比较畸形菇和正常菇的实验方法.doc

由于是比较畸形菇和正常菇，又因为畸形菇是由于CO2溶度过高引起的，所以旨从呼吸作用入手，试拟了与呼吸作用相关的物质和酶的测法，探究畸形菇和正常菇的区别和联系，从而再深层次的研究畸形菇。

猴头菇呼吸强度的测定（小篮子法）

【实验原理】
利用Ba(OH)2溶液吸收呼吸过程中释放的CO2，实验结束后，用草酸溶液滴定残留的Ba(OH)2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。

【器材与试剂】
1. 实验仪器 广口瓶，温度计，酸式滴定管，干燥管尼龙网制小篮
2. 实验试剂 0.05mol/L Ba(OH)2溶液(8.856 g/L），指示剂（0.1%麝香草酚酞乙醇 溶液），1/44mol/L草酸溶液（准确称取重结晶的草酸H2C2O4·2H2O 2.865g溶 于蒸馏水，配成1000mL，每mL溶液相当于1mg的CO2）。
3. 实验材料 猴头菇

【实验步骤】
1. 去两个500mL广口瓶，每个都装配一只三孔橡皮塞，一孔插入盛碱石灰的干燥管（在干燥管底部放适当脱脂棉，上置碱石灰），以吸收空气中的CO2，保证金如呼吸瓶中的空气无CO2，一孔插入温度计，另一孔直径约1cm，供滴定用，滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，用以盛实验材料。
2. 称取两份猴头菇材料，其中一份用沸水煮死，分别装入小篮内，将小篮挂在广口瓶内，同时加0.05mol/L Ba(OH)2溶液25mL于广口瓶内，立即塞紧瓶塞，防止漏气。每10min左右，轻轻地摇动广口瓶，破坏溶液表面的BaCO3薄膜，以利对CO2的吸收。
3. 1h后小心打开瓶塞，迅速取出小篮，在每个广口瓶中分别加入2滴指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞，将滴定管插入小孔中，用1/44mol/L草酸溶液滴定，直到蓝绿色转变成无色为止。分别记录滴定所耗用的草酸溶液体积（mL）。
4. 以沸水煮死的猴头菇为对照进行呼吸强度的计算。
5. 计算
呼吸强度[CO2，mL/(g·h)]=（V0-V1）/[猴头菇鲜重（g）*×时间（h）]
式中：V0为装煮死的猴头菇的广口瓶中，所耗用草酸的体积，单位是mL
V1为为处理的猴头菇的广口瓶中，所耗用草酸的体积，单位是mL

过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂（ml）
离 心 管 号
1
2
3
4
5
6
7
100μmol/L H2O2
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4℃下预冷丙酮
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
5%硫酸钛
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
浓氨水
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2

3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀
2mol 硫酸
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取猴头菇2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算：
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）；
Vt—样品提取液总体积（ml）；
V1—测定时用样品提取液体积（ml）；
FW—植物组织鲜重（g）。

二、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】
1.酶液提取：称取猴头菇0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.0
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
 三.超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
【试剂】
1.0mol/LHCL母液，
Tris－HCL缓冲液，
0.01mol/L　HCL，
0.05mol/L邻苯三酚液
【方法】
１）酶液的制备
按每克菌丝加入预冷的Tris－HCL缓冲液，于冰浴中研磨成匀浆，定容到５ｍＬ刻度离心管中，于8500r/s冰冻离心30min，上清液即为SOD粗酶提取液。将10%的粗酶提取液用缓冲液稀释200倍，得到0.5%的粗体液。
２）邻苯三酚自氧化速率的测定
将两支试管按表加入缓冲液，于２５保温10min，加入预热的邻苯三酚液，迅速摇匀（空白以0.01mol/L HCL代替邻苯三酚液），倒入比色皿内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测吸光值一次。计算线型范围内每1min吸光的增值，此即为邻苯三酚自氧化速率。
试剂
空白管
自氧化管
样品管
Tris－HCL缓冲液
3.0
3.0
3.0
H2O
0.14
0.1
－
0.05mol/L邻苯三酚液
－
40uL
40uL
样品
－
－
0.1
总体积
3.14
3.14
3.14
３）酶活测定
测定方法与邻苯三酚自氧化速率自氧化速率相同，再加入邻苯三酚前，先加入待测酶稀释液。通过控制样品的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定系后，使邻苯三酚自氧化速率自氧化速率被抑制50%。

４）酶活力的计算
SOD酶活力单位定义：在规定条件下，１ｍＬ反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率自氧化速率５０％时的酶量定义为一个酶活力单位（Ｕ）。
SOD活力（U/mL）＝｛（0.070－△Ａ４２０）／0.035］×100%×Ｖ总×样液稀释倍数｝／（50%×Ｖ样）