荧光显微镜的基本原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求,光学显微镜的基本参数,主要技术参数,数值孔径,NA,荧光显微镜,(fluorescence microscope),：,某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光,(fluorescence),。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。,Figure 9-14,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),The,maximum excitation,and,emission,wavelengths,of several commonly used fluorescent probes are shown in relation to the corresponding colors of the spectrum.,荧光显微镜的组成,1、光源,：一般采用,高压汞灯,2、滤色系统：,由,激发滤板和压制滤板组成,a、激发滤板：,提供一定范围的激发光,b、压制滤板,：,完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光,3、反光镜：,一般采用平面反光镜,4、聚光镜：,用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成,5、物镜和目镜,The optical system of a fluorescence microscope.,A filter set consists of two barrier filters(1 and 3)and a dichroic mirror(beam-splitting 2),荧光染料的使用,1,、吖啶橙：,吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的,DNA,和,RNA,同时染色而显示不同颜色的荧光，,DNA呈绿色荧光,，,RNA呈橙红色荧光,。,2、溴化乙锭（EB）,:,染色,DNA,和,RNA,。,3,、荧光素双醋酸酯,(FDA),：,FAD,本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。,4、荧光染料,Ho33342,和罗丹明,123,:,Ho33342,能与细胞中,DNA,进行特异的结合，罗丹明,123,能与,线粒体,进行特异的结合。,荧光组化实验中应,注意,的几个问题,1、,每种荧光染料，均有自己的最适,pH,值，此时荧光最强。当,pH,改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在,一定的,pH,值的缓冲液,中进行。,2、一放,荧光染色在,20,。,C,以下时荧光比较稳定,，温度升高常出现温度猝灭。,3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用,能量小的长波长光进行观察,，需照相时再适当增强激发光。,4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。,注意事项：,1,暗室,内进行，打开,汞灯5-10min稳定,后再观察。,2,荧光淬灭(光漂白),：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意,及时用挡板,阻挡激发光照射标本。,3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（,最好不要短时间内反复开关，标本应集中观察。）,4 载物台前方,黄色遮光板,：最好不直接用肉眼看激发光，以防,短波光中的紫外,伤害。,5标本染色后,立即观察,，因时间久了荧光会逐渐减弱。,