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基础生物学实验方案

指导教师:
9月

实验一 培养基的配制

实验目的
1. 明确培养基的配制原理。
2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。
实验内容
学习细菌、 放线菌、 酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。
实验原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质, 用以培养、 分离、 鉴定、 保存各种微生物或积累代谢产物。
各类微生物对营养的要求不尽相同, 因而培养基的种类繁多。培养细菌常见牛肉膏蛋白胨培养基, 培养放线菌常见高氏I号培养基, 培养霉菌常见蔡氏培养基或马铃薯培养基, 培养酵母菌常见麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、 液体、 加富、 选择、 鉴别等培养基之分。在这些培养基中, 就营养物质而言, 一般不外乎碳源、 氮源、 无机盐、 生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物, 一般不为微生物所利用。它在96℃以上熔化成液体, 而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时, 根据各类微生物的特点, 就能够配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。培养基除了满足微生物所必须营养物质外, 还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸; 细菌、 放线菌的pH为微碱性。因此每次配制培养基时, 都要将培养基的pH值调到一定的范围。
以下配方选第三种实验中进行实验
( 1) 牛肉膏蛋白胨培养基配方
牛肉膏 3.0 g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水 1000mL
pH 7.4~7.6
( 2) 高氏I号培养基配方
可溶性淀粉 20g
NaCl 0.5g
KNO3 1g
K2HPO4·3H2O 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 0.01g
琼脂 15—25g
水 1000mL
pH 7.4~7.6
( 3) 马铃薯培养基配方
马铃薯( 去皮) 200g
葡萄糖 20g
琼脂 15~25g
水 1000ml
自然pH
实验器材和药品
琼脂( 两瓶) , 马铃薯( 1000g) , 葡萄糖( 两瓶) 、 蒸馏水等。
试管( 带硅胶塞,每组3支) , 三角瓶, 烧杯(500mL,每组1个), 量筒( 250mL, 每组1个) , 玻棒, 小漏斗、 电子天平, 药匙, 报纸, 纱布、 胶管、 试管架、 铁架台、 电炉、 石棉网、 剪刀、 玻璃棒、 培养皿( 9cm, 每组三个) 、 高压灭菌锅、 胶头滴管、 保鲜膜。
实验步骤
1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法
(1) 称量: 按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、 蛋白胨、 NaCL放人烧杯中。牛肉膏常见玻棒挑取, 放在小烧杯或表面皿中称量, 用热水溶化后倒入烧杯, 也可按在称量纸上, 称量后直接放入水中, 这时如稍微加热, 牛肉膏便会与称量纸分离, 然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿, 在称取时动作要迅速。另外, 称药品时严防药品混杂, 一把牛角匙用于一种药品, 或称取一种药品后, 洗净, 擦干, 再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
(2) 溶化: 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量, 用玻棒搅匀, 然后, 在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后, 补充水到所需的总体积, 如果配制固体培养基时, 将称好的琼脂放入己溶的药品中, 再加热溶化, 最后补足所损失的水分。
在琼脂溶化过程中, 应控制火力, 以免培养基因沸腾而溢出容器。同时．需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时, 不可用铜或铁锅加热溶化, 以免离子进入培养基中, 影晌细菌生长。
(3) 调pH
在未调pH前, 先用精密pH试纸测量培养基的原始pH, 如果偏酸, 用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌, 并随时用pH试纸测其pH, 直至pH达7.6。反之, 用mol/LHCL进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物, 其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头, 以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时, 若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌, 则琼脂因水解不能凝固。因此, 应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合, 或在中性pH条件下灭菌, 再调整PH。
(4) 过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤, 以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下能够省去( 本实验勿需过滤) 。
(5) 分装
按实验要求, 可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。
1) 液体分装: 分装高度以试管高度的l／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定, 一般以不超过三角瓶容积的一半为宜, 如果是用于振荡培养用, 则根据通气量的要求酌情减少; 有的液体培养基在灭菌后, 需要补加一定量的其它无菌成分, 如抗生素等, 则装量一定要准确。
2) 固体分装: 分装试管, 其装量不超过管高的1/5, 灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
3) 半固体分装: 试管一般以试管高度的1/3为宜, 灭菌后垂直待凝。

图1-1 培养基的分装
A 漏斗分装装置 ; B 自动分装装置
1 铁架 ; 2 漏斗 ; 3孔胶管 ; 4弹簧夹 ; 5玻璃 ; 6流速调节 ; 7 装量调节 ; 8开关
分装过程中, 注意不要使培养基沾在管(瓶)口上, 以免沾污棉塞而引起污染。
(6) 加塞

图1-2 棉塞的制作
培养基分装完毕后, 在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞( 或泡沫塑料塞及试管帽等) , 棉塞的作用有二: 一方面阻止外界微生物进入培养基, 防止由此而引起的污染; 另一方面保证有良好的通气性能, 使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞, 外形应象一只蘑菇, 大小、 松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内, 2/5在口外。
(7) 包扎
加塞后, 将全部试管用麻绳捆好, 再在棉塞外包一层牛皮纸, 以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞, 其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、 组别、 配制日期。三角烧瓶加塞后, 外包牛皮纸, 用麻绳以活结形式扎好, 使用时容易解开, 同样用记号笔注明培养基名称、 组别、 配制日期。
(8) 灭菌
将上述培养基以0.103MPa, 121℃, 20min高压蒸气灭菌。
(9) 搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多〕, 将试管口端捆在玻棒或其它合适高度的器具上, 搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 。
(10) 无菌捡查
将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24—48h, 以检查灭菌是否彻底。
2．高氏I号培养基配制方法
(1) 称量和溶化
按配方先称取可溶性淀粉、 放入小烧杯中, 并用少量冷水将淀粉调成糊状, 再加入少于所需水量的沸水中, 继续加热, 使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其它各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入, 方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0.01g／ml, 再在1000mL培养基中加1mL的0.0l g／m1的贮备液即可。待所有药品完全溶解后, 补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基, 其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
(2) pH调节、 分装、 包扎、 灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
3．马铃薯培养基配制方法
取去皮马铃薯200g, 切成小块, 放入1500mL的烧杯中煮沸30min, 注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤, 取滤液加糖( 酵母菌用葡萄糖, 霉菌用蔗糖) , 加热煮沸后加入琼脂, 继续加热融化并补足失水。再按前所述, 进行分装、 加塞、 包扎、 0.1MPa灭菌20 min。
4．察氏培养基配制方法
方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
实验结果及讨论
针对实验原理、 步骤、 现象进行讨论。

实验二、 微生物接种及抗菌技术
( 一) 微生物的接种技术
1  目的
1.1学习掌握微生物的几种接种技术 
1.2 建立无菌操作的概念, 掌握无菌操作的基本环节
2  实验说明
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、 培养、 纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作, 如操作不慎引起污染, 则实验结果就不可靠, 影响下一步工作的进行。
3  实验器材
3.1  器械和用品
酒精灯, 火柴, 试管架、 接种环、 接种针、 滴管等接种工具。上次实验制备的斜面和平板培养基。
3.2  菌种和培养基
菌种: 大豆疫霉
培养基: 普通PDA琼脂斜面和平板( 上次实验制备)
4  实验流程
斜面接种法→液体接种法
4.  操作步骤
4.1  斜面接种法
斜面接种法主要用于接种纯菌, 使其增殖后用以鉴定或保存菌种。
一般先从平板培养基上挑取分离的单个菌落, 或挑取斜面, 肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、 接种柜或超净工作台上进行, 先点燃酒精灯。
将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、 食指、 中指及无名指之间, 菌种管在前, 接种管在后, 斜面向上管口对齐, 应斜持试管呈45～0度角, 并能清楚地看到两个试管的斜面, 注意不要持成水平, 以免管底凝集水浸湿培养基表面( 图4-5) 。以右手在火焰旁转动两管棉塞, 使其松动, 以便接种时易于取出。
右手持接种环柄, 将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分( 环和丝) 必须烧红, 以达到灭菌目的, 然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍, 特别是接镍铬丝的螺口部分, 要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞, 将试管口在火焰上经过, 以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。
将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内, 先接触无菌苔生长的培养基上, 待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出, 接种环不能经过火焰, 应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕, 接种环应经过火焰抽出管口, 并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后, 放回原处, 并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架, 即可进行培养。
4．2  液体接种法
多用于增菌液进行增菌培养, 也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验, 其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同, 仅将不同点介绍如下:
由斜面培养物接种至液体培养基: 用接种环从斜面上沾取少许菌苔, 接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡, 或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时, 若用接种环不易挑起培养物时, 可用接种钩或接种铲进行。
由液体培养物接种液体培养基时, 可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、 滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可( 图 4-5) 。 
接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其它器皿上, 以免造成污染。如有溅污, 可用酒精棉球灼烧灭菌后, 再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管, 应立即放入盛有消毒液的容器内。
4．3  抗菌方法介绍, 重点平板孔穴法: 在铺有试验用的双碟琼脂平板上, 用眼科角膜环转或打孔器等距打三个孔, 柳叶刀挑出孔穴琼脂后, 用相同的移液管定量在每个孔内滴加不同浓度药液巧, 完成后的平皿放置于28℃恒温生物培养箱中, 培养后用游标卡尺准确量取抑菌圈直径。 药液配置: 利用容量瓶配制不同的庆大霉素溶液。用无菌水加少许DMSO溶解, 稀释, 浓度依次为500,250,125,62.5μg/mL。做好空白对照, 平行测三组。采用上述不同浓度药液用平板孔穴法对选用菌进行抗菌实验, 36小时后记录实验数据。
5  结果 
分别记录并描绘平板划线、 斜面微生物生长情况和培养特征。

实验三 从果皮中提取果胶及果冻的制备

一、 实验目的
( 1) 了解果胶的用途。
( 2) 了解从植物中提取果胶的原理和操作方法。
( 3) 了解果冻的制备方法
二、 实验用品
1．仪器
烧杯( 200mL、 100mL) , 玻璃漏斗, 纱布
2．药品
果皮(新鲜), HCl( 6mol·L-1) , 95%乙醇, 活性炭。柠檬酸, 柠檬酸钠, 蔗糖
三、 实验原理
果胶广泛存在于水果和蔬菜中, 主要存在于细胞壁间隙中, 把纤维素、 半纤维素结合在一起, 成为细胞壁的组成成份。如苹果中含量为0.7~1.5%(湿品计), 在蔬菜中以南瓜含量最多, 是7~17％。
果胶基本结构是以a-1,4苷键连结的半乳糖醛酸, 其中部分羧基被甲酯化, 其余的羧基与钾、 钠、 铵离子结合成盐。果胶主要以不溶于水的原果胶形式存于植物中。当用酸从植物中提取果胶时, 原果胶被酸水解形成可溶性果胶。而水解后的果胶不溶于乙醇, 在提取液中加入乙醇时, 可使果胶沉淀下来而与其它杂质分离。
四、 实验操作
( 1) 果胶的提取
称取新鲜柑桔皮碎粒10g, 放入150mL烧杯中加60ml水, 再加入2mL 6molL-1HCl, 加热至沸, 在搅拌下维持沸腾约30min, 趁热用纱布过滤。在滤液中加入少量活性炭于80℃加热20min进行脱色和除异味, 趁热抽滤, 得到黄色滤液。
滤液转移至100mL烧杯中, , 在不断搅拌下加入95% 乙醇, 加入乙醇的量约为原体积的1.3倍, 使酒精浓度达50%～60%左右, 静置10分钟。
过滤、 果胶用95%乙醇洗涤二次, 在60~70℃烘干, 即得果胶固体。计算果皮中果胶含量。
( 2) 柠檬味果冻的制备
将果胶0.2g( 干品) 浸泡在20ml水中, 软化后在搅拌下慢慢加热至果胶全部溶化。加入柠檬酸0.1g, 柠檬酸钠0.1g和蔗糖20g, 在搅拌下加热至沸, 继续熬煮5分钟, 冷却后即成果冻。
五、 思考题
( 1) 为什么要用乙醇洗涤果胶沉淀?
( 2) 果皮加酸煮沸提取果胶时, 一般煮沸30min即可, 煮沸时间太长或太短有什么影响?