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基因工程简介
一、 基因工程的基本内容
基因工程: 又叫基因拼接技术或DNA重组技术。它是按照人们的意愿, 把一种生物的个别基因( 所需的基因) 复制出来, 加以修饰改造, 然后放到另一种生物的细胞里, 定向改变生物的遗传性状( 这是基因工程的作用) 。这种技术是在体外完成, 经过人工对DNA分子进行”剪切”和”拼接”, 对生物进行改造和重新组合, 然后导入受体细胞内进行无性繁殖, 使重组基因在受体细胞内表示, 产生人类所需要的基因产物。

( 一) .基因操作的工具
存在: 主要在微生物中
特点: 具专一性, 一种限制性核酸内切酶
⑴ 基因的剪刀 只能识别一种特定的核苷酸序列, 并
( 限制性核酸内切酶) 在特定的切点切割DNA分子, 如大肠
杆菌的一种限制 酶只能识别GAATTC
序列, 并在G与A间切开 。
种类: 已发现200多种限制酶, 各种酶
的切点不同。

限制性核酸内切酶的作用: 在特定的切点上切割DNA分子, 形成
两个完全相同的黏性末端。如苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因就能被某种限制酶切割下来。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口, 带有几个伸出的核苷酸, 它们之间正好互补配对, 这样的切口叫做黏性未端。要把扶手的断口处连接起来, 也就是把两条DNA未端之间的缝隙”缝合”起来, 还要靠另一种极其重要的工具──DNA连接酶。
⑵基因的针线: DNA连接酶。其作用是用于将两段乃至更多
段DNA片段拼接起来, 主要是把两个相同黏性末端的缝隙
连接起来, 实际上是将主链上断裂处的脱氧核糖与磷酸连
接起来。即连接断裂的扶梯, 以重建磷酸二酯键。
⑶基因的运输工具: 运载体
Ⅰ、 在基因操作中, 使用运载体的目的有两个: ①作为运载的工具, 将目的基因运送到宿主细胞中去; ②利用它在宿主细胞内对基因进行大量复制。
Ⅱ、 具备的条件: ①对受体细胞的生存没有决定性的作用,
进入宿主细胞后能友好地借居, 并在宿主细胞内复制和保存; ②具有多个核酸限制酶切点, 便于与目的基因( 外源基因) 的连接; ③具有标记基因, 便于目的基因的筛选( 如对抗菌素的抗药性基因、 产物具有颜色反应的基因等) 。
Ⅲ、 常见的动载体: 质粒、 噬菌体和动、 植物病毒
质粒是基因工程最常见的运载体, 它存在于许多细菌( 如大肠杆菌, 为原核生物) 和酵母菌( 真核生物) 中, 是细胞核中染色体以外的能自主复制的DNA分子。最常见的质粒是大肠杆菌的质粒。质粒上具有控制细菌抗药性的基因( 如抗四环素的标记基因) , 以及固氮、 抗生素生成等性状的基因。

( 二) 、 基因操作的基本步骤( 四步曲)
1.提取目的基因: 目的基因就是基因工程中人们所需要的特定基因。
提取目的基因的途径: ⑴直接分离法──鸟枪法( 散弹射击法) : 即从供体细胞的DNA中直接分离出人们所需要的基因。工具酶是限制性核酸内切酶( 身份──子弹)
方法:

优点: 操作方便 缺点: 工作量大, 具有一定的盲目性, 目的基因含有不表示的内含子。
⑵人工合成法( 常见于获取真核细胞的目的基因)
特点: 专一性强, 合成的目的基因不含内含子。
①反转录法 缺点: 操作麻烦, mRNA生存时间短,技术要求高。
　　　　　　方法:

②据已知的氨基酸序列合成( 逆推法)

特点: 专一性最强, 目的基因不含内含子, 可合成自然界不存在的新基因。
缺点: 当前, 复杂的尚不知核苷酸序列的基因不能合成。
注意: 由于一种氨基酸可对应多种密码子, 因此根据蛋白质中已知的氨基酸序列合成出的目的基因可能有多种, 但这并不影响目的基因表示的产物。
２．目的基因与运载体结合
用同一种核酸限制酶切割质粒和目的基因, 使其产生相同的黏性末端, 将切下的目的基因插入质粒的切口处, 再加入适量的DNA连接酶, 相同的黏性末端就会因碱基互补配对而结合, 形成一个重组DNA分子。
3.目的基因导入受体细胞
( 1) 常见受体细胞: 大肠杆菌、 枯草杆菌、 土壤农杆菌、 酵母菌、 动植物细胞等, 一般用大肠杆菌。用于基因工程的受体菌都是对人体无害的。由于它们的繁殖力强, 生长速度快, 短期内能产生大量的后代, 因此常将目的基因转入这些细菌。 目的基因进入受体细胞后, 就可随受体细胞的繁殖而进行复制, 短期内能获得大量的目的基因, 从而产生大量的目的基因产物。
导入原理: 主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的方法。
( 2) 导入过程: ( 以质体作运载体, 以细菌作受体细胞)

根据基因操作的目的不同, 可选用不同的受体细胞:
①生产基因工程药品( 如胰岛素) , 受体细胞一般采用细菌( 如大肠杆菌) , 利用细菌繁殖速度快的特点, 可在短期内获得大量基因工程产品。
②培育转基因动物, 受体细胞一般选用受精卵。
③培育转基因植物, 受体细胞一般可选用受精卵或体细胞。若受体细胞是体细胞, 再将含目的基因的体细胞进行组织培养, 即可获得转基因植株。
4.目的基因的检测和表示
( 1) 目的基因的检测: 常依据受体细胞是否具有某些标记基因来判断目的基因是否导入。如大肠杆菌质粒具有抗青霉素基因( 标记基因) , 只要检测到受体细胞具有抗青霉素的能力, 就说明导入了目的基因。
( 2) 目的基因的表示: 检查受体细胞是否表现出特定的性状。如果目的基因的供体细胞是原核细胞, 那么目的基因能够在受体细胞中表示, 这就意味着转基因成功; 如果供体细胞是真核细胞, 目的基因进入了受体细胞并不意味着能表示, 还需要采取一定的措施去促使目的基因的表示( 因为来自真核细胞的目的基因只有结构基因, 无基因表示的调控序列) 。
二、 基因工程的成果与发展前景
1.基因工程和医药卫生
( 1) 利用”工程菌”生产出质量高、 成本低的药品。如胰岛素、 干扰素和乙肝疫苗等几十种药品。
工程菌──用基因工程的方法, 使外源基因得到高效表示的菌类细胞株系。如含有人胰岛素基因的大肠杆菌, 含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株。
( 2) 基因诊断: ①方法: 用放射性同位素、 荧光分子等标记的DNA分子作探针。
②原理: 利用DNA分子杂交原理、 鉴定被检测的遗传信息, 达到检测疾病的目的。
③具体步骤: 将病的组织或体液中的DNA分子分离出来, 用化学法或热处理使样品中的DNA解旋, 然后将事先制作好的DNA探针( 实际上是DNA单链) 引入到化学样品中, 这些经过标记的DNA探针能在化验样品中同被检测的DNA中的同源序列杂交在一起; 找不到互补链的探针则能够被洗脱。
DNA探针的应用: 用于亲子鉴定、 尸体辨认、 用β－珠蛋白的DNA探针可检测镰刀型细胞贫血症; 用苯丙氨酸羟化酶基因探针可检测出苯丙酮尿症; 用分离出的白细胞癌基因制备的DNA探针,可检测白血病。
( 3) 基因治疗:

半乳糖血症──细胞内缺乏半乳糖苷转移酶基因而缺少半乳糖苷酶, 当乳糖分解为半乳糖后, 不能继续转化为葡萄糖, 过多半乳糖在体内积聚, 引起肝、 脑等功能受损。
2.基因工程与农牧业、 食品业
⑴目的: 定向培育高产、 优质或具有特殊用途的动物新品种。
农业上: 获取高产、 稳定和优良品种的农作物, 培育抗逆作物( 抗虫、 抗病毒、 抗干旱)
⑵应 畜牧养殖上: 培育优良品质的饲养转基因动物( 将某些特定的基因与病毒的DNA构成重组DNA, 然后通
用 过感染或显微注射技术将重组的DNA转移到动物受精卵中) , 这些转基因动物可获得人们所需要的品质。如超级鼠、 超级绵羊、 超级鱼。
食品业: 开辟人类新的食品来源, 利用基因工程的方法从微生物中获取人们所需要的糖类、 脂肪和V等产品。
⑶基因工程育种的优点: 克服了远缘杂交不亲和的障碍, 目的性强, 育种周期短。
3.基因工程与环境保护
⑴环境监测: 方法是DNA探针检测 原理是DNA分子杂交技术
如DNA探针检测饮水中病毒的含量──用一特定的DNA探针与被检测的病毒DNA( 或RNA) 杂交, 从而检测饮水中病毒的含量。此方法快速、 灵敏。
⑵环境的净化: 获得分解四种烃类的”超级细菌”; 吞噬汞和降解土壤中DDT的细菌; 净化镉污染的植物; 构建
新的杀虫剂代替农药; 利用基因工程的方法回收和利用工业废物。
图1 图2
例1.右图为DNA测序仪显示的某真核生物DNA片段一条链的碱基排列顺序图片。其中图l的碱基排列顺序已经解读, 其顺序是: GGTTATGCGT, 请解读图2并依据图2作答。
( 1) 2显示的碱基排列顺序GATGCGTTCG。
(2)该DNA片段中(A+C)／(T+G)= 1 。
( 3) 该基因片段控制多肽合成时必须经过转录和翻译两个过程。
( 4) 基因片段控制合成的多肽中最多有氨基酸 3 个。
(5)某人用35S标记含该DNA片段的噬菌体, 让其在不含35S的细菌中繁殖3代, 含有35S标记DNA所占比例为 0 , 原因是35S能标记蛋白质不能标记DNA(或噬菌体DNA不含有S)。
例2.茶花是中国特有的观赏品种, 但易得枯萎病, 降低观赏价值。科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因, 用转基因方法培育出了抗枯萎病的新品种。请据图回答:

(1)将②连接到①上并形成③, 常见到的酶有限制性内切酶和DNA连接酶。
(2)②与①上的某种抗药性基因在结构上的最大区别是②的编码区是间隔的、 不连续的(只要合理均给分)。
(3)经检测, 被③侵染的茶花叶片细胞具备了抗病性, 这说明②已经表示。欲快速培育大量该抗病新品种, 应该采用的技术是植物组织培养, 依据的理论基础是植物细胞的全能性 (4)经过转基因方法获得的抗病金茶花, 将来产生的配子中是否一定含有抗病基因? 不一定。　　　　
获得甲生物合成该蛋白质的信使RNA
目的
基因
与质粒
DNA重组
导入乙生
物细胞
获得甲生物的蛋白质
①
②
③
④
例3.人们试图利用基因工程的方法, 用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质, 请根据下面的示意图回答下列问题:

(1)①操作过程需加入的四种核苷酸是腺嘌呤脱氧核苷酸、 鸟嘌呤脱氧核苷酸、 胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。另外, 还必须加入逆转录酶。
( 2) 质粒是常见的运载体, 它存在于许多细菌及酵母菌等生物中。最常见的质粒是大肠杆菌的质粒, 它常含有抗药( 答出具体抗菌素的抗性也可) 基因, 这种基因有助于对受体细胞是否导入了目的基因进行检测。②过程首先要用限制性内切酶切断质粒DNA, 再用DNA连接酶将目的基因与质粒DNA连接重组在一起。
C T T A A
G
( 3) 在②操作过程中, 若目的基因的黏性末端为 , 则其运载体( 质粒) 与之相对应的黏性末端是。
( 4) 经过③过程导入受体细胞的质粒是否能够自主复制 能? 。
( 5) ④是目的基因的表示过程, 此过程包括遗传信息的转录和表示。
21.．如图将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造”工程菌”示意图, 所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A, 也不含质粒A上的基因, 质粒A导入细菌B后, 其上的基因能得到表示。请回答下列问题:
( 1) 图中的目的基因是指: ______________________________________________
( 2) 如何将目的基因和质粒相结合形成重组质粒?
①_____________________________________________
②_____________________________________________
③_____________ _
3) 当前把重组质粒导入细菌细胞时, 效率还不太高; 导入完成后所得到的细菌, 实际上有的根本没有导入质粒, 有的导入的是普通质粒, 只有少数导入的是重组质粒。此处能够经过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒: 将得到的细菌涂布在一个有氨苄青霉素的培养基上, 能够生长的就是导入了质粒A或重组质粒, 反之则没有。用这种方法鉴别的原理是 。
11．( 1) 人的生长激素基因
(2)①用一定的限制酶切割质粒, 使其出现一个有粘性末端的切口; ②用同种限制酶切割目的基因, 产生相同的粘性末端; ③将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处, 再加入适量的DNA连接酶, 使质粒与目的基因结合成重组质粒。
(3)普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因。
27.( 8分) 为扩大可耕地面积, 增加粮食产量, 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。中国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。

⑴获得耐盐基因后, 构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处, DNA连接酶作用于 处。( 填”a”或”b”)
⑵将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常见方法有农杆菌转化法和 法。
⑶由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术, 该技术的核心
是 和 。
⑷为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功, 既要用放射性同位素标记的 做探针进行分子杂交检测, 又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
答案: ( 1) a a
( 2) 基因枪法( 花粉管通道法)
( 3) 植物组织培养( 1分) 脱分化( 去分化) 再分化
( 4) 耐盐基因( 目的基因) 一定浓度盐水浇灌 ( 移植到盐碱地中)
( 江苏卷) 22．( 8分) 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点, 圈l、 圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题:

( 1) 一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后, 分别含有 个游离的磷酸基团。
( 2) 若对图中质粒进行改造, 插入的SmaⅠ酶切位点越多, 质粒的热稳定性越 。
( 3) 用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒, 不能使用Srna Ⅰ切割, 原因是 。
( 4) 与只使用EcoR I相比较, 使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、 外源DNA的优点在于能够防止 。
( 5) 为了获取重组质粒, 将切割后的质粒与目的基因片段混合, 并加入 酶。
( 6) 重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。
( 7) 为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因, 将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体, 然后在 的培养基中培养, 以完成目的基因表示的初步检测。
答案: ( 1) 0、 2 ( 2) 高 ( 3) SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、 外源DNA中的目的基因
( 4) 质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 ( 5) DNA连接
( 6) 鉴别和筛选含有目的基因的细胞 ( 7) 蔗糖为唯一含碳营养物质
海南23、 ( 18分) 图为某种质粒表到载体简图, 小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、 BamHI的酶切位点, ampR为青霉素抗性基因, tctR 为四环素抗性基因, P启动子, T为终止子, ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、 BamHI在内的多种酶的酶切位点。
据图回答:
( 1) 将含有目的基因的DNA与质粒该表示载体分别用EcoRI酶切, 酶切产物用ＤＮＡ连接酶进行连接后, 其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、
三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒, 需要对这些连接产物进行 。
( 2) 用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中, 能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ;
( 3) 在上述实验中, 为了防止目的基因和基因和质粒表示载体在酶切后产生的末端发生任意连接, 酶切时应选用的酶是 。
答案: ( 1) 目的基因-载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化 ( 2) 载体-载体连接物 目的基因-载体连接物、 载体-载体连接物 ( 3) 启动子 mRNA ( 4) EcoRⅠ和BamHⅠ
25．(18分) 己知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病．SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原, 在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体．某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗, 开展了前期研究工作．其简要的操作流程如下:

( 1) 实验步骤①所代表的反应过程是 。
( 2) 步骤②构建重组表示载体A和重组表示载体B必须使用限制性内切酶和 酶, 后者的作用是将用限制性内切酶切割的 和 连接起来。
(3)如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌。一般情况下, 不能得到表示边S蛋白, 其原因是S基因在大肠杆菌中不能 , 也不能 。
(4)为了检验步骤④乙所表示的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性, 可用 与
进行抗原—抗体特异性反应实验, 从而得出结论。
( 5) 步骤④和⑥的结果相比, 原核细胞表示的S蛋白与真核细胞表示的S蛋白的氨基酸序列
( 相同、 不同) , 根本原因是 。
19．( 18分) ( 1) 逆转录( 1分) 　　　　( 2) DNA连接 载体 S基因( 每空2分, 共6分)
( 3) 复制 合成S基因的mRNA( 每空2分, 共4分)
( 4) 大肠杆菌中表示的S蛋白 SARS康复病人血清( 每空2分, 共4分)
( 5) 相同( 1分) 表示蛋白质所用的基因相同( 2分)
28. ( 16分) 拟南芥是遗传学研究的模式植物, 某突变体可用于验证相关的基因的功能。野生型拟南芥的种皮为深褐色( TT) , 某突变体的种皮为黄色( tt) ,下图是利用该突变体验证油菜种皮颜色基因(Tn)功能的流程示意图。

( 1) 与拟南芥t基因的mRNA相比, 若油菜Tn基因的mRNA中UGA变为ＡＧＡ, 其末端序列成为”－ＡＧＣＧＣＧＡＣＣＡＧＡＣＵＣＵＡＡ”, 则Tn比ｔ多编码　　　　　个氨基酸( 起始密码子位置相同, ＵＧＡ、 ＵＡＡ为终止密码子) 。
( ２) 图中①应为　　　　　。若②不能在含抗生素Ｋａｎ的培养基上生长, 则原因是 .若③的种皮颜色为 , 则说明油菜基因与拟南芥T基因的功能相同。
( 3) 假设该油菜基因连接到拟南芥染色体并替换其中一个t基因, 则③中进行减数分裂的细胞在联会时的基因为 ; 同时, ③的叶片卷曲( 叶片正常对叶片卷曲为显性, 且与种皮性状独立遗传) , 用它与种皮深褐色、 叶片正常的双杂合体拟南芥杂交, 其后代中所占比列最小的个体表现为 ; 取③的茎尖培养成16颗植珠, 其性状一般 ( 填 不变或改变) 。
( 4) 所得的转基因拟南芥与野生型拟南芥 ( 填是或者不是) 同一个物种。
正确答案为: ( 1) 2 ( 2) 重组质粒( 重组DNA分子) ; 重组质粒未导入; 深褐色。
( 3) TnTnt t; 黄色正常、 黄色卷曲; 不变。 ( 4) 是
31、 ( 17分) 去冬今春, 云南、 贵州、 广西等地出现严重干旱, 农作物减产或缺收。抗旱性农作物能在缺水环境下正常生长, 因此其有重要的经济价值。多数抗旱性农作物能经过细胞代谢, 产生一种代谢产物, 调节根部细胞液内的渗透压, 此代谢产物在叶肉细胞中却很难找到。
( 1) 解释为什么在抗旱性农作物的叶肉细胞中根难找到与抗旱有关的代谢产物
__________________________________________。
( 2) 现有一抗旱植物, 其体细胞内有一个抗旱基因R, 其等位基因为r( 不抗旱) 。R、 r的部分核苷酸序列如下: r: ATAAGCATGACATTA R: ATAAGCAAGACATTA.
①r基因由_______条核苷酸链组成, 请将对应部分补充完整 。

②己知旱敏型rr植物的分生区某细胞在有丝分裂过程中发生了基因突变。其产生的两个子细胞基因型分别为Rr, rr, 请在下面方框内画出该分生区细胞突变后的有丝分裂中期图。

( 3) 现已制备足够多的R探针和r探针．经过探针来检测某植物相关的基因型。据图同
答下列问题。

①若已提取到某抗旱植物Rr的叶肉细胞总DNA, ( 能、 不能) _______以DNA为模板直接扩增抗旱基因。
②R或r基因经过处理变成单链DNA, 若该处理方法不能用解旋酶, 能够采取__________方法处理。
③DNA杂交发生在____________________两者之间。
④若被检植物发生A现象．不发生C现象, 则被检植物的基因型为___ __________
⑤若杂交斑的深浅与形成的杂交带数量成正相关, 则ABC形成的杂交斑的深浅强度为______________________。
( 4) 为培育能稳定遗传的具抗旱性和多颗粒产量的农作物, 科研人员按以下流程图进行杂交育种。( 注: 已知抗旱性和多颗粒属显性, 各由一对等位基因控制。)

①杂交育种利用的遗传学原理是________________________________。
②在流程图中的”筛选和交配”环节中。你会用什么方法筛选具抗旱性和多颗粒的植物?
_______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案: ( 1) 基因选择性表示( 1分)
( 2) ①两( 1分) TATTCGTACTGTAAT( 1分)

②
( 1分)

( 3) ①能 ②加 ③探针与R或r基因( 单链DNA) ④RR ⑤A=C>B
( 4) ①基因自由组合定律( 基因重组) ②在干旱的环境中种植以筛选抗旱性植物, 然后让抗旱植物自交, 筛选多颗粒的植物作为种子, 多次重复以上操作以提高纯合性 ( 2分)
③ F3 ④ F1 细胞内有全部遗传信息