基因工程整理版.doc

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Chapter1 基因工程概述
第一节 基因操作与基因工程

一、 基因操作与基因工程关系
1, 1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构;
2， 遗传学的兴起与发展, 特别是发现DNA是生命遗传信息的物质基础, 从而导致分子生物学的诞生;
3， 分子生物学: 从分子水平或核酸水平对生命现象和本质进行阐述和研究的生物学学科, 内容包括: DNA和RNA的结构、 复制、 表示、 调控、 遗传和变异等
4， 基因操作: 是研究分子生物学的手段, 同时也用来改造基因或者及其相关的大分子或者生物体, 目的是为人类的需求服务, 基因操作的内容包括: 分离、 分析、 改造、 检测、 表示、 重组、 转移等
5， 基因克隆和基因重组: 是基因操作中最重要的环节。PCR技术为基因的体外扩增提供了强大的工具。
6， 基因工程: 在各种酶的作用下, 将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接, 形成重组的DNA分子, 以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞, 并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。
基因工程具体的操作过程包括:
1目的基因的获得;
2目的基因连接到克隆载体或表示载 体, 形成重组DNA分子;
3重组DNA分子转化受体细胞, 并与之增殖;
4筛选受体细胞克隆, 表示目的基因。
二、 基因工程的诞生与发展
1、 60年代末－70年代初: DNA连接酶, 限制性核酸内切酶;
2、 1972年 P.Berg (80年获得诺贝尔化学奖) 完成世界上第一个体外重组DNA:

对(SV40 +λphage) DNA→EcoRI
↓T4 ligase
SV40 λ重组分子
3、 1973年 S.Cohen 和N.Boyer完成第一个细菌克隆, 用
R6-5(Kanr)+pSC101(Tetr) → EcoRI
↓T4 ligase
转化E.coli → Kanr, Kanr转化子
↓
分离转化子, pSC101完整, R6-5部分
4、 1974年 异源真核生物基因在E.coli中表示, S.Cohen, H.Boyer用非洲爪蟾的编码核糖体基因与pSC101重组导入E.coli, 分析转化子, 在E.coli细胞内有外源的mRNA转录产物。此后, 基因工程迅速发展: 1981年, 第一个转基因哺乳动物小鼠在美国问世; 1982年, 基因工程胰岛素商品在美国由Eli Lilly公司投向市场; 1982年, 转基因烟草获得成功; 1985年, 基因工程微生物杀虫剂经过美国环保署的审批; 1990年, 基因治疗开始进入临床试验; 1996年, 克隆羊多莉诞生;
主要应用于:
1遗传改良 2生物反应器 3基因治疗等
各种基因工程产品有:
抗病毒剂; 抗癌因子;新型抗生素;重组疫苗
免疫辅助剂;心血管防护急救药;抗衰老药
生长因子; 基因治疗及诊断Kit等

国家中长期科学和技术发展规划纲要( -2020年)
前沿技术
1 ．生物技术
( 1 ) 靶标发现技术
( 2 ) 动植物品种与药物分子设计技术
( 3 ) 基因操作和蛋白质工程技术
( 4 ) 基于干细胞的人体组织工程技术
( 5 ) 新一代工业生物技术

第二节
基因工程是生物科学发展的必然产物

一、 基因是基因重组的物质基础
1. 遗传因子:
① 19世纪中期, 孟德尔提出遗传性状是由来自父母的一种”因子”决定的
② 19 , 美国科学家W.H.Sutton基于实验猜测遗传因子就是染色体。
③ 19 , 摩尔根提出一条染色体决定一个性状。
④ Willard Johnnsen第一次引出基因的概念: 染色体上的基因是遗传因子。
⑤ 后来发现这些基因是由DNA组成的。
2. DNA与遗传的关系
① 1928年 Frederick Griffith 细菌转化实验证明: 细菌的某些性状能够经过与另一种细菌的碎片混合而发生改变。
② Oswald Avery等证实碎片中的转化物质就是DNA。
③ 1952年, Alfred Hershey和Martha Chase设计了著名的Hershey- Chase实验, 经过噬菌体感染细菌表明DNA能够独立指导子代噬菌体的复制, 噬菌体DNA包含了合成噬菌体蛋白和噬菌体DNA的遗传信息, 从而直接证明DNA是遗传物质。
二、 DNA的结构和功能
1. DNA的结构
① DNA的组成部分: 脱氧核糖、 磷酸基团、 四种含氮碱基
② DNA的三维结构: DNA的双螺旋结构, 脱氧核糖和磷酸基团彼此交错连接在一起形成链状结构, 碱基在双链内部经过氢键相互配对排列, 腺嘌呤-胸腺嘧啶( A-T) , 鸟嘌呤-胞嘧啶( G-C)
2. DNA的复制: 半保留复制方式
3.传递遗传信息: 基因-蛋白质
4.指导蛋白质合成: 中心法则
三、 基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展
1. 基因工程的工具
① 基因操作的车间-大肠杆菌和病毒
② 获得基因片段的工具-限制性核酸内切酶
③ 连接基因片段的工具-连接酶
④ 基因操作的载体-质粒和病毒
2. 重组DNA实验: 基因操作工具的开发为基因重组打下了坚实的基础。
四、 基因工程的内容
1. 基因操作基本原理
① 目的基因的获得: PCR技术、 DNA纯化、 电泳技术等
② 目的基因连接到克隆载体或表示载体, 产生重组DNA分子: DNA分子的分离、 纯化、 检测、 切割、 连接等
③ 重组DNA分子转化受体细胞, 并与之增殖: 转化和鉴定技术等
④ 筛选受体细胞克隆, 表示目的基因: 筛选和表示技术等
2. 基因工程应用: 包括植物基因工程、 细菌基因工程、 动物基因工程、 病毒基因工程等。
主要应用于: 1生物反应器: 生产蛋白质和酶2生物遗传改良: 培育抗虫抗病品种3基因治疗: 基因修正、 基因替换、 基因增补等
第三节
基因的结构-基因操作的理论基础

1. 基因是遗传信息的基本单位, 特定基因决定特定蛋白质的结构、 功能和性质
2. 一般认为基因包括mRNA所代表的整个序列, 其中包括编码区以外的一段序列。
3. 编码蛋白质的基因片段, 以及启动子、 终止子和复制区等功能片段。

一、 基因的结构组成对基因操作的影响
1.基因及其产物的共线性: 基因决定蛋白质的序列组成, 当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时, 则表明它们是共线性的; 2.基因及其产物的非共线性: 间断基因, 即基因间存在内含子, 它不能翻译为蛋白质, 但能够转录。; 3.基因的重叠性与可变性DNA序列与蛋白质序列的对应关系不是单一的。单个基因可经过不同部位的起始或终止表示而形成不同的蛋白质。
4．启动子和终止子
( 1) 启动子: 是基因转录过程中控制起始的部位, 一般转录起始了, 表示就能够进行。启动子又是RNA聚合酶的结合位点。从启动区到终止区为转录单位。原核生物的启动子与真核生物的启动子不同, 认识这一点对构建与认识表示载体以及穿梭载体具有重要作用。( 2) 终止子: 一种依赖ρ因子, 一种不依赖ρ因子, 后者主要是形成特定的二级结构的DNA序列。
二、 基因克隆的通用策略: 1用限制性内切酶切割目的DNA和载体DNA分子, 2连接, 3转化大肠杆菌, 4筛选。
作业及思考题:
1, 基因工程的具体操作步骤有哪些?
2, 谈谈你对基因工程的理解和认识, 举例说明你所熟悉的基因工程的应用情况。

Chapter2分子克隆工具酶
第一节: 限制性内切酶
一、 限制与修饰
1.限制与修饰现象2.限制酶的发现 命名: 宿主属名第一个字母, ＋种名头两个字母, ＋菌株号＋罗马序号。
名称 属名 种名 株名 序数 来源菌株
EcoRI E Co R 1 Escherichia coli R
HindIII H In d III Haemaphilus influenzae
HindII H In d II Haemaphilus influenzae
HindI H In d I Haemaphilus parainfluenzae

4; ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口

二、 限制酶识别的序列
1、 限制酶识别序列的长度; 一般4-8bp, 常见6bp , 当识别序列为4或者6bp时, 她们可识别的序列在完全随机的情况下, 平均每44=256和46=4096bp中会出现一个识别位点。
2、 限制酶识别序列的结构: 一般为回文对称结构
EcoRI: G↓AATTC
CTTAA↑G
3、 限制酶切割的位置
三、 限制酶切割产生的末端
1、 匹配黏端(matched end)
识别位点为回文对称结构, 产生的末端为匹配黏端(黏性末端, cohesive end), 形成的两个末端是相同的, 也是互补的。
2、 平末端(Blunt end)
在回文对称轴上同时切割DNA的两条链, 则产生平末端。
3、 非对称突出末端
许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时, 切割的 DNA 产物的末端是不同的, 如 BbvCⅠ , 它的识别切割位点 CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列, 其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ , 它的识别切割位点如下, 其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。
     GT↓AT/CGAC
     CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔序列, 间隔区域的序列是任意的, 如 DraⅢ 和 EarⅠ , 它们的识别切割位点分别是 CAC↑NNN↓GTG 和 CTCTTC (1/4)。
4、 同裂酶(isoschizomer): 识别相同序列的限制酶称为同裂酶, 但切割位点可能不同。
(1)同序同切酶 识别序列和切割位置都相同, 如 HindⅡ与HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC , HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG , MobⅠ与 Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC 。
(2)同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的, 但它们的切割位点不同, 分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC。另外, Asp718Ⅰ识别和切割位点为 G↓GTACC 。
(3)”同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ识别和切割位点为 G↓AATTC, ApoⅠ识别和切割位点为 R↓AATTY , 后者可识别前者的序列。另外, HpaⅠ和HincⅡ的识别位点也有交叉, 它们的识别和切割位点分别为GTT↓AAC和HincⅡ。(4)其它有些限制酶识别的序列有交叉, 如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点( 识别切割位点为 G↓TCGAC) , 该位点也可被AccⅠ( 识别切割位点为 GT↓MKAC) 和HincⅡ( 识别切割位点为GTY↓RAC) 切割。
5、 同尾酶(isocaudarner) 不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的, 且是对称的, 即它们可产生相同的黏性末端。
6、 归位内切酶(homing endonuclease)
内含子编码的内切酶, 内含肽等。
四、 DNA末端长度对限制酶切割的影响
1、 限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求。
2、 酶单位: 在适合的缓冲液及温度下, 在20μl反应体系中反应1h, 使1μgDNA完全消化所需要的酶量。
3、 在设计PCR引物时, 如果要在末端引入酶切位点, 就需要考虑加上一些满足酶切要求的碱基数目。
五、 位点偏爱(site preference)
对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割, 导致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。
1、 酶切位点对酶的敏感性不同,
2、 在切割相同量的不同DNA时所需要的酶量是不同的。
六、 酶切反应条件
1. 缓冲液: pH、 Mg2+、 DTT、 BSA
2. 反应温度: 大多数37℃
3. 反应时间: 1-2h
4. 终止酶切的方法: EDTA、 加热、 苯酚抽提去除蛋白、 试剂盒纯化DNA。
七、 星星活性(star activity)
在极端非标准条件下, 限制酶能切割与识别序列相似的序列。
1、 引起星星活性的因素: 甘油浓度过高, 酶过量, 离子强度低, pH过高等。
2、 抑制方法: 减少甘油浓度, 减少酶的用量, 提高离子强度, 降低pH, 保证反应体系无有机溶剂等。
八、 单链DNA的切割 某些限制酶只切割双链DNA中的一条链, 产生单链缺口, 即切口酶, 命名时在前面加上一个N。
九、 酶切位点的引入
1、 将产生的5’突出末端补平后, 再连接可产生新的酶切位点。
2、 同尾末端的连接: 不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时, 可产生新的酶切位点, 同时原来的酶切位点消失。
3、 平末端连接产生新的酶切位点
十、 影响酶活性的因素
1、 外因; 反应条件、 底物纯度、 酶量等
2、 内因; 星星活性、 底物甲基化和底物的构象
十一、 酶切位点在基因组中分布的不均一性
在基因组中碱基正确排列是非均匀的, 因此尽管有的酶切位点中GC含量相同, 但在基因组中出现的概率不同。
第二节 甲基化酶
一、 甲基化酶的种类(methylase)
1、 Dam甲基化酶; 在GATC序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基。
2、 Dcm甲基化酶; 识别CCAGG或CCTGG序列, 在第二个胞嘧啶C的C5位置引入甲基; 3、 EcoK I甲基化酶; 4、 Sss I甲基化酶
二、 依赖于甲基化的限制系统
1、 E.coli: McrA, McrBC和Mrr,识别序列不同, 但只识别经过甲基化的序列, 都限制由CG甲基化酶( M.SssI) 作用的DNA。
三、 甲基化对限制酶酶切的影响
1. 修饰酶切位点
2. 产生新的酶切位点
3. 对基因组作图的影响
第三节 DNA聚合酶
DNA polymerase主要功能: 催化DNA的合成
真核生物五种: α、 β、 γ、 δ、 ε
原核生物三种: DNA聚合酶I,II和III
一、 大肠杆菌聚合酶I
1、 活性: 大肠杆菌DNA聚合酶I为单链多肽, 相对分子质量为109×103, 有三种活性。
( 1) 5’－3’ DNA聚合酶活性
( 2) 5’－3’ 外切核酸酶活性
( 3) 3’－5’ 外切核酸酶活性
( 4) 交换反应 如果只有一种dNTP存在, 3’－5’ 外切核酸酶活性将从3’-OH端降解DNA, 然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应, 直到露出与该dNTP互补的碱基。
2、 大肠杆菌DNA聚合酶I的用途
( 1) 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’－3’外切核酸酶活性, 可用切口平移法标记DNA, 用作杂交探针
( 2) 用于cDNA克隆中第二链合成
( 3) 对3’－突出末端的DNA作末端标记
二、 Klenow DNA聚合酶
是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶裂解而从全酶中除去5’－3’外切酶活性的肽段后的大片段肽段, 其聚合活性和3’－5’外切酶活性不受影响, 相对分子质量为76×103
Klenow DNA聚合酶作用
( 1) 补平DNA的3’凹端,
( 2) 抹平DNA的3’凸端,
( 3) 经过置换反应对DNA进行末端标记,
( 4) 随机引物标记,
( 5) 其它用途, 如测序。
三、 T4噬菌体 DNA聚合酶
T4 phage DNA polymerase来源: T4噬菌体感染的大肠杆菌, 相对分子质量为114×103, 活性与Klenow DNA聚合酶相似, 但其3’－5’外切核酸酶活性强200倍, 且不从单链DNA模板上替换引物, 常见于诱变反应。
四、 T7噬菌体 DNA聚合酶
来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌, 是由两种紧密结合的蛋白质形成的复合体, 一种是噬菌体基因5编码的蛋白, 另一个是宿主细胞的硫氧还原蛋白。活性与T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶相似, 但其3’－5’外切核酸酶活性为Klenow DNA聚合酶1000倍, 可替代T4噬菌体DNA聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。
五、 耐热DNA聚合酶; 在高温下具有活性的DNA聚合酶, 来自嗜高温的细菌, 主要用于PCR反应, Taq DNA酶。
六、 反转录酶(reverse transcriptase)
依赖于RNA的DNA聚合酶, 有5’－3’合成DNA活性, 无3’－5’外切酶活性; 来自AMV( 禽成髓细胞瘤病毒) 或者Mo-MLV( Moloney鼠白血病病毒, 又称M-MuLV)
反转录酶的活性
1. 5’－3’DNA聚合酶活性( 需Mg2+) , 即以RNA或DNA为模板及带3’-OH的RNA或DNA引物合成DNA,
2. 5’－3’和3’－5’外切核酸酶活性, 产生含5’磷酸及3’-OH的长4－20个碱基的核苷酸,
3. 无3’－5’外切核酸酶校正作用, 在高浓度dNTP等条件下每500个碱基会有一个错误的掺入。
AMV反转录酶
包含两条多肽链, 具5’－3’聚合酶活性和很强的RNase H活性。
cDNA合成起始: 引物和mRNA模板杂交体可成为RNase H的底物, 模板的降解和cDNA的合成相竞争。
反应终止: RNase H可在正在增长的 DNA3’端切割模板, 抑制cDNA的合成。
(M-MuLV)反转录酶
RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒( M-MuLV) 反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA( 合成cDNA时) 或单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNase H活性的缺失增强了该酶合成长链cDNAs的能力。
反转录酶的用途
1. cDNA克隆中第一链的合成
2. 测定mRNA转录起始位点
3. 5’突出DNA的补平和标记
4. 双脱氧终止法测序
5. RT-PCR
七、 末端转移酶 (terminal ransferase)
来源于小牛胸腺, 是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶, 不依赖于模板的DNA聚合酶。
在2价阳离子存在下, 末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’-OH端。若dNTP为T或C, 首选Co2＋, 若dNTP为A或G, 首选Mg2＋, 可在cDNA或载体的3’末端加同聚尾, 便于克隆, 也可用标记的rNTP、 dNTP或ddNTP来标记DNA片段的3’末端。
第四节其它分子克隆工具酶
一、 依赖于DNA的RNA聚合酶( DNA dependent RNA polymerase)
包括: SP6噬菌体RNA聚合酶、 T4噬菌体RNA聚合酶、 T7噬菌体RNA聚合酶。
活性: 识别DNA中各自特异的启动子序列, 并沿此DNA模板起始RNA的合成, 无需引物。
用途: 体外合成RNA分子, 表示外源基因
二、 连接酶(ligase)
T4 DNA连接酶: 催化DNA5’磷酸基与3’羟基形成磷酸二酯键, 反应底物为黏端、 切口、 平末端的RNA或者DNA
大肠杆菌DNA连接酶: 需NAD+的参与, 作cDNA克隆时, 不会将RNA连接到DNA, 不连接RNA
Taq DNA连接酶: 在两个核苷酸之间进行连接反应, 同时必须与另一DNA链形成杂交体, 相当于连接双链DNA中的缺口, 作用在45-65℃, 需NAD+,主要用于在PCR扩增中引入寡核苷酸。
T4RNA连接酶: 能够催化单链DNA或RNA的5’磷酸与另一单链DNA或RNA的3’羟基形成共价连接, 用于标记RNA的3’末端、 单链DNA或RNA的连接等。
三、 T4多核苷酸激酶
T4 polynucleotide kinase 是一种磷酸化酶, 可将ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或者RNA的5’末端。
正反应: 将ATP的γ-磷酸基团转移至无磷酸的DNA的5’末端, 用于对缺乏5’磷酸的DNA进行磷酸化。
交换反应: 在过量ATP存在的情况下, 将DNA的5’端磷酸转移给ADP,然后DNA从ATP上获得γ-磷酸而重新磷酸化。
四、 碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase,简称CIP或CIAP, 催化除去DNA或RNA5’磷酸的反应, 经过去除5’磷酸基团, 可防止DNA片段自连, 或标记前去除DNA或RNA的R5’磷酸。
五、 核酸酶
1BAL31核酸酶; 2S1核酸酶;
3绿豆核酸酶; 4核糖核酸酶A
5脱氧核糖核酸酶Ⅰ; 6外切核酸酶Ⅲ
7核糖核酸酶H; 8RNase One
六、 核酸酶抑制剂
RNase inhibitor为RNase的非竞争性抑制剂, 以非共价方式结合在RNase A类的酶上, 其活性需要DTT, 主要应用于cDNA合成的反应中, 如RT-PCR。
七、 琼脂糖酶
Agarase是一种琼脂糖水解酶, 可将琼脂糖亚单位(新琼脂二糖)水解为新琼脂寡糖, 用于从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA或RNA片段。对热很稳定, 反应时不需要缓冲液。
八、 DNA结合蛋白
单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB)
与单链DNA结合, 能够消弱链内二级结构的稳定性, 从而加速互补多核苷酸的重新退火, 并经过消除阻碍DNA聚合酶前进的链内二级结构, 提高聚合酶的持续作用能力。
RecA蛋白: 来自大肠杆菌, 与重组有关, 可与单链DNA结合, 还可促进dsDNA对同源ssDNA的吸收作用, 是一个依赖于DNA的ATP酶
拓扑异构酶Ⅰ; 主要来自小牛胸腺, 经过瞬时破坏并再生磷酸二酯键, 解除共价闭环dsDNA中的超螺旋。
九、 其它酶
蛋白酶K(Proteinase K): 是具有高活性的丝氨酸蛋白酶, 由霉菌产生。能够水解肽键, 特别适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键, 能快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶, 有利于DNA和RNA的纯化。
溶菌酶: 是一类水解细菌细胞壁中聚糖的酶, 用于破碎细胞。
作业及思考题
1.限制性内切酶可分为哪几个类型, 各有何特点?
2.DNA聚合酶有哪些类型, 各有什么活性? 3.在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物?
Chapter3 分子克隆载体
一: 载体的基本含义和特征
1．载体: 将外源DNA或基因携带进入宿主细胞的工具称为载体
2．特征: 能够自我复制( 具备复制原点) 酶切位点 选择标记 较高的拷贝数
3.分类: 质粒载体、 噬菌体载体、 黏粒载体等
第一节 质粒载体
一、 质粒的基本特征
1.质粒的复制; 复制起始区和顺式作用元件
2.质粒的拷贝数; 严谨型和松弛型
3.质粒的不相容性; 两个质粒在同一宿主中不能共存( 不能共用同一复制系统) 。
4.转移性; 质粒可经过细菌结合的作用转移到新宿主细胞内。
二、 标记基因
1.选择标记基因; 用于鉴别目的DNA的存在, 将成功转化了载体的宿主挑选出来, 最广泛使用的是抗生素基因: ampr,tetr,Cmr or cat,kanr,neor,supF
2.筛选标记基因; 用于区别重组质粒与非重组质粒, 当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时, 可经过该标记来筛选插入了外源片段的质粒。
( 1) α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶的突变体之间实现互补。α-互补原理: lacZ基因是乳糖lac操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因, 乳糖及其衍生物可诱导其表示。一般载体上带有E.coli lac操纵子的调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG) 可诱导这个N末端片段的合成。当载体带有lacZ调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列, 而宿主中该部分序列缺失其它部分完整时, 虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性, 但它们相互协作则可形成有酶活性的蛋白, 在诱导物IPTG存在下, 细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷( X-gal) 培养基上形成蓝色菌落, 当在质粒上插入外源DNA, 使β-半乳糖苷酶N末端失活, 从而就不能进行α-互补, 因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。

( 2) 插入失活 质粒pBR322具有tetr基因和ampr基因,当外源DNA插入tetr基因后, 导致tetr基因失活, 只有ampr抗性。
三、 质粒载体的种类
1.克隆载体:主要用于克隆和保存DNA片段
2.表示载体:来源于克隆载体, 增加了强启动子等元件, 有利于表示产物分泌,分离,纯化
pUC18和pUC19质粒载体
pUC118和pUC119质粒载体
由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来, 大小为 3162bp , GenBank 注册号为 U07649( pUC118) 和 U07650( pUC119) 。
相当于在 pUC18/19 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必须的顺式序列。
pGEM-3Z/4Z质粒载体
pGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来, 大小为 2.74kb, GenBank 注册号为 X65304( pGEM-3Z, 2743bp) 和 X65305( pGEM-4Z, 2746) 。与 pUC18/19 相比, 在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子, 如Sp6和T7噬菌体的启动子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。
多功能质粒载体pBluescriptⅡKS(±)

第二节 λ噬菌体载体
一、 λ噬菌体的分子生物学
1.基因组大小: 双链DNA, 48,502bp
2.感染宿主后进入:
容原状态, 将λ噬菌体基因组DNA经过位点专一性重组整合到宿主的染色体中, 并随宿主的繁殖传递给子代。
裂解循环, 大量复制并装配成子代λ噬菌体颗粒, 导致宿主细胞裂解。
λ噬菌体的发育调节
( 1) 吸附( 2) 立即早期转录( 3) 延迟早期转录( 4) 溶原和裂解的感染分化( 5) 进入裂解生长( 6) 溶原化
二、 λ噬菌体载体的选择标记; 主要利用λ噬菌体的生物学特性来作筛选标记。
1．基因组大小
λ噬菌体的遗传学研究发现, 重组 λ 噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。当基因组 DNA 长度为野生型λ噬菌体基因组 DNA 的78～105% 时, 不会明显影响存活能力。野生型λ噬菌体基因组 DNA 为 48kb , 若用外源 DNA 片段完全替换可取代区, 外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内。
2．lacZ 基因
lacZ 基因也可用于λ噬菌体载体, 经过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段, 在 IPTG/X-gal 平板上可经过噬菌斑的颜色, 筛选重组噬菌体。
3．基因cⅠ失活
基因cⅠ是λ噬菌体的抑制基因, 全面抑制并阻断基因的表示。cⅠ基因的表示促进λ噬菌体进入溶源状态, 基因cⅠ产物活性受到影响会促进λ噬菌体进入裂解循环。如果外源 DNA 片段插入基因cⅠ中, 将高频率地使 hfl 突变E.coli进入裂解生长状态。在构建基因文库时, 可提高排除非重组噬菌体的效率, 从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。
4．Spi 筛选
野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli 中的生长会受到限制的表型, 称作 Spi+ , 即对P2噬菌体的干扰敏感( sensitive to P2 interference) 。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam , 同时带有 chi 位点, 而且宿主菌为 rec+ , 则能够在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好, λ噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此, 经过λ噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换, 可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。
三、 代表性λ噬菌体载体
1、 插入型载体
经过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体( insertion vectors) 。由于λ噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制, 因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源 DNA片段, 最大11kb 。
(1) lgt10 载体
 lgt10 载体( GenBank U02447) 大小为 43340bp , 是经典的 l 噬菌体载体, 主要用作 cDNA 克隆, 允许的插入片段大小为 0-6kb 。外源 DNA 量有限时较好, 克隆效率高。
(2) lgt11 载体
 lgt11 载体大小为 43.7kb , 是一个常见的载体lgt11 载体允许插入的 DNA 片段大小为 0～7.2kb 。它用于构建 cDNA 文库、 基因组文库和表示融合蛋白。该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lac5 基因, 可编码 b-半乳糖苷酶, 在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。 lac5 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoRⅠ 位点( 53bp 上游) , 可用于外源 DNA 片段的插入。筛选时, 在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时, 可表示出融合蛋白, 可用免疫学方法筛选阳性重组子。
另外还有:  S 基因的琥珀突变 Sam100 、 cⅠ基因的温度敏感突变 cⅠts857   
(3) lGEM-2/4
lGEM-2 和 lGEM-4 都是由 lgt10 改造而来, 也是 cDNA 克隆载体。
lGEM-2 和 lGEM-4 大小分别为 43.8kb 和 46.2kb ,可分别装载 0～7.1kb 和 0～4.7kb 外源片段。
lGEM-2 与lgt10 相比, 在 cⅠ基因内的 EcoRⅠ位点被来自 pGEM-1 质粒的一小部分片段取代。该小片段含有多克隆位点, 在其两端分别有一个 SP6 和 T7 噬菌体的启动子, 启动子之外各有一个 SpeⅠ 位点。在 lGEM-4中, 则是将完整 pGEM-1质粒替换 EcoRⅠ位点。
(4)  lZAPⅡ载体
lZAPⅡ整体上与lgt11 相似, 不同的是在基因 J 和 att 位点之间用 pBluescript SK质粒片段取代了相应的 l 噬菌体片段, 大小为41kb , 允许插入 0-10kb 的外源片段。因此, 该载体具备了pBluescript SK 质粒的一些特性, 如 a-互补以及可经过启动子合成RNA探针。
(5)  l Excell载体
lExcell 大小为 45.5kb , 与 lZAPⅡ 相似。不同的是, 在该载体中装载了 pExCell 质粒载体片段( 4190bp) 。该载体允许外源 DNA 插入的大小为 0-6kb , 主要用于 cDNA 克隆。 pExCell 与 pBluescript 载体相似, 除了多克隆位点不同外, 插入了一段来自 l 噬菌体的片段。该片段含有 l 噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att 。在 lExcell 载体中, pExCell 质粒相当于经过整合位点 att 整合到噬菌体 DNA 一样。
2、 置换型载体

允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体, 称为置换型载体( replacement vectors) 。组成示意图 3-11 。一般情况下, 置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb, 故而该载体主要用来构建基因组文库。
(1)  EMBL3 和 EMBL4
这两个载体大小为 43kb , 其左臂、 右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。从提高克隆效率角度来看, 它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因, 当外源片段替换填充片段后, 重组体将变成 red-gam- , 同时载体上含有 chiC 位点, 因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点, 这两个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反。 BamHⅠ 位点适合克隆用 Sau3AⅠ 部分消化的外源 DNA 片段, 在得到阳性克隆子后, 可用 SalⅠ 或 EcoRⅠ 将外源片段从重组载体上切割出来。经过 GenBank 可查找 EMBL3 的核苷酸序列, U02453( right arm) 和 U02425( left arm) 。
(2)  l 、 lDASH 和 lFIX 载体
l 、 lDASH 和 lFIX 载体的结构和大小与 EMBL3 载体相似, 主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、 排列和种类不同。 lDASH 和 lFIX 载体的特点在于, 在其多克隆位点中含有 T7 噬菌体启动子和 T3 噬菌体的启动子。这些噬菌体的启动子可在体外转录合成RNA, 用作染色体步查( chromosome walking) 的探针。
染色体步查: chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA 片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。
(3)  lGEM-11 载体
  lGEM-11 载体的左右臂来自 EMBL3 载体, 填充片段来自 l , 是一个多功能置换载体。其多克隆位点与上述置换载体稍有不同, 但保留 XhoⅠ 位点, 同时在填充片段的最末端各有一个识别 8 个核苷酸序列的稀有酶切位点 SfiⅠ 。在获得阳性克隆后, 经过 SfiⅠ 酶切位点可将外源片段从载体中切割下来进行亚克隆, 而在相当大程度上不会切割外源片段。还有一个区别是, 在右边的多克隆位点中有 SP6 噬菌体的启动子, 而不是 T3 噬菌体的启动子。
四、 λ噬菌体载体的克隆原理及步骤
1、 经过裂解过程增殖载体
2、 载体与外源DNA的酶切
3、 外源DNA与载体的连接
4、 重组噬菌体的体外包装
5、 包装噬菌体颗粒的感染 6、 筛选
第三节 单链丝状噬菌体载体
一、 M13噬菌体的生物学
1、 M13噬菌体的组成和结构
GeneBank:V00604,90%以上序列编码蛋白质, 共11个编码基因, 基因之间的间隔区多为几个碱基。编码三类蛋白: 复制蛋白、 形态发生蛋白、 结构蛋白。
2、 M13噬菌体的增殖
二、 M13噬菌体载体
1、 载体的插入位点
在M13噬菌体基因组中绝大多数为必须基因, 只有两个间隔区可用来插入外源 DNA( 基因Ⅱ/Ⅳ和基因 Ⅷ/Ⅲ之间) 。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的 508bp 间隔区是