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重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

陈倩倩（交流生） 118627140313

一，实验目的
1，检验重组质粒的插入片段的大小
2，学习PCR技术的使用
二，实验原理
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
   PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
三，实验材料及仪器
高速离心机，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)， DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／HindⅢ，DL5000
四，实验步骤
一，重组质粒的酶切、电泳检测
1，按下表加样进行加样后37℃水浴1h
重组DNA
13.2μl
dd H2O
1.6 μl
Buf
2 μl
Hind Ⅲ
2μl
作用：用Hind Ⅲ将重组DNA切成片段
我组的质粒DNA
2，将酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳测试
我组酶切结果
DL5000

㈠，如图所示，我组的重组质粒酶切后出现三条带：
①大小在9416—6557bp，之间此带为插入的DNA片段。
②在λDNA/HindⅢ的4361bp和2322bp之间的条带，并且稍快于DL5000的3000bp的条带估测可能在2000—3000bp之间，此为切去外源片段以后的载体片段。
③，在DL5000的100bp和250bp之间的条带，估计可能为200——150bp之间，此片段也为插入的DNA片段。
㈡，第一条带最为明亮，第二条次之，最后一条非常模糊。这是因为第一条为插入的大片段DNA，所以在片段数相同的情况下，所含碱基最多其双螺旋中插入的溴化乙锭最多，因此紫外照射后荧光最亮。第二条带与DL5000的3000bp条带对比，其片段大小所差不多，但是亮度几乎是DL5000的3000bp条带的两倍，可见我组提取的质粒DNA比较多，即重组子其在细胞中的拷贝数比较多。
二，PCR
PCR反应体系如下所示
ddH2O
13.2μl
引物
2μl
buf
2μl
模板
1μl
dNTP
1.6μl
Tqa酶
0.2μl
㈠引物此次重组用到的载体是p UC19，限制性内切酶为Hind Ⅲ，所以选择Hind Ⅲ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。pUC19部分序列为:
M13F(-47): EcoRⅠ
cgccagggttttcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc
Hind Ⅲ M13R(-48)(互补链)
PCR引物为
引物名称
引物序列5’ 3’
引物长度(mers)
Tm(℃)
M13F(-47)
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC
24
64.7
M13R(-48)
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
24
57.9
㈡反应程序
1，94℃ 3min 预变性
预变性是让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。
2, 94℃ 30s 变性
通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
3, 58℃ 30s 退火
当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。
4, 72℃ 1min 延伸
在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg离子存在的条件下，5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
5, 72℃ 10min
循环完成后 使PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
6, 10℃ 2h

琼脂糖凝胶电泳检测（点样10μl）结果如下
我组PCR情况

1，，如图所示，我组的PCR条带在DL5000的第五（1000bp）和第六条带（750bp）之间。说明该条带的大小应该介于1000bp和750bp之间。
2，点样10μl的情况下与相同量的Marker对比，PCR的DNA条带极其明亮说明PCR产量很高。
五，注意事项
①操作时应小心轻柔，防止将DNA吸入加样枪内或溅出离心管外。酶切时取酶时注意枪尖不要伸入液面以下太多，以免枪尖外壁沾染过多的酶。分子生物学实验中，取样微量，所以要特别注意加样时加在管的底部。
②Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)，复性温度=Tm值-(5～10℃)，本实验两个引物的Tm分别为64.7℃，57.9℃，选用退火温度为58℃，这是因为在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。