大白猪产仔数性状全基因组关联分析.pdf

-102-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期大白猪产仔数性状全基因组关联分析王 源1，王 敏1，伊 宝2，滕乐帮3，于光辉1*（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.畜禽营养与饲养全国重点实验室，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3.平度市农业农村局，山东青岛 266700）摘 要：在猪业生产中，产仔数高低是评价母猪繁殖性能的重要指标。本研究以 738 头大白猪群体为研究对象，收集繁殖记录，并计算 14 胎次总的产仔数（Total Number Born，TNB）、总的产活仔数（Number Born Alive，NBA）性状。利用猪 80K 芯片对个体进行基因分型，采用 GCTA 软件对 TNB、NBA 性状进行全基因组关联分析。结果显示，在 15 号染色体上，共鉴定到 7 个与 NBA 性状显著关联的 SNP 位点，构成 1 个327 kb 的单倍型块。与猪 QTL 数据库比对，这些显著关联的 SNP 位于 3 个与繁殖性状相关的 QTL 区域内，与黄体数、乳头数等性状相关。在显著 SNP 位点上、下游 500 kb 区域内共包含 7 个基因，其中，IRS1、RHBDD1为产仔数性状相关基因。本研究为进一步鉴定猪繁殖性状关键基因提供理论依据。关键词：大白猪；产仔数性状；全基因组关联分析；功能基因中图分类号：S828.2 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20230629-02繁殖性状是养猪生产中重要的经济性状，母猪繁殖能力高低直接影响猪场的经济效益。评价母猪繁殖性能的指标主要有总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数、非生产天数等1。在现代养猪行业中，提高总产仔数、产活仔数是主要目标之一。但由于繁殖性能的遗传机制复杂、遗传力较低，且表型数据的获取周期长，只有在性成熟后期才能够收集表型数据2。因此，针对繁殖性状，利用常规育种方法取得的遗传进展有限。随着分子生物技术的发展，分子育种为动物育种提供了新的研究策略。将已经鉴定到的与繁殖性状相关的重要功能基因，如雌激素受体基因、卵泡生成素基因等3-4，应用到育种中能够有效提高繁殖性状的遗传进展。然而，繁殖性状受微效多基因控制，少数确定的候选基因只是揭示了一部分遗传变异5。因此，进一步鉴定影响猪繁殖性状的遗传变异与候选基因有助于揭示猪繁殖性能的遗传机制。近年来，全基因组关联分析（Genome-wide Assoc iation Study，GWAS）已成为鉴定畜禽重要经济性状候选基因的重要方法6。本研究收集 738 头母猪的繁殖记录，并对第 14 胎次总的产仔数（Total Number 收稿日期：2023-06-29；修回日期：2023-07-07资助项目：山东省农业良种工程重大项目（2020LZGC012）；畜禽营养与饲养全国重点实验室开放课题（2004DA125184F 2204）作者简介：王源（1989-），男，山西吕梁人，博士，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：*通讯作者：于光辉（1982-），男，山东青岛人，博士，副教授，主要从事猪遗传育种教学与科研工作，E-mail：17 杨酸,郭小江,杨红文,等.柯乐猪 PRLR 基因多态性与繁殖性状的关联性 J.浙江农业学报,2023,35(3):556-564.18 杨举伦,邹红,蔡琳,等.桥粒斑蛋白 II 在各种上皮组织中的表达 J.免疫学杂志,1995(1):40-42.19 Pigors M,Schwieger-Briel A,Cosgarea R,et al.Desmoplakin mutations with palmoplantar keratoderma,woolly hair and cardiomyopathyJ.Acta Derm Venereol,2015,95(3):337-340.20 赛依旦亚力买买提,布沙热木斯迪克,窦红,等.桥粒斑蛋白 rs2076304 基因多态性与煤工尘肺发病风险的相关分析J.中国工业医学杂志,2022,35(6):550-553.21 Serrote C M L,Reiniger L R S,Silva K B,et al.Determining the polymorphism information content of a molecular marker J.Gene,2020,726:144175.22 汪慧君,林志淼.DSP基因突变致皮肤脆性-羊毛状发综合征 1 例并文献复习 J.皮肤性病诊疗学杂志,2022,29(3):226-230.23 Piprek R P,Rams-Pociecha I,Zdanowski R,et al.Desmoplakin(Dsp)conditional knockout in NR5A1+somatic cells affects germ cell survival in developing mouse gonadsJ.Repro-duction,2022,163(4):199-207.（责任编辑：赵 楠）-103-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 Born，TNB）与总的产活仔数（Number Born Alive，NBA）性状进行 GWAS，进而鉴定与产仔数性状相关的 SNP 和功能基因。1 材料与方法1.1 实验材料 本研究中的 738 头大白猪来自北京某种猪场，采集耳组织样品，收集猪场繁殖记录，剔除异常值与缺失值，统计每个个体的 TNB 和 NBA，并分别计算各性状的描述性统计量，包括有效记录条数、平均值、标准差、最大值、最小值和变异系数。1.2 DNA 提取与基因分型 利用动物组织 DNA 提取试剂盒（货号 DP304，天根生化科技（北京）有限公司）提取耳组织样品的 DNA。经过质量检测，利用GeneSeek 公司的猪 80K 芯片对质量合格的样品进行基因分型。1.3 基因型数据质控 利用 Plink 软件7对芯片数据进行质控，标准如下：剔除基因型检出率 90%的个体，剔除SNP检出率90%、最小等位基因频率0.01、哈代-温伯格平衡检验中P10-6的 SNP 位点，保留常染色体上的位点进行后续分析。1.4 GWAS 本研究采用 GWAS 方法鉴定与猪产仔数性状相关的 SNP 位点，利用 GCTA 软件8进行基于混合线性模型的关联分析，其中，个体间亲缘关系矩阵是由常染色体上所有 SNP 进行构建，该模型中包括固定效应与随机效应，具体模型如下：y=a+bx+g+e其中，y是表型值；a是群体均值；b是固定效应，包括场效应、出生年效应；x是 SNP 基因型指示变量，分别取 0、1 或 2，代表 3 种基因型 11、12 和 22；g是剩余多基因效应；e是随机残差效应；其中，g服从正态分布N（0，K2），K 表示亲缘关系矩阵，2 表示SNP 标记解释的加性遗传方差。为了避免假阳性，采用控制错误发现率法（False Discovery Rate，FDR）对结果进行校正9-10，将 FDR设置为 0.01，利用下述公式计算阈值：P=FDRn/m其 中，n为 结 果 中P值 小 于 0.01 的 个 数，m为 总 的SNP 的个数，当 SNP 的P值小于阈值，则认为该位点是显著的。1.5 连锁不平衡分析 使用 Haploview 软件11对显著关联的 SNP 位点进行连锁不平衡分析，并构建单倍型块。1.6 功能注释 本研究中，SNP 的物理位置信息采用的是猪参考基因组 11.1 版本（https:/www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）。将显著关联的 SNP 与猪数量性状基因座（Quantitative Trait Locus，QTL）数据库进行比对，同时，利用 Ensemble 基因数据库（http:/asia.ensembl.org/index.html）对显著的 SNP 位点上、下游 500 kb 区域进行注释，并结合文献挖掘与繁殖性状相关的功能基因。2 结 果2.1 表型数据基本统计量 表 1 列举了 TNB 与 NBA 性状的描述性统计量。由表 1 可知，TNB 与 NBA 性状的变异系数均大于 10%，因此，这 2 个性状均可以通过制定合理的育种规划来取得一定的遗传进展。2.2 产仔数性状 GWAS 结果 经过质控，共有 738 个个体、54 114 个 SNP 用于后续分析。本研究中，计算得到 TNB 与 NBA 的阈值分别为 9.1610-5、8.7210-5。GWAS 结果显示，在 TNB 性状中未找到显著关联的SNP 位点，在 NBA 性状中找到了 7 个显著关联的 SNP位点，均位于 15 号染色体（表 2）。图 1 展示了与NBA 性状相关 SNP 的P值分布情况。2.3 连锁不平衡分析结果 对 15 号染色体上 7 个显著关联的 SNP 位点进行连锁不平衡分析（图 2），这些显著的 SNP 能够组成 1 个 327 kb 的单倍型块（127.79128.12 Mb）。2.4 猪 QTL 数据库比对结果 将显著关联的 SNP 位点与猪 QTL 数据库进行比对，共发现 90 个重叠的 QTL，表 2 与 NBA 性状显著关联的 SNP 位点表 1 产仔数性状的描述性统计性状有效记录数,条平均数,头标准差,头最小值,头最大值,头变异系数,%TNB73843.256.42206214.84NBA71241.685.97206214.32性状染色体SNP 名称位置,bpP值NBA15Chr15:1277953071277953076.9110-515Chr15:1278120491278120497.2410-515Chr15:1280406821280406827.3810-515Chr15:1280656271280656277.3810-515Chr15:1280110201280110207.8310-515Chr15:1281225661281225667.8410-515Chr15:1280608131280608137.9610-5-104-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期其中，与繁殖性状相关的 QTL 有 3 个，涉及到黄体数、乳头数、妊娠周期等性状。2.5 功能基因注释 对关联显著的 SNP 位点上、下游500 kb 区域进行功能注释，该区域内共包含 7 个基因。其中，重点关注参与胚胎发育、能量代谢、生长发育等生物学过程的功能基因，包括IRS1、RHBDD1等基因。3 讨 论猪繁殖性能的高低对猪的生产效率和经济效益起着至关重要的作用。因此，了解繁殖性能的遗传机制对制定猪育种计划至关重要。随着测序技术的发展，GWAS提供了一种检测畜禽重要经济性状潜在遗传变异和候选基因的有效方法12。近年来，与猪繁殖性状相关的GWAS 报道较多，例如 Li 等13对 453 头豫农黑猪的总产仔数、仔猪平均初生重等性状进行 GWAS，鉴定到28 个影响豫农黑猪繁殖性能的功能基因，包括RET、EIF1AX、NELL2、CTPS2等 基 因。Wijesena 等14对母猪初情期性状进行 GWAS，鉴定到 10 个与促性腺激素分泌、卵泡发育、妊娠等生理过程相关的功能基因。在本研究中，收集了 738 头大白猪的第 14 胎次的繁殖记录，利用猪 80K 芯片进行基因分型，并对TNB 与 NBA 性状进行 GWAS。与其他仅使用单个胎次表型数据的研究相比13,15，本研究充分利用了 4 个不同胎次的表型数据进行 GWAS。前期研究表明，胎次对母猪繁殖性能具有显著影响，总产仔数、产活仔数等性状随胎次的增加表现出先上升后下降的趋势，且在第 4 胎次达到高峰，同时，总产仔数与产活仔数性状在第 14 胎次呈现强的正遗传相关，分别为 0.720.98、0.710.972,16。因此，使用前 4 胎的产仔记录，能够更好地代表母猪的繁殖性能。在功能基因挖掘过程中，考虑到胚胎发育、能量代谢和生长发育等生物学过程是影响繁殖性能的主要因素，本研究筛选出 2 个潜在与产仔数性状相关的功能基因，包括IRS1、RHBDD1基因。其中，IRS1基因是胰岛素受体底物家族成员之一，能够编码一种被酪氨酸激酶磷酸化的蛋白质，该蛋白处于胰岛素信号通路的枢纽位置，在细胞正常的生理功能维持发挥重要作用17。研究表明，IRS1基因敲除小鼠表现出生长发育缓慢等症状18，同时，在糖代谢以及胆固醇代谢过程中，敲除IRS1基因导致胰岛素信号传递受到阻碍，引起糖类与脂类代谢异常19。RHBDD1基因是 Rhomboid 家族成员之一，编码一种跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶，在睾丸组织中表达水平较高，具有调节细胞凋亡的作用20。研究发现，RHBDD1基因与哺乳动物精子发生有关，它能够参与调节小鼠精原细胞凋亡，在小鼠曲细精管中由精原细胞分化为精细胞的过程发挥重要作用21。与其他研究相比，本研究中与 NBA 性状显著关联的 SNP 位于 3 个与繁殖性状相关的 QTL 区域内。其中，发现 1 个与黄体数相关的 QTL，位于 15 号染色体100.88140.41 Mb 区域22。在母猪妊娠过程中，排卵数与产仔数密切相关，黄体在排卵之后形成，所分泌的黄体酮是一种天然孕激素，能够在维持妊娠和早期胎儿发育过程中发挥作用23。4 结 论本研究对大白猪产仔数性状进行 GWAS，在 NBA图 2 显著 SNP 连锁不平衡分析Chr15:127795307Block 1(327 kb)1239999999999989898989898989898989797974567Chr15:127812049Chr15:128011020Chr15:128040682Chr15:128060813Chr15:128065627Chr15:128122566实线表示基因组水平显著阈值线（P=8.7210-5）。图 1 NBA 性状的 Manhattan 图P5432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18chromosome-105-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 性状中鉴定到 7 个显著关联的 SNP 位点，结合基因功能注释，筛选出IRS1、RHBDD1基因作为与产仔数性状相关的功能基因，为进一步鉴定繁殖性状关键基因提供有价值的理论依据。参考文献：1 Ye J,Tan C,Hu X,et al.Genetic parameters for reproductive traits at different parities in Large White pigsJ.J Anim Sci,2018,96(4):1215-1220.2 Yu G,Wang C,Wang Y.Genetic parameter analysis of repro-ductive traits in Large White pigsJ.Anim Biosci,2022,35(11):1649-1655.3 Rothschild M,Jacobson C,Vaske D,et al.The estrogen recep-tor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigsJ.Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(1):201-205.4 Zhao Y,Li N,Xiao L,et al.FSHB subunit gene is associated with major gene controlling litter size in commercial pig breeds J.Sci China C Life Sci,1998,41(6):664-668.5 李秀领,陈健梅,吴姿仪,等.全基因组关联分析鉴定法系大白猪繁殖性状基因组区域和候选基因 J.中国畜牧杂志,2022,58(8):157-164.6 汤香,何俊,蒋隽.全基因组关联分析在畜禽中的研究进展J.畜牧与兽医,2020,52(5):147-152.7 Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage ana-lysesJ.Am J Hum Genet,2007,81(3):559-575.8 Yang J,Lee SH,Goddard ME,et al.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.Am J Hum Genet,2011,88:76-82.9 Weller J I,Song J Z,Heyen D W,et al.A new approach to the problem of multiple comparisons in the genetic dissection of complex traitsJ.Genetics,1998,150(4):1699-1706.10 Wang Y,Ding X,Tan Z,et al.Genome-wide association study of piglet uniformity and farrowing intervalJ.Front Genet,2017,8:194.11 Barrett J C,Fry B,Maller J,et al.Haploview:analysis and vis-ualization 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