稻田稗草对五氟磺草胺的抗性机制及其防治药剂筛选.pdf

中国农业科学 2023,56(14):2713-2723 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.007 收稿日期：2023-04-11；接受日期：2023-05-14 基金项目：安徽省科技重大专项（201903a06020033）、安徽农业大学人才引进科研启动项目（rc342004）、安徽农业大学大学生创新训练项目（X202210364248）联系方式：张丽雅，E-mail：。李奇，E-mail：。张丽雅和李奇为同等贡献作者。通信作者赵宁，E-mail： 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：稻田稗草对五氟磺草胺的抗性机制及其防治药剂筛选 张丽雅1，李奇1，史珊珊1，马雨梦1，刘亚琪1，赵超伟1，王鹤如2，操海群1，廖敏1，赵宁1?1安徽农业大学植物保护学院/作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，合肥 230036；2天长市农业科技中心植保站，安徽天长 239300 摘要：【目的】稗草（Echinochloa crus-galli）是我国水稻田主要恶性杂草之一，五氟磺草胺等乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制剂类除草剂是防治稻田稗草的主要除草剂种类。本研究团队前期在安徽省天长市水稻主产区发现疑似五氟磺草胺抗性稗草种群 AHTC-01，明确其对稻田不同种类除草剂的抗性水平及可能的抗性分子机制，为抗性稗草有效防治、延缓其抗药性进一步发展提供理论依据。【方法】采用温室盆栽法在整株水平上测定稗草种群 AHTC-01 对五氟磺草胺的抗性水平及对不同除草剂的抗性模式，并通过靶标基因测序和实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析探索其靶标抗性分子机制。【结果】相比敏感稗草种群 AHFY-01，疑似抗性稗草种群 AHTC-01 已对五氟磺草胺产生高水平抗性，抗性倍数（resistance index，RI）为 620。靶标抗性机制分析表明，AHTC-01 种群ALS基因拷贝 2（ALS2）第 574 位氨基酸由色氨酸（Trp）突变为亮氨酸（Leu），其种群突变频率为 100%；在五氟磺草胺处理后 12 h，抗性稗草种群 AHTC-01 ALS相对表达量为敏感稗草种群 AHFY-01 的 2.26 倍。AHTC-01 同时对其他 3 种 ALS 抑制剂类除草剂双草醚、嘧啶肟草醚、甲氧咪草烟产生不同水平交互抗性，抗性倍数分别为 8.24、13.36、20.36；但是对乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）抑制剂氰氟草酯、精噁唑禾草灵和烯草酮，4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）抑制剂三唑磺草酮，合成生长素类（synthetic auxin mimic）氯氟吡啶酯等其他作用机制除草剂依旧较为敏感。【结论】稗草种群 AHTC-01 靶标基因ALS2第 574 位氨基酸突变和ALS过量表达是其对五氟磺草胺产生抗性的主要原因之一，该抗性机制同时赋予其对不同 ALS 抑制剂的交互抗性。农田生产实际中，可轮换使用其他作用机制除草剂对其进行有效防治。关键词：稗草；五氟磺草胺；乙酰乳酸合成酶；基因突变；基因过量表达；抗性模式 Resistance Mechanism of Barnyard Grass(Echinochloa crus-galli)to Penoxsulam and Screening Herbicides for Its Control in Rice Fields ZHANG LiYa1,LI Qi1,SHI ShanShan1,MA YuMeng1,LIU YaQi1,ZHAO ChaoWei1,WANG HeRu2,CAO HaiQun1,LIAO Min1,ZHAO Ning1?1School of Plant Protection,Anhui Agricultural University/Anhui Province Key Laboratory of Crop Integrated Pest Management,Hefei 230036;2Tianchang Agricultural Science and Technology Center Plant Protection Station,Tianchang 239300,Anhui Abstract:【Objective】Barnyard grass(Echinochloa crus-galli)is one of the main malignant weeds in rice fields in China.2714 中 国 农 业 科 学 56 卷 Acetolactate synthase(ALS)inhibitors,such as penoxsulam,are the main herbicides for controlling E.crus-galli in rice fields.Previously,our research team identified a suspected penoxsulam-resistant E.crus-galli population,AHTC-01,in the main rice production area of Tianchang City,Anhui Province,China.The objective of this study is to clarify its resistance levels to major herbicides,investigate the possible resistance molecular mechanisms,and to provide a theoretical basis for the effective control of resistant E.crus-galli and the delay of further development of herbicide resistance.【Method】Using the greenhouse potting method,the resistance levels of AHTC-01 to penoxsulam and its resistance patterns to different herbicides were determined at the whole-plant level.The target resistance molecular mechanism was explored through target gene sequencing and real-time quantitative PCR(RT-qPCR)analysis.【Result】Compared with the susceptible E.crus-galli population AHFY-01,the suspected resistant population AHTC-01 had developed high-level resistance to penoxsulam,with a resistance index(RI)of 620.Analysis of the target-site based resistance mechanisms showed that the ALS2 gene copy in the AHTC-01 population had a mutation from tryptophan(Trp)to leucine(Leu)at codon position 574,with a population mutation frequency of 100%.At 12 h after penoxsulam treatment,the relative expression level of ALS in the resistant E.crus-galli population AHTC-01 was 2.26 times of that in the susceptible E.crus-galli population AHFY-01.AHTC-01 also exhibited varying levels of cross-resistance to three other ALS inhibitors,bispyribac sodium,pyribenzoxim,and imazamox,with RIs of 8.24,13.36,and 20.36,respectively.However,it remained susceptible to other herbicides with different modes of action(MOAs),including the acetyl-CoA carboxylase(ACCase)inhibitors cyhalofop-butyl,fenoxaprop-P-ethyl,and clethodim,the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(HPPD)inhibitor tripyrasulfone,and the synthetic auxin mimic florpyrauxifen-benzyl.【Conclusion】Mutation of the ALS2 at amino acid position 574 and ALS overexpression are one of the main reasons for the resistance of E.crus-galli population AHTC-01 to penoxsulam,which also confers cross-resistance to different ALS inhibitors.In actual agricultural production,effective control of this type of resistant E.crus-galli can still be achieved by rotating the use of other herbicides with different MOAs.Key words:Echinochloa crus-galli;penoxsulam;acetolactate synthase(ALS);gene mutation;gene overexpression;resistance pattern 0 引言【研究意义】稗草（Echinochloa crus-galli）是世界性恶性禾本科杂草之一，广泛分布在全球各水稻生产区1。在我国，稗草主要危害水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）等秋熟作物，严重发生时可导致显著减产。有研究表明，9 株/m2稗草发生密度可导致水稻减产 57%左右2-4。乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制剂类除草剂是水稻田常用除草剂类别之一，其主要通过抑制靶标杂草体内 ALS 活性，影响支链氨基酸合成并干扰有丝分裂，进而导致植物死亡5。目前，ALS 抑制剂类除草剂主要包括 5大类别：磺酰脲类（sulfonylurea，SU）、咪唑啉酮类（imidazolinone，IMI）、三唑并嘧啶磺酰胺类（triazolopyrimidine sulfonanilide，TP）、嘧啶硫代苯甲酸酯类（pyrimidinyl thiobenzoate，PTB）、磺酰 胺 基 羰 基 三 唑 啉 酮 类（sulfonylaminocarbonyl-triazolinone，SCT）6，其中五氟磺草胺（penoxsulam）是 TP 类除草剂的典型代表7，其于 2008 年在我国首次登记，主要用于水稻田防除稗草、莎草和阔叶类等一年生恶性杂草。然而已有研究表明，作用位点单一的除草剂长期、频繁、超量使用极易诱导杂草产生抗性8。在其登记过后仅 7 年，王琼等就报道采集自黑龙江、安徽、江苏、宁夏等地水稻田的稗草种群对五氟磺草胺产生了不同水平的抗性9，随后我国水稻主产区五氟磺草胺抗性稗草案例频发10-17，给水稻安全生产构成严重威胁。明确稗草抗性发展情况及其内在抗性分子机制，对于科学防治抗性稗草以及缓解稗草抗性发展具有重要意义。【前人研究进展】靶标抗性（target-site based resistance，TSR）和非靶标抗性（non-target-site based resistance，NTSR）是杂草对除草剂产生抗性的两个主要机制18。靶标抗性主要涉及靶标基因突变和过量表达，二者分别通过改变靶标蛋白构象或者增加靶标蛋白含量而赋予杂草对除草剂的抗性19。目前已证实，不同杂草物种 ALS 存在 Domain AE 5 个高度保守区，其中在与 ALS 抑制剂结合过程中，有 8 个具有关键作用的氨基酸位点可能发生突变，分别为 Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653 和 Gly654，而且这些氨基酸位点的突变通常导致杂草对同一作用机制的药剂产生交互抗性20。针对 ALS 抗性稗草，多数案例是由于靶标基因一个或者多个决定 ALS 蛋白构象的关键氨基酸发生了非同义突变21。此外，靶标基因过量表达也是某些杂草产生 ALS 抗性的分子机制之一。14 期 张丽雅等：稻田稗草对五氟磺草胺的抗性机制及其防治药剂筛选 2715 比如，SEN 等22发现 ALS 过量表达可能是贫育雀麦（Bromus sterilis）对啶磺草胺产生抗性的原因之一，ZHAO 等23也报道了抗甲基二磺隆的看麦娘（Alopecurus aequalis）ALS 发生过量表达。黄启超等24发现抗性稗草种群 18-WJJ-Ec ALS 表达量是敏感稗草种群 18-NJ 的 8.72 倍，进而推测 ALS 过量表达参与了稗草的抗药性表型。相比之下，非靶标抗性则几乎包括所有可以影响除草剂到达靶标作用位点的机制，比如减少对除草剂吸收或转运、增加对除草剂屏蔽和隔离、增强对除草剂解毒代谢等25。其中，代谢抗性也是多种杂草对 ALS 抑制剂类除草剂产生抗性的主要原因之一，其一般会赋予杂草不可预测的除草剂抗性模式。研究表明代谢抗性是多个超基因家族协同作用的结果，通常涉及到几个主要的除草剂解毒酶家族，如细胞色素P450单加氧酶系（cytochrome P450 monooxygenases，CytP450s）、谷胱甘肽 S-转移酶系（glutathione S-transferases，GSTs）、UDP-糖基转移酶系（UDP-glucosyltransferases，UDP-GTs）和ABC 转运体（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters）等，其中某些能够赋予杂草抗药性的关键基因近年来也得到鉴定，比如 CYP81A 家族基因广泛参与稗草、菵草（Beckmannia syzigachne）等多种杂草对不同除草剂的代谢抗性等26-27。稗草 P450s活性增强参与针对 ALS 抑制剂抗性的案例也在逐年增加28-29。【本研究切入点】安徽省是我国长江中下游水稻主产省份之一。前期田间调查表明，该省各地市水稻田稗草、千金子（Leptochloa chinensis）等禾本科杂草发生较为严重30-31，其中安徽省天长市等地区农户近年来普遍反映，五氟磺草胺等稻田常用除草剂在大田推荐剂量下防治效果较差，推测稗草等杂草已经对其产生了抗药性。2020 年 10 月，本课题组于该地区水稻田采集到一个稗草疑似抗性种群AHTC-01，然而其具体抗性发生情况以及内在抗性机制如何，目前尚不清楚。【拟解决的关键问题】针对AHTC-01 稗草种群，首先采用整株生物测定明确该种群对五氟磺草胺的敏感性和抗性水平，随后探索其潜在的靶标抗性分子机理，同时测定目标抗性机制所赋予该种群的交互抗性模式，以及其对不同作用机制除草剂的敏感性和抗性水平。预期研究结果将明确AHTC-01 稗草种群对五氟磺草胺的抗性水平和靶标抗性分子机制，同时筛选可用于防治该稗草种群的有效药剂，为抗性稗草科学防治、延缓其抗药性发展提供依据。1 材料与方法 1.1 杂草种子采集 2020 年 10 月，于安徽省天长市万寿镇石庄村水稻田（119.09E，32.73N）采集到疑似抗五氟磺草胺稗草种群 AHTC-01，据当地农户反映，该田块已连续至少 10 年使用 ALS 抑制剂五氟磺草胺防除稗草、千金子等恶性杂草，且种子采集当季以大田推荐剂量（30 g a.i.hm-2）于水稻苗后早期、稗草 3 叶期左右施用过五氟磺草胺；同期于安徽省滁州市凤阳县赵家圩子村非耕地（117.68E，32.83N）采集到敏感稗草种群 AHFY-01，该地块近 20 年来未使用过任何除草剂。各种群种子均随机采集自至少 200 株稗草成熟穗，于室温下风干后分别装入牛皮纸袋，保存于 4 备用。1.2 药剂、试剂及仪器 主要供试药剂：25 gL-1五氟磺草胺可分散油悬浮剂（OD）、30%氰氟草酯（cyhalofop-butyl）乳油（EC）、3%氯氟吡啶酯（florpyrauxifen-benzyl）EC，美国陶氏益农公司；69 gL-1精噁唑禾草灵（fenoxaprop-P-ethyl）水乳剂（EW），拜耳作物科学（中国）有限公司；4%甲氧咪草烟（imazamox）水剂（AS）、240 gL-1烯草酮（clethodim）EC，山东奥坤作物科学股份有限公司；10%双草醚（bispyribac-sodium）悬浮剂（SC），安 徽 久 易 农 业 股 份 有 限 公 司；5%嘧 啶 肟 草 醚（pyribenzoxim）微乳剂（ME），山东青岛奥迪斯生物科技有限公司；6%三唑磺草酮（tripyrasulfone）OD，江苏清原农冠杂草防治有限公司。主要供试试剂：Nuclean Plant Genomic DNA Kit、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，北京康为世纪生物科技股份有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix、DNA 凝胶回收试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Quick RNA Isolation RNA Kit，北京华越洋生物科技有限公司；LA Taq DNA Polymerase with GC Buffer，北京宝日医生物技术有限公司。主要供试仪器：BIC-400 型人工气候箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FA/B 系列万分之一天平，上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司；3WP-2000 型行走式喷雾塔，农业农村部南京农业机械化研究所；T100 型梯度 PCR 仪，美国 Bio-Rad 公司；ERS 200 型电泳仪，北京原平皓生物技术有限公司；ZF-288 型凝胶成像分析系统，上海金鹏分析仪器2716 中 国 农 业 科 学 56 卷 有限公司；Nanodrop 2000 型分光光度计，美国 Thermo Scientific 公司。1.3 方法 1.3.1 稗草对五氟磺草胺的敏感性和抗性水平测定 参照农药室内生物测定试验准则除草剂第 4 部分：活性测定试验茎叶喷雾法（NY/T 1155.42006）进行，种子催芽和植株培养30后采用五氟磺草胺大田推荐剂量初筛进行预试验（数据未展示），据此设定其梯度施药剂量，以清水处理作为空白对照（表 1）。使用 3WP-2000 型行走式喷雾塔进行茎叶喷雾处理，喷雾时扇形喷头距离稗草叶片约 50 cm，喷液压力0.275 mPa，喷液量 450 Lhm-2。施药后继续培养 3 周，第 21 天时称量植株地上部鲜重。每个处理至少重复 3次，整个试验重复 2 次。表 1 整株剂量响应试验所用除草剂处理详细信息 Table 1 Detailed information of the herbicide treatments applied in the whole-plant dose-response experiments 系列剂量系列剂量 Series of doses(g a.i.hm-2)除草剂除草剂 Herbicide 抗性种群抗性种群 AHTC-01 Resistant population AHTC-01 敏感种群敏感种群 AHFY-01 Susceptible population AHFY-01 五氟磺草胺 Penoxsulam 0,60,120,240,480,960,1920 0,0.04,0.12,0.37,1.11,3.33,10 双草醚 Bispyribac-sodium 0,45,90,180,360,720,1440 0,5.60,11.30,22.50,45,90,180 嘧啶肟草醚 Pyribenzoxim 0,37.50,75,150,300,600,1200 0,4.70,9.40,18.80,37.50,75,150 甲氧咪草烟 Imazamox 0,24,48,96,192,384,768 0,3,6,12,24,48,96 氰氟草酯 Cyhalofop-butyl 0,0.49,1.48,4.44,13.33,40,120 0,0.49,1.48,4.44,13.33,40,120 精噁唑禾草灵 Fenoxaprop-P-ethyl 0,0.10,0.50,2.50,12.40,62.10,310.50 0,0.02,0.10,0.50,2.50,12.40,62.10 烯草酮 Clethodim 0,0.03,0.17,0.86,4.32,21.60,108 0,0.03,0.17,0.86,4.32,21.60,108 三唑磺草酮 Tripyrasulfone 0,0.04,0.22,1.08,5.40,27,135 0,0.04,0.22,1.08,5.40,27,135 氯氟吡啶酯 Florpyrauxifen-benzyl 0,0.15,0.44,1.33,4,12,36 0,0.15,0.44,1.33,4,12,36 本研究所使用各除草剂田间推荐剂量以粗体显示，其中五氟磺草胺田间推荐剂量为 30 g a.i.hm-2 The field-recommended doses for each herbicide used in this study are marked in bold,among which the field-recommended dose for penoxsulam is 30 g a.i.hm-2 1.3.2 稗草靶标基因ALS序列扩增和比对 DNA 提取和引物信息：稗草种子萌发和生长条件同 1.3.1。待稗草生长至 34 叶期，分别于抗性、敏感种群中随机选择 10 个单株，每株剪取约 50 mg 幼嫩叶片组织，采用 Nuclean Plant Genomic DNA Kit 提取其基因组DNA（genomic DNA，gDNA），具体操作步骤参照试剂盒说明书进行，最终样品保存于-20 冰箱备用。稗草 ALS 具有 3 个拷贝（ALS1、ALS2、ALS3），参照IWAKAMI等32报道的3对引物分别扩增每个拷贝全长序列，所得序列均包含目前已报道的 8 个 ALS 突变位点，各引物均由南京擎科生物科技有限公司进行合成。ALS 序列扩增和比对：以不同种群稗草单株gDNA 为模板，采用 LA Taq DNA Polymerase with GC Buffer 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：LA Taq 0.5 L、2GC Buffer I 25 L、dNTP Mixture 8 L，Forward Primer 1 L、Reverse Primer 1 L、gDNA 2 L、ddH2O 12.5 L。参照试剂盒说明书设置 PCR 循环条件，其中退火温度为 59，待反应结束后，于 1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，切取目标条带并采用 DNA 凝胶回收试剂盒进行回收，送至南京擎科生物科技有限公司测序。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）ALS（GenBank登录号：AJ310767）氨基酸序列全长为基准，使用DNAMAN v6.0（Lynnon Biosoft，Montreal，QC，Canada）软件对不同稗草种群ALS测序结果进行比对。1.3.3 稗草ALS相对表达差异分析 RNA 提取和cDNA 合成：稗草种子萌发和生长条件同 1.3.1。待抗性、敏感稗草植株生长至 34 叶期，同时以田间推荐剂量（30 g a.i.hm-2）喷施五氟磺草胺。施药前 0 h 和施药后 12、24、48 h 分别剪取各植株幼嫩叶片组织，采用 Quick RNA Isolation RNA Kit 提取其 RNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳测定 RNA 质量，采用 Nanodrop 2000 型分光光度计测定 RNA 浓度，保存于-80 冰箱 备 用。使 用 HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit 合成互补 DNA（complementary DNA，cDNA），用于 ALS 相对表达量分析。ALS 及内参基因引物参照 FANG 等29的报道，由南京擎科生物科技有限公司进行合成。14 期 张丽雅等：稻田稗草对五氟磺草胺的抗性机制及其防治药剂筛选 2717 ALS 相对表达量测定：以五氟磺草胺处理前后不同时间点的稗草叶片 cDNA 为模板，采用 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 进行实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析，具体PCR 体系和循环条件均参照试剂盒说明书进行。以稗草-actin 作为内参基因对 ALS 表达进行归一化，采用2-CT法计算 ALS 在不同时间点的相对表达量。在本研究中，每个时间点样品包含 6 个生物学重复（1 株/重复），各生物学重复同时包括 3 个技术重复。采用SPSS v.26.0（IBM，Armonk，NY，USA）软件一般线性模型对试验数据进行 ANOVA 分析，当 fold change2 且 P0.05 时判定为具有显著差异。1.3.4 稗草抗性种群交互抗性和多抗性模式测定 稗草种子萌发和生长条件同 1.3.1。待抗性、敏感稗草植株生长至 34 叶期，采用温室盆栽法在整株水平上分别测定其对 3 种 ALS 抑制剂、3 种乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）抑制剂、1 种4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）抑制剂、1 种合成生长素类除草剂（synthetic auxin mimic）的抗性水平（表 1）。采用各除草剂大田推荐剂量初筛进行预试验（结果未展示），以明确其具体施用剂量（表 1）。茎叶喷雾处理方式和结果调查方法均同 1.3.1。每个处理至少重复3 次，整个试验重复 2 次。1.3.5 数据处理 针对所有整株剂量响应试验，以清 水处理为空白对照，将各处理鲜重数据表示为空白对照相对鲜重（%）。使用 SPSS v.26.0（IBM，Armonk，NY，USA）对重复试验间相同处理下的数据进行ANOVA 分析，由于两组数据间无显著差异（P0.05），采用 SigmaPlot v.12.3（Systat Software，Chicago，IL，USA）按照公式 y=C+(D-C)/1+(x/GR50)b对合并后的数据进行四参数双逻辑非线性回归分析，计算抑制 50%植物生长所需除草剂剂量（GR50）。式中，x 为特定除草剂用量，y 为 x 处理下杂草相对鲜重，C为响应下限，D 为响应上限，b 为 GR50处曲线斜率。以敏感稗草种群 AHFY-01 为对照，计算抗性稗草种群 AHTC-01 对不同除草剂的抗性倍数（resistance index，RI）：RI=抗性种群 GR50/敏感种群 GR50。根据以下标准对种群的抗药性水平进行分级：RI10，高抗；5RI10，中抗；2RI5，低抗；RI2，敏感33。2 结果 2.1 不同稗草种群对五氟磺草胺的抗性水平 五氟磺草胺田间推荐剂量（30 g a.i.hm-2）处理后，疑似抗性稗草种群AHTC-01各植株仍然存活，其GR50为 155.00 g a.i.hm-2；敏感稗草种群 AHFY-01 各植株均枯萎死亡，其 GR50为 0.25 g a.i.hm-2。相比AHFY-01，AHTC-01 稗草种群已对五氟磺草胺产生高水平抗性，抗性倍数为 620（表 2）。表 2 不同稗草种群对五氟磺草胺的抗性水平 Table 2 Resistance level of different E.crus-galli populations to penoxsulam 整株剂量响应曲线参数整株剂量响应曲线参数 Parameters for whole-plant dose-response curves 种群种群 Population C D b R2 GR50(g a.i.hm-2)抗性倍数抗性倍数 Resistance index AHTC-01 26.90(9.20)93.25(16.53)5.72(6.23)0.91 155.00(53.80)620 AHFY-01 32.89(3.82)102.17(7.65)1.89(0.67)0.99 0.25(0.06)-2.2 稗草抗性和敏感种群ALS基因序列差异 序列比对结果显示，AHFY-01 种群各单株 ALS1、ALS2、ALS3 均未发生氨基酸突变，而 AHTC-01 种群各单株 ALS2 第 574 位氨基酸密码子均由色氨酸（TGG）突变为亮氨酸（TTG）（图 1），其余位点均未发生突变（表 3），种群单株抗性突变频率为100%。2.3 稗草抗性和敏感种群ALS表达差异 以五氟磺草胺田间推荐剂量（30 g a.i.hm-2）分别 对稗草种群 AHTC-01 和 AHFY-01 进行茎叶处理，通过 RT-qPCR 分析 ALS 相对表达量。结果表明在五氟磺草胺处理前（0 h）和处理后 12、24、48 h，相对于敏感稗草种群 AHFY-01，抗性稗草种群 AHTC-01 ALS在各时间点的相对表达倍数分别为 0.24、2.26、0.71、0.87（图 2）。AHTC-01 稗草种群在药剂处理后 12 h时 ALS 相对表达量为敏感种群 AHFY-01 的 2.26 倍，说明靶标基因过量表达可能是其对五氟磺草胺产生抗性的分子机制之一。2718 中 国 农 业 科 学 56 卷 图 1 稗草敏感（AHFY-01，左）和抗性（AHTC-01，右）种群靶标基因ALS2的 Trp574 位密码子 Fig.1 Trp574 codons of susceptible(AHFY-01,left)and resistant(AHTC-01,right)populations of E.crus-galli ALS2 表 3 稗草敏感和抗性种群ALS2序列比对 Table 3 Alignment of ALS2 copies cloned from the susceptible and resistant populations of E.crus-galli 各氨基酸的位置和碱基及相应氨基酸序列各氨基酸的位置和碱基及相应氨基酸序列 The amino acid position,relative sequence of nucleotide and derived amino acid 物种物种/种群种群 Species/Population 122 197 205 376 377 574 653 654 GCA CCT GCT GAT CGT TGG AGT GGT 拟南芥 A.thaliana Ala Pro Ala Asp Arg Trp Ser Gly GCC CCC GCC GAT CGT TGG AGC GGT AHFY-01 Ala Pro Ala Asp Arg Trp Ser Gly GCC CCC GCC GAT CGT TTG AGC GGT AHTC-01 Ala Pro Ala Asp Arg Leu Ser Gly 粗体表示 ALS 已知可以发生抗性氨基酸的突变位点；下划线表示该种群在该位点发生氨基酸替换 All known mutation sites in ALS are shown in bold;amino acid substitutions in specific sites are underlined 处理时间点 Time after treatment(h)0122448bbba00.51.01.52.02.5 图 2 稗草抗性种群ALS在五氟磺草胺处理前后相对于敏感种群的表达倍数 Fig.2 Relative expression ratio of ALS in the resistant relative to susceptible population of E.crus-galli before and after penoxsulam treatment 2.4 稗草抗性种群对其他除草剂的敏感性 整株剂量响应试验表明，稗草种群 AHFY-01对所测试的 8 种除草剂同样较为敏感，其植株在各药剂田间剂量处理下均枯萎死亡（图 3）。相比之下，抗五氟磺草胺稗草种群 AHTC-01 对其他 3 种ALS 抑制剂产生交互抗性，其中对双草醚产生中等水平抗性，抗性倍数为 8.24；对嘧啶肟草醚、甲氧咪草烟均产生高水平抗性，抗性倍数分别为 13.36、20.36（表 4）。同时选用其他 3 种作用机制的 5 种除草剂对抗性稗草种群 AHTC-01 进行多抗性模式测定，结果表明 AHTC-01 稗草种群对 ACCase 抑制剂氰氟草酯、精噁唑禾草灵、烯草酮，HPPD 抑制剂三唑磺草酮，以及合成生长素类除草剂氯氟吡啶酯均较为敏感（图 3），其抗性倍数均低于 2.00（表 4）。14 期 张丽雅等：稻田稗草对五氟磺草胺的抗性机制及其防治药剂筛选 2719 五氟磺草胺Penoxsulam(g a.i.hm-2)双草醚Bispyribac sodium(g a.i.hm-2)嘧啶肟草醚Pyribenzoxim(g a.i.hm-2)相对鲜重Relative fresh weight(%)10204060801001201AHTC-01RAHFY-01S1010010000.10.0102040608010012010100100002040608010010100100002040608010002040608010002040608010010100100011010011010010000.10.01甲氧咪草烟Imazamox(g a.i.hm-2)氰氟草酯Cyhalofop-butyl(g a.i.hm-2)精噁唑禾草灵Fenoxaprop-P-ethyl(g a.i.hm-2)1101000.10.010204060801001201101000.10.010204060801001100.1020406080100烯草酮Clethodim(g a.i.hm-2)三唑磺草酮Tripyrasu