1998)，但它们都有相似的病理特征，脑组织会产生空洞，胶质细胞会增生。但是它们的病理特征也会有差异，比如发病时间不同，脑内空洞的位置不一样等。朊病毒在不同物种间传播远没有在同种物种间传播效率高，这就叫做种间屏障。当朊病毒初次从种A传播到种B的时候，通常并不是所有的种B动物都会死亡，并且相较于同种物种间的传播其潜伏期通常长很多并且差异性大很多，而同物种间传播的动物通常会全部死亡，并且其疾病的潜伏期相对短而一致。然而接下来朊病毒由种B向种B的传播，其中的参数就和种内传播的情况一致了(Collinge and Clarke, 2007)。影响种间屏障的因素主要是供体和受体物种朊蛋白的一级结构的差异，以及朊病毒株的类似性(Collinge and Clarke, 2007)。
朊病毒株是朊病毒领域中一个令人费解的问题。在几乎所有的传染性海绵样脑病中都会表现出不同的朊病毒株，它们具有不同的潜伏期、不同的临床特征和不同的神经病理特征(Morales et al., 2007)。除了用一些临床指标对朊病毒株进行分类，一系列的生化指标也可以用于朊病毒株的分类，其中用得最多的是PK酶解后的电泳条带特征、糖基化模式、沉降系数和对变性剂的抗性。
有很多研究者用小鼠模型研究朊蛋白疾病，他们用不同的羊瘙痒症朊病毒株感染同系交配的小鼠，在这些小鼠成功增殖，并且这些病毒株可以通过潜伏期和神经病理性特征区分开来(Fraser and Dickinson, 1973)。这些同系交配小鼠的PrP的一级结构都是一样的，因为它们都拥有一样的PrP基因。更进一步，通过在拥有不同PrP一级结构的小鼠间传播后，病毒株可以被再次收集到(Bruce et al., 1994)。传统病原体的病毒株可以理解为由不同的基因序列所编码，但是有趣的是一段多肽是如何编码多种疾病表型的。人们发现相同的PrP一级结构所构成的不同的PrPSc具有不同的PK酶解条带特征，这暗示了不同的朊病毒株可能具有不同的构象(Bessen and Marsh, 1994; Collinge et al., 1996; Parchi et al., 1996)。这样可以有一个不完全的概念，朊病毒可以把它的生化特性拷贝到受体PrP上，而不管它们的一级结构是否相同。对人朊病毒分离研究中，PrPSc在转基因小鼠传代过程中，它保持了它的PK酶解条带特征(Collinge et al., 1996; Telling et al., 1996b)，并且其糖基化的比例也得到了保持(Collinge et al., 1996)。将人和牛的朊病毒传播到野生型小鼠中使小鼠的PrPSc得到增殖，并且其PK酶解片段的大小和糖基化的比例和原始的接种体时一致的，另外疯牛病的朊病毒株已在多个哺乳动物物种间传播并保持了相应的特征（包括人类），这证明了朊病毒可以把它的生化特性拷贝到另一种PrP上(Collinge et al., 1996)。这其中有一点有趣的是在朊病毒的传代过程中，其三种糖基化（双糖基化、单糖基化、无糖基化）的比例也可以在宿主中保持，不管是相同的或是不同的PrP序列(Collinge et al., 1996)。这一种比例是如何保持的呢？有一种可能的解释是这反映了株型特异性的体内清除机制，生物体对不同株型三种糖基化的清除速率不同，从而使三种糖基化水平的PrPSc的比例保持在一个稳定的水平。另外一种解释是在单独的PrPSc纤维中，不同的糖基化的PrPSc以一种周期性的方式存在，类似于线性晶体。有研究采用天然PrPSc抗体和不同糖型特异性抗体研究发现，在PrPSc中不同糖型以一种株型特异性的比例存在，这说明糖基化的比例可能对稳定蛋白的构象有作用(Khalili-Shirazi et al., 2005)。
哺乳动物的PrP基因高度保守，PrP序列以及结构的相似性对朊病毒在哺乳动物间传播很可能是至关重要的(Collinge and Clarke, 2007)。虽然发现了很多的朊病毒株，但是它们的数量应该是有限的，它们的存在与否和热力学的稳定性有关，并且其增殖速率需要高于体内清除速率。相对来说，朊病毒的株型有许多，但是对于一条给定的PrP序列，只有一部分朊病毒株型能够和它匹配。一般来说，物种A和物种B中可能产生的PrPSc株型的共有结构株型越多，朊病毒在这两个物种间就会更容易传播，相反的，如果它们的共有株型很少，那么朊病毒在它们间传播就会有种间屏障，如果朊病毒要在它们之间传播，就会产生株型的突变。通过构象选择模型(Collinge, 1999)，宿主的PrPC的一级结构影响了其PrPSc株型的热力学倾向性，这关系到构型的选择和朊病毒增殖过程中动力学上的选择。在这个模型中，种间屏障取决于朊病毒供体和受体共同允许或倾向的PrPSc的结构的交集。当然，朊病毒在传播过程中所遇到的屏障不仅存在于物种和物种之间，这样的株型的选择和突变过程也会存在于同一宿主的不同组织中，因为在不同的组织里朊病毒的增殖和清除速率是不一样的。朊病毒株型和种间屏障可以看作是一个事物的两个方面。
表1-1 朊蛋白疾病的种类(Prusiner, 1998)
疾病
宿主
致病原因
库鲁病（Kuru）
原始人
嗜食同类的习俗
医源性克雅氏症（iCJD）
人
注射含朊病毒的生长激素、硬脑膜移植等
新型克雅氏症（vCJD）
人
食用疯牛病肉
家族性克雅氏症（fCJD）
人
PrP基因生殖细胞突变
GSS病
人
PrP基因生殖细胞突变
家族致死性失眠症（FFI）
人
PrP基因生殖细胞突变(D178N, M129)
散发性克雅氏症（sCJD）
人
体细胞突变或PrPC向PrPSc自发转变
散发致死性失眠症（FSI）
人
体细胞突变或PrPC向PrPSc自发转变
羊瘙痒症（Scrapie）
绵羊
遗传易感型
牛海绵组织脑病（BSE）
牛
食用含朊病毒的骨肉粉
传染性貂脑病（TME）
貂
通过牛或绵羊的朊病毒感染
慢性消耗性疾病（CWD）
鹿
未知
猫科海绵状脑病（FSE）
猫
食用含朊病毒的牛组织或骨肉粉
外来偶蹄类脑病
羚羊
食用含朊病毒的骨肉粉

1.4 细胞型朊蛋白概述
细胞型朊蛋白是生物体内的正常膜锚定蛋白，其C末端连接有糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI），并且有两个位点可以N-连接方式连接糖基团。和大部分GPI锚定蛋白类似，PrP主要富集在去垢剂抗性膜区域，比如脂筏。朊蛋白的结构在人、小鼠、牛、仓鼠等哺乳动物中具有高度的保守性，它们都具有一条很长的、柔性的N端尾巴（23-128），3个a-螺旋，1个位于第一个a-螺旋两翼的双股反向平行的b股组成的b-折叠片层(Riek et al., 1997)，在第二个螺旋和第三个螺旋之间由一对二硫键连接起到稳定PrPC的作用(Riek et al., 1996)。
尽管朊蛋白的N端为无规则的结构，但