刺梨果渣天然替抗的制备及其在饲料添加剂中的应用.pdf

饲料营养与饲草692023.120 引言近年，非洲猪瘟等疫病蔓延流行，饲料抗生素滥用，严重威胁着人们的健康，国家农业农村部公告自2020年1月1日起，禁止生产除中药外所有促生长类药物饲料添加剂，抗生素危及人类健康，畜牧养殖业禁用抗生素，饲料禁抗成为定局，中药抑菌物质的提取替代抗生素已成为当下的研究热点。天然替抗剂的研发成为当下研究热点，中药中很多天然抑菌物质具有抗菌、抗应激、改善肠胃生态及提高畜禽免疫力等功能。由于中草药天然提取物受成本高昂、季节性要求强等因素制约1。开发低投入、高安全、性能稳供试用推广的天然替抗剂成为农副食品加工业的重要研究方向2。刺梨是一种水果，也是一种中药材，有健胃、消食及止泻等功效。刺梨果渣是贵州省的一种重要的农业原材料，产量可达750104 t，可以提供30104 t的果渣，根据万州汇源的柑橘渣的经济效益利润计算，将这些果渣作为可再次使用的原材料，可以为贵州省带来超过2亿元的经济效益3。研究发现，刺梨果渣富含黄酮、维生素C（简称VC）、总酚等功能性物质，其总酚含量是菠萝渣的4.4倍，苹果渣的3.7倍；维生素C含量是菠萝渣的23.8倍，是苹果渣的20.7倍；其中占比较大的总酚、黄酮、维生素C能够有效地抑制金黄色葡萄球菌、霉菌收稿日期：2023-11-03作者简介：杨胜红（2000-），男，贵州台江人，苗族，专科，研究方向：饲料添加剂资源化开发利用、香猪养殖喂养。*通信作者简介：周聃（1986-），女，安徽马鞍山人，汉族，博士，教授，研究方向：教育领导力、职业教育管理。杨胜红，洪源，兰方林，等梨果渣天然替抗的制备及其在饲料添加剂中的应用J现代畜牧科技，2023，103（12）：69-72 doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.12.018YANG Shenghong，HONG Yuan，LAN Fanglin，et alPreparation of Natural Substitute of Roxburgh Rose Fruit Residue and Its Application in Feed AdditivesJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，103（12）：69-72刺梨果渣天然替抗的制备及其在饲料添加剂中的应用杨胜红，洪源，兰方林，宋吉琴，陈潘慧，杨沛杰，邓斌，曹贵霞，沈丹，周聃*（贵州轻工职业技术学院，贵州 贵阳 550025）摘要：刺梨产业当下发展盛行，加工中产生的刺梨果渣占果实重量50%，仍残留大量维生素、黄酮、总酚等功能性物质。该文采用溶剂法进行制备刺梨果渣天然替抗试验，测定提取物的抑菌活性并应用于饲料添加剂中探究提取物的抑菌力，提取刺梨果渣中的天然抑菌物质替代抗生素，量化研究分析其在饲料添加剂中的应用。结果表明，得出刺梨果查天然抑菌提取物能够对细菌、霉菌等产生抑制作用，可以作为天然添加剂原料应用于饲料及其他农副产品中。关键词：刺梨果渣；替抗制备；饲料添加剂；资源化利用中图分类号：S816.7文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.12.018Preparation of Natural Substitute of Roxburgh Rose Fruit Residue and Its Application in Feed AdditivesYANG Shenghong，HONG Yuan，LAN Fanglin，SONG Jiqin，CHEN Panhui，YANG Peijie，DENG Bin，CAO Guixia，SHEN Dan，ZHOU Dan*（Guizhou Light IndustryTechnical College，Guiyang Guizhou 550025，China）Abstract：The development of Roxburgh Rose Fruit is popular currently，the processing of Roxburgh Rose Fruit residue accounted for 50%of the fruit weight，with abundant vitamins，flavonoids，total phenols and other functional substancesThe solvent method was used to prepare natural antibiotics substitute of Roxburgh Rose Fruit residue，and to determine the antibacterial activity of the extract and then apply it to feed additives to explore antibacterial motives of the extract，in order to extract the natural antibacterial substances in Roxburgh Rose Fruit residue instead of antibiotics and to quantitatively study and analyze its application in feed additivesThe results showed that the natural antibacterial extract of Roxburgh Rose Fruit can inhibit bacteria and mold，and can be used as a natural additives in forages and other subsidiary agricultural productsKeywords：Roxburgh Rose Fruit residue，antibiotics substitute preparation，feed additives，resource utilization饲料营养与饲草70 2023.12等细菌的生长4-7。相比于其他果渣农副产物，刺梨果渣具有较高的药用价值和开发价值8。因此选用废物刺梨果渣为原材料，提取刺梨果渣中天然的抑菌物质，研究其对常温下的抑菌能力，以果渣或其他地源性农副产物综合利用提供思路，将刺梨果渣饲料资源化利用，为我国饲料行业的发展献出一份力，也将推动中国的畜牧业发展。1 材料与方法1.1 材料、试剂与设备材料：刺梨果渣；大肠杆菌、金黄葡萄球菌、酵母菌、霉菌由学院生物发酵试验室提供。试剂：氯化钠、草酸、碳酸氢钠、无水碳酸钠、亚硝酸钠（95%）、氢氧化钠500 g、平板计数琼脂（PCA）、营养琼脂（NA）、L-半胱氨酸、胰蛋白胨250、芦丁、偏磷酸（38%）、磷酸三钠（分析纯、无水乙醇、马铃薯葡萄糖琼脂、磷酸二氢钾（分析纯）、福林酚、高岭土（化学纯）、酵母浸膏500 g（广东环凯微生物科技有限公司）；LS85 200 g（北京清源食品添加剂有限公司）；食用葡萄糖粉（优级，黑龙江金象生化有限责任公司）；甲醇500 mL（分析纯，广州市锦源化学有限公司）；没食子酸（99%，上海麦克林生化科技股份有限公司）。设备：粉碎机；数显恒温水浴锅；KS-500DE液晶超声波清洗器；202-3AB 电热恒温干燥箱；SPX-150B生化培养箱；电子分析天平；紫外光分光光度计；MA110电子天平。1.2 方法1.2.1 果渣提取液的制备流程干燥后的刺梨果渣经粉碎过筛（60目筛）称重（50 g）乙醇混合（65%）采用溶剂法提取过滤选取滤液真空浓缩提取液。经串联与并联试验得出的最佳提取工艺对刺梨果渣进行提取，将提前烘干的刺梨果渣，用粉碎机进行粉碎，用60目筛来对刺梨果渣粉末进行筛选，筛选出30 g刺梨果渣粉末作为备用，将农副产物果渣粉末加入其体积分数65%乙醇溶液中进行混合搅拌，然后使用超声波清洗器设备进行果渣物质的提取，设定温度45、提取时间65 min将得到的混合液过滤，后将所得的滤液置于水浴中加热处理，蒸发浓缩至没有乙醇味后用容量瓶进行存放，然后低温保存备用。1.2.2 刺梨果渣最佳提取条件研究设计出串联与并联的最佳提取工艺寻找试验，总共做出36组试验。通过这36组提取工艺得到提取液进行抑菌试验，最后通过试验结果对比分析得到最佳的提取工艺（提取温度45、料液比115、提取时间65 min、乙醇体积分数65%）。采用最佳提取工艺对刺梨果渣进行制作提取液，测定提取液中的VC、总酚、黄酮含量。1.2.3 果渣提取液抑菌物质的相关含量测定（1）刺梨果渣提取液之中的VC含量的测定。在VC的含量测定中，为测定刺梨果渣中VC的含量，使用2，6-二氯靛酚标准溶液进行还原滴定，以测定L（+）-抗坏血酸的提取液中VC的含量。滴定终点为2，6-二氯靛酚被还原为无色透明物质使。在酸性环境下多余的2，6-二氯靛酚将呈现淡粉色。可以计算2，6-二氯靛酚的消耗量，进而推算出刺梨果渣中VC的含量。其中VC含量X1见公式（1）计算：X1=（1）公式（1）中：试样L（+）的抗坏血酸含量简称为X1，对2，6-二氯靛酚溶液的滴定体积简称为V，对滴定前的2，6-二氯靛酚初始体积简称为V0，对2，6-二氯靛酚的滴定浓度简称为T，对稀释倍数简称为A。m代表刺梨果渣质量（g）。（2）提取物总酚含量的测定。采用福林酚分光光度法，测定刺梨果渣提取液中的总酚含量。酚类化合物在碱性条环境下将磷钨钼酸还原成蓝色化合物，吸光度与酚类化合物的含量在一定浓度范围内成正比，结合果渣提取液的吸光度绘制标准曲线。通过刺梨果渣提取液的稀释倍数可以计算出提取液中的总酚含量。提取液中总酚含量X2见公式（2）计算：X2=（2）c表示标准曲线计算所得的果渣提取液中总酚含量（mg/L），10为滤液稀释倍数；n表示果渣提取液的稀释倍数。图1为刺梨果渣提取液中总酚含量吸光度标准曲线。图1 吸光度标准曲线（3）刺梨果渣提取液的总黄酮含量的测定。采用的是硝酸铝显色法，测定刺梨果渣提取液中的总黄酮含量9。选择芦丁作为试验对照品，使用分光光度法测量提取液吸光度，根据得出数据绘制标准曲线之后，使用计算公式计算出刺梨果渣中的总黄酮含量。其中总黄酮含量X3见公式（3）计算：X3=（3）y=0.007 4x+0.118 7R2=0.999 40.40.30.20.100102030浓度吸光度40饲料营养与饲草712023.12由公式（3）可见，X3为刺梨果渣提取液中经过定量倍数稀释后得到试样中的总黄酮含量，单位为mg；c为通过计算得到的提取液总黄酮含量的浓度，单位为mg/mL；V为提取液定容后的体积，V1为加入反应液过后的体积。1.2.4 刺梨果渣提取液的抑菌直径、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定采用滤纸片扩散法确定抑菌圈直径大小，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌与酵母菌作为试验菌，为确保试验准确性，每种菌均采用3个试验加以准确性验证，做4种菌的空白对照试验，充分摇匀，取一定量的菌悬液，将其倒入对应的培养皿之中10-11。将其涂布均匀，后取浸泡24 h的圆片，放入到培养皿之中，每个培养皿中放入3片。为保证试验数据的准确，每个圆片之间要相隔一定的距离。让培养皿在适宜条件下培养。然后用尺子来测量经培养后的抑菌圈大小，由此来记录刺梨果渣提取液的抑菌能力12。通过二倍稀释法，可以获得6个浓度的刺梨果渣提取液13，其中100.000%、50.000%、25.000%、12.500%、6.250%、3.125%（其中刺梨果渣提取液的浓度分别为0.850 0、0.425 0、0.212 5、0.106 3、0.053 1、0.026 6 g/mL）14-15。使用移液管从每个培养皿中抽取 1 mL的样品，以确定其最佳的萃取效率，需要进行3次平行试验。然后取出无菌的培养基约15 mL，将其与刺梨果渣提取液混合，并搅匀，后加入1 mL菌悬液，涂布均匀。进行同上条件培养。刺梨果渣提取液的最小抑菌浓度以24 h不长菌作为标准，最小杀菌浓度以48 h不长菌作为标准。1.2.5 刺梨果渣提取液在饲料添加剂中的分析（1）饲料添加剂的替抗处理。正常室温条件下，将刺梨果渣提取液作为试样，根据GB/T 204442006国家标准添加化学四环素族抗生素，确保其抑菌效果；后将加入抑菌浓度的刺梨果渣提取液作为试样，确保其效果。经过上述处理，分别在第1、3、5、7天对饲料进行检测。（2）菌落总数的测定。在菌落总数的测定中，混合25 mL的刺梨果渣提取液和225 mL的稀释液，并将混合液递增10倍以制成系列稀释液。为测定样品中微生物的菌落数量，选取3份样品，并在适宜的稀释度下每份加入1 mL液体至无菌培养皿中。混合1520 mL计数琼脂平板培养基，并将其倒入培养皿中，置于恒温箱培育。观察并记录每个培养皿中的菌落数，并根据这些数据计算出菌落总数。1.3 数据处理使用Word Processing System 2022软件绘图进行数据分析。2 结果与分析2.1 果渣提取液抑菌物含量测定结果2.1.1 没食子酸、芦丁标准曲线的绘制根据没食子酸和芦丁在波长为778、510 nm测定吸光度，绘制标准曲线。通过对系列对照品进行测定，最后得到没食子酸和芦丁的标准曲线方程，分别为Y=0.033 7X+0.010 2（R2=0.993 8），Y=10.863X0.015 1（R2=0.997 6），其中Y为峰面积，X为质量浓度。没食子酸的线性范围是525 mg/L；芦丁线性范围是0.0130.093 mg/L。没食子酸相关系数接近1，同时芦丁关系数也接近1，可以用来计算果渣中的总酚和总黄酮的含量。2.1.2 刺梨果渣提取液抑菌含量测定经过测定，刺梨果渣提取物中总酚和总黄酮含量分别为561.4 mg/L和2.94 mg/mL，与蒙药瞿麦总酚和红枣中的黄酮含量相当，总黄酮含量比刺梨中要低，而维生素C的平均含量则达到了743.9 mg/100 g，是苹果和橙汁的19倍和4倍16-18。试验表明，刺梨果渣提取物具有较强的抗菌活性，可以有效地抑制细菌的生长。经多次试验，发现刺梨果渣中的总酚、黄酮和VC含量均显著增加，这不仅可以证明刺梨果渣提取液中的主要元素含有丰富的营养，还能有效抑制细菌生长，完全符合预期。2.2 果渣提取液抑菌圈的直径与提取液浓度测定结果2.2.1 抑菌圈直径的测定结果采用滤纸片扩散法，进行抑菌效果的测定。滤纸片使用6 mm直径，认定刺梨果渣提取液不抑菌标准：抑菌圈直径接近6 mm。对图2中的抑菌圈的直径进行测量，根据测量的结果得到，对照组中的抑菌圈接近6 mm，这说明没有形成透明的抑菌圈。提取液在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的抑菌圈的直径分别为16.2、13.9、9.8、12.7 mm，从试验结果中看出，刺梨果渣中具有良好的抑菌效果。图2 刺梨果渣提取液的抑菌效果A：大肠杆菌；B：金黄色葡萄球菌；C：酵母菌；D：霉菌2.2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度由表1可以看出，果渣的提取液对大肠杆菌的最小抑菌浓度值为12.500%、金黄色葡萄球菌为12.500%、酵母菌为50.000%、霉菌为25.000%。刺梨果渣的提取液对几种菌的最小杀菌浓度值，金黄色葡萄球菌为12.500%、大肠杆菌为25.000%、酵母菌为100.000%、霉菌为50.000%。饲料营养与饲草72 2023.12表1 刺梨果渣提取液对各菌的最小抑制浓度和最小杀菌浓度 单位：%菌种最小抑菌浓度最小杀菌浓度金黄色葡萄球菌12.50012.500大肠杆菌12.50025.000酵母菌50.000100.000霉菌25.00050.0002.3 刺梨果渣提取物在饲料添加剂中的抑菌应用通过仔细观察，记录各平板中的平均菌落数量，从图3中可以发现，随着时间推移，3个试验的抑菌效果存在着明显的差异（P0.05），其中，试验中菌落的增长速度最快，据图3得出试验在5 d前无菌落生长，在57 d试验的菌落增长不明显，在前3 d内，3个试验对饲料的抑菌能力都有明显的差异。经过7 d的试验，可以发现刺梨果渣天然替抗抑菌提取物具有良好的抑菌效果，其抑菌作用与化学四环素族抗生素的抑菌作用相当，能够有效抑制饲料中菌落总数的增长。图3 抑菌效果的比较（n=3）注：图中不同字母表示差异显著（P0.05）。3 总结试验显示，刺梨果渣中的抑菌成分对金色葡萄球菌等细菌都有较为明显的抑制效果，相比于其他果渣农副产物，富含多种营养成分，具有较高的开发价值和市场前景5。这是一种天然的、对家禽无害的天然替抗产品原料，混合于饲料中可以起到明显的替抗作用，绿色的天然替抗可以保证食用的肉制品更加安全。刺梨果渣中营养物质丰富，通过试验提取后的刺梨果渣提取液等可以作为畜牧养殖业饲料添加剂的天然绿色原料选择，既是解决“三农”问题助力乡村振兴的重要手段，也是国家推进“双碳”政策的题中要义。刺梨果渣或其他果实副产品废弃物可以制备天然替抗剂加入饲料添加剂提高畜禽质量，该试验研究将果渣变废为宝制成天然替抗运用在饲料添加剂中，为我国饲料替抗事业的发展提供更多的创新可行性思路，能够更好地服务畜禽养殖的绿色高质量发展，进一步推动中国的畜牧业发展。参考文献1李洁，李世新中草药饲料添加剂在畜禽生产中的应用J甘肃畜牧兽医，2022，52（8）：5-82王薇，夏炳南刺梨的研究进展J中国药学杂志，1996，31（11）：643-6453张银，任廷远刺梨果渣生产功能性饲料的开发利用J农产品加工，2019，25（10）：53-544李达，姜楠刺梨果渣成分分析及发酵前后不同成分含量的变化J农产品加工，2016（2）：35-36，395周禹佳，樊卫国刺梨果渣的营养、保健成分及利用价值评价J食品与发酵工业，2021，47（7）：217-2246Dh A，Chao L，QC B，et alIdentification of 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