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乳腺癌组织中ERα、ERβ蛋白表达及其意义
【摘要】 ［目的］ 探讨雌激素受体亚型在乳腺癌发生和发展中的作用。［方法］ 应用免疫组化技术及医学图像分析仪检测正常乳腺组织、单纯性增生组织、不典型增生组织及乳腺癌组织中ERα、ERβ及Ki67的阳性细胞百分率及灰度值，分析相应抗体的表达量。［结果］ ①与正常乳腺组织比较，乳腺癌患者组织中ERα阳性细胞百分率及灰度值明显升高；②ERβ的阳性细胞百分率在正常乳腺组织中高于不典型增生组织，而后者又高于乳腺癌组织，ERβ的灰度值在正常乳腺组织中也高于不典型增生；③不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织中；④Ki67的表达水平与ERβ的表达呈负相关，与ERα表达无显着性相关。［结论］ 在乳腺癌发生的不同病理阶段ERβ表达量是逐渐降低的，推测ERβ的表达降低与乳腺癌的发生有关。
【关键词】 乳腺肿瘤
随着乳腺癌中ERα、ERβ相继被发现，该受体得到了广泛的研究，但大多数是对mRNA水平的表达变化的研究。ERβ的表达水平比ERα低得多，获得高特异性的ERβ单克隆及多克隆抗体较为困难，因此，ERβ蛋白水平的研究相对缓慢，直到2000年才开始有零星的报道[1]。
近年来对ERβ研究的深入，人们认为受体真正发挥作用要有蛋白的表达和功能，因此ERβ蛋白水平的研究同样或更为重要。本研究应用免疫组化技术及图像分析仪检测正常乳腺组织、不典型增生及乳腺癌组织等不同病理变化过程中ERα和ERβ蛋白表达量的变化，以探讨ERα和ERβ在乳腺癌发生、发展中的作用及意义。
1 材料与方法
　研究对象
收集2001年1月～2003年12月期间武汉大学中南医院妇科的手术标本，每例样本均作病理确诊。其中乳腺纤维瘤30例、乳腺增生26例、不典型增生22例、乳腺癌标本68例。组织经甲醛固定，石蜡包埋备用。所有患者术前均未经过治疗。
　方 法
　主要试剂
单克隆抗体ERα和ERβ抗体：美国Sanata Cruz公司生产。常规免疫组化试剂盒SP及 Ki67抗体：福州迈新试剂公司生产。
　实验方法
分别取手术切除的乳腺组织石蜡块，每块连续切取7张5μm厚的切片，1张HE染色，核实病理诊断，另2张应用SP试剂盒进行免疫组化染色。分别用兔抗大鼠ERα、ERβ及Ki67抗体，孵育切片，再用生物素化的鼠抗兔二抗孵育30min，37℃，DAB显色5～10min。每步骤间用/L PBS 充分洗涤，常规脱水、透明、封片、镜下观察、摄片。另一张不加抗体作为阴性对照。在显微镜下观察形态学变化，染色成棕黄色颗粒者为阳性，每张切片随机取5个视野，计算每视野中每100个细胞中阳性细胞数，其平均值为该张切片的表达水平。使用医学图像分析仪测定细胞灰度值，用OS-9数据分析软件分析相应抗体的表达量，每张切片随机取5个视野，其平均值为该张切片的灰度值。
　统计分析
应用SPSS 软件包，对各组间的细胞阳性百分率，采用Kruskal-Wallis检验，配对资料采用Wilcoxon检验，灰度分析采用t检验，相关分析采用Spearman分析，认为差异有显着意义。
2 结 果
　ERα、ERβ在乳腺良性病变及乳腺癌组织中的表达
正常乳腺组织中ERα的阳性细胞平均百分率为±，单纯性增生及不典型增生组阳性细胞百分率分别为±、±，三组比较差异无显着性。乳腺癌组织为±，与正常乳腺组织比差异有显着性。随着病变程度的增加，阳性细胞的灰度值也是增加的，不典型增生组织(±)及乳腺癌组织(±)高于正常组织(±)，经统计学处理，差异有显着性，见表1。说明乳腺癌组织中ERα表达水平是升高的。
在正常乳腺组织及单纯增生性组织中ERβ的阳性细胞平均百分率高于不典型增生组织，而后者又高于乳腺癌患者。ERβ阳性细胞的灰度值在不典型增生及乳腺癌患者也逐步降低，经统计学处理，差异有显着性，见表2。提示从简单型增生、不典型增生到乳腺癌发展的不同病理过程中ERβ表达量是逐渐降低的。
　ERβ在病变旁组织组织中的表达
乳腺简单性增生、不典型性增生及乳腺癌组织中，同时取其周围组织进行ERβ表达水平的分析。发现在不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织，差异有显着性，而在简单型增生组织中，其周围组织与病变组织比较，两者表达水平差异无显着性，见表3。同时比较三组病变旁组织的平均阳性细胞数及阳性细胞灰度，发现三组间差异无显着性。
　　　ERα及ERβ与Ki67表达的关系
同时检测同一组织中Ki67的表达水平，发现正常乳腺组织中Ki67阳性细胞平均百分率为±、简单性增生为±、不典型增生为±、乳腺癌为±。中位百分数分别为％、％、％及％。Ki67的表达水平与ERβ的表达呈负相关，与ERα表达无相关性。
3 讨 论
乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一。研究资料提示，雌激素是乳腺癌重要的有丝分裂刺激剂，这种促分裂作用是通过乳腺组织中的雌激素受体介导。就其功能而言，ERα和ERβ均可通过两种方式介导基因转录：①通过经典的雌激素反应元件进行信号传导；②通过AP1增强子元件进行信号传递。当通过AP1位点进行信号传递时，ERα和ERβ发挥不同的生物活性，这提示ERα和ERβ在乳腺癌中的表达可能有重要临床价值。
ER受体亚型在肿瘤发生发展中的作用目前尚未形成一致性结论[1~5]。有研究发现，在ERα和ERβ共存的乳腺癌及卵巢肿瘤发生过程中，ERβ表达降低而ERα增加[6~8]。结肠癌组织中ERβ表达也明显降低，结肠病变的恶性转化与ERβ蛋白减少有关[10]。但另有研究表明胃癌、结直肠癌患者中，癌组织与正常组织中ER表达无明显差异，而且患者的ERβ表达与性别、肿瘤分级或分期无关，认为ERβ表达是组织特征，而不是恶性过程的结果[11]。
Gustafsson[12]为了明确ERβ在正常乳腺及乳腺癌中的作用，设计一种ERβ基因失活即ERβ基因敲除鼠，显示其乳腺上皮增生Ki67过度表达。随着鼠年龄增加，出现严重的囊性乳腺病，因此认为ERβ对正常乳腺有保护作用。Lazennec[13]研究发现ERβ在乳腺癌中表达水平比正常乳腺组织明显降低，为了明确ERβ在乳腺癌致癌中是否起作用，将ERα和ERβ均为阴性的乳腺癌细胞系通过腺病毒转染ERα或ERβ，用RT-PCR及Western blot方法检测到了ERα、ERβ的表达，发现ERβ蛋白定位于核内，在雌激素存在时能反式激活雌激素反应元件。ERα和ERβ都能诱导几种内源基因的表达，如雌激素调节蛋白、TGFα和细胞周期蛋白及酶抑制剂p21。但与ERα相反，ERβ不能调节c-myc原癌基因的表达；ERβ以不依赖配基的方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖，ERα抑制增殖是激素依赖的，而且ERβ直接抑制MDA-MB-231细胞活力和侵袭，此研究证明ERβ是乳腺癌细胞增殖和侵袭的重要调节剂，并提示ERβ失去表达将导致乳腺癌的发生。
从本实验研究通过检测正常及乳腺癌组织中ERα、ERβ变化以及增殖性抗原Ki67的关系来显示ERα、ERβ在乳腺癌发生中的作用。ERα在乳腺癌组织中表达量高于正常乳腺组织。ERβ阳性细胞在正常乳腺组织中的百分率简单型增生乳腺组织不典型增生乳腺组织乳腺癌组织，其表达量表现为由多到少的量变过程，并且ERβ的表达水平与Ki67表达水平呈负相关。同时我们取病变周围组织进行ERβ表达水平的分析，发现在不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织。上述实验结果提示，雌激素可能通过ERα刺激某些已经损伤的细胞走向恶性化，而ERβ则能抑制细胞的分裂活动进而避免恶化。ERα、ERβ在乳腺致癌过程中这些改变，提示ERα和ERβ特异途径在致癌过程中的决定性作用。
综上所述，在乳腺癌发生的不同病理阶段ERβ表达量是逐渐降低的，推测ERβ的表达降低与乳腺癌的发生有关。但是，ER变化在乳腺癌的发生、发展中的更深层意义还有待于大量的基础研究和前瞻性的临床研究。
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