稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展.pdf

植物保2 0 2 3,49(5):32 -42庆祝植物保护创利6 0 周年专辑病害篇Plant Protection稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展王如意，刘杰，冯琴1，张熠场，肖宁，吴俊4，郑文静5，李爱宏”，宁约瑟1*（1.中国农业科学院植物保护研究所，北京10 0 193；2.全国农业技术推广服务中心，北京10 0 12 5；3.江苏里下河地区农业科学研究所，扬州2 2 50 0 9；4.湖南农业大学农学院，长沙410 12 8；5.辽宁省水稻研究所，沈阳110 10 1)摘要由稻瘟菌侵染引起的稻瘟病是威胁水稻安全生产最严重的真菌病害之一。鉴定克隆水稻抗稻瘟病基因，系统深入研究稻瘟菌与水稻的相互作用，揭示水稻的抗病机制，进而创制推广抗稻瘟病新材料，对确保粮食安全具有重要意义。本文总结了近10 年来稻瘟病抗病基因和感病基因的鉴定、分子机理解析和应用等进展，总结归纳了抗病基因聚合、分子设计育种、感病基因编辑、抗病基因的病原诱导表达等抗病育种主要策略。最后提出充分利用种质资源，利用新技术挖掘新基因及创制新材料，深入研究叶瘟和穗瘟抗病机制差异等是稻瘟病抗病育种下一步重点研究方向和新挑战。关键词水稻；稻瘟病；抗病基因；感病基因；育种策略中图分类号：S435.111.41Deciphering the molecular mechanism of rice blast resistance andresearch progress of resistance breeding strategyWANG Ruyil，LIU Ji e ，FENG Q i n ，ZH A NG Yi y a n g ，XIA O Ni n g，W U Ju n ,ZHENG Wenjing，LI A i h o n g，NING Yu e s e l*(1.Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China;2.NationalAgro-Tech Extension and Service Center,Beijing 100125,China;3.Institute of Agricultural Sciences inLixiahe Region in Jiangsu,Yangzhou 225009,China;4.College of Agronomy,Hunan AgriculturalUniversity,Changsha 410128,China;5.Liaoning Rice Research Institute,Shenyang 110101,China)Abstract Rice blast,caused by fungus Pyricularia oryzae,is one of the most serious fungal diseases,whichthreatens rice production.Cloning and identification of rice blast resistance genes,systematically and in-depthanalysis of the interaction between P.oryzae and rice could reveal the rice disease resistance mechanisms anddevelop numerous new rice germplasm.These efforts are effective and provide safeguard for food security.In thisarticle,we reviewed the identification of rice blast resistance and susceptibility genes to P.oryzae in the past 10years,and how the knowledge of the molecular mechanisms has been applied in rice breeding.In addition,wesummarized major strategies for breeding rice disease-resistant cultivars including disease resistance genepyramiding,molecular design breeding,editing of susceptibility genes and pathogen-induced expression of diseaseresistance genes.Lastly,we proposed directions and challenges in rice blast disease resistance breeding in thefuture:full utilization of germplasm resources,application of new technologies to mine new resistance genes andcreate new breeding materials;investigation of the molecular basis of leaf and neck blast resistance andconstruction of novel broad-spectrum disease-resistant materials.Key words rice;rice blast;resistance gene;susceptibility gene;breeding strategy文献标识码：ADOl:10.16688/j.zwbh.2023374收稿日期：2023-07-22基金项目：国家息然科学基金国际（地区）合作与交流项目（32 16 11430 0 9）：国家重点研发计划青年科学家项目（2 0 2 2 YFD1401400）；国家自然科学基金区域创新发展联合基金（U20A2021）；中国农业科学院科技创新工程（CAASCSCB-202301)*通信作者E-mail:修订日期：2 0 2 3-0 8-1749卷第5期1近10 年稻瘟病病害发生危害情况的统计稻瘟病是由Pyriculariaoryzae侵染引起的对水稻安全生产影响最严重的世界性稻作病害，已经在超过8 5个国家发生。全世界每年因稻瘟病造成的损失足以养活6 0 0 0 万人口1。由于其在生产上的严重危害性和在科学研究上的重要性，2 0 10 年稻瘟病被Science杂志列为食品安全“最严重的生物威胁”之一2 。2 0 12 年稻瘟病菌被国际分子植物病理学界列为“十大植物病原真菌之首 3。稻瘟病在我国不同水稻种植区及水稻不同生王如意等：稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展33育期的不同组织部位均有发生（图1)，严重影响了水稻的产量和品质。据全国农业技术推广服务中心数据显示，2 0 12 年一2 0 2 1年我国稻瘟病年均发生面积38 1.5万hm次（图2 a），年均实际损失36.8万t（图2 b），其中2 0 14、2 0 15年连续两年发生面积超过50 0 万hm次，造成年实际稻谷损失超过 50 万 t(图 2)。我国稻作区自然生态环境、水稻种植类型与栽培制度复杂多样，稻瘟病的发生具有明显的区域性差异。例如，随着优质食味梗稻的推广，江苏省稻瘟病发生风险也逐步加大，2 0 14年稻瘟病在江苏省偏ab：湖南省益阳市釉稻叶瘟(a)和穗颈瘟(b)发病情况；cd:辽宁省东港市梗稻叶瘟(c)和穗颈瘟(d)发病情况。a-b:Incidence of rice leaf blast(a)and rice neck blast(b)on an indica rice cultivar in Yiyang,Hunan province;c-d:Incidence of rice leaf blast(c)andrice neck blast(d)on a japonica rice cultivar in Donggang,Liaoning province.图1稻瘟病发病情况Fig.1 Incidence of rice blast346005004003002001000庆祝植物保护创利6 0 周年专辑605040302010120-2102病害篇02023年份Year图2 2 0 12 年一2 0 2 1年我国稻瘟病发生面积(a)及引起的实际损失(b)Fig.2 The occurrence area(a)of rice blast and caused actual losses(b)in China from 2012 to 2021重发生，发生面积达到10 0 万hm，占水稻播种面积的43%,严重影响了水稻高产稳产4。华南双季稻稻作区以稻为主，该区稻瘟菌病原小种分化复杂，稻瘟病发生具有点多面广、地域间发生分布不平衡等特点。据全国农业技术推广服务中心统计，2 0 15年一2 0 2 1年，广东省稻瘟病年发生面积约2 6.7 万hm，平均年损失稻谷约为2.5万t。多年来，“预防为主，综合防治”的植物保护工作方针为我国病虫害的防控指明了方向，为粮食安全生产提供了重要保障5。在稻瘟病防治措施中，培育和推广稻瘟病抗性品种被认为是防控稻瘟病最为经济、有效和环保的策略6 。因此，在国家和有关省农作物新品种审定中，稻瘟病抗性一直被作为水稻新品种审定的重要指标，实行抗性不达标一票否决制度7。为控制稻瘟病的发生，广东省大力推广以广谱抗稻瘟病材料BL122（含稻瘟病抗病基因Pil和Pi2)为父本的粤恢9 8 0 2 等高抗稻瘟病杂交稻新品种。2 0 13年一2 0 2 1年，粤恢98 0 2 在广东稻瘟病发病区累计推广33万hm。东北早熟单季稻稻作区是我国梗稻的主产区之一，2 0 18 年以来，黑龙江省每年对当地主栽品种进行接种测定，水稻品种整体抗病性有较大提升。全球气候变化以及种植制度的变革加剧了稻瘟菌种群的变化，稻瘟病防控形势依然严峻。2 0 2 0 年和2 0 2 3年农业农村部先后两次将稻瘟病列入一类农作物病虫害名录。因此，一方面确定水稻品种抗瘟性及发病风险，结合田间生产实际，优先种植在当地发病风险低的水稻品种,降低稻瘟病大面积暴发风险。另一方面,加强对稻瘟病常发区主栽品种的调整，避免单一抗病品种大面积种植，避免因抗病品种的垂直抗性丧失而造年份aYear成巨大损失。为了应对稻瘟菌种群变化对水稻生产带来的危害，系统深入地研究稻瘟菌与水稻的相互作用，揭示水稻的抗病分子机制，改良水稻品种的稻瘟病抗性,加强对稻瘟病的综合防控,对确保我国粮食安全具有举足轻重的作用。2水稻稻瘟病抗病机制研究进展2.1禾稻瘟病抗病基因汇总截至目前,已经有30 多个稻瘟病抗病基因（re-sistance genes,R)被相继鉴定和克隆。其中，大多数稻瘟病抗病基因,如Pita、Pi2、Pi9、Piz-t、Piz h、Pi5、Pi 50、Pi k、Pi l、Pi k m、Pi 54（Pi k h）、Pi k p、Pid3、Pi2 5、Pid 4、Pid 3-A 4、Pi36、Pi37、Pi56（t)、Pi63、Pia、Pib、Pi-C O 39、Pis h、Pi35、Pit、Pb l、Pi6 4和Pigm等编码核苷酸结合和富亮氨酸重复结构域受体(nucleotide-binding and leucine-rich repeat re-ceptor,NLR)蛋白8 。还有一些非 NLR类抗病基因编码蛋白激酶，如Pid2、Pi6 8（t）和Pi65分别编码含有B-lectin 结构域的类受体激酶、含有Malec-tin结构域的类受体激酶和含有多个LRR（le u c in e-rich repeat)结构域的类受体类激酶9-11。此外,Ptr编码一个包含4个Armadillo重复的蛋白12 。抗病基因的鉴定和克隆为抗病材料的创制和利用奠定了基础。2.2稻瘟菌AVR蛋白与水稻NLR蛋白的识别水稻R基因和稻瘟菌无毒基因（avirulencegenes,AVR)的识别遵循“基因对基因”假说。水稻抗稻瘟病 R 基因与稻瘟菌中 AVR 基因相对应,目前已报道的AVR/R基因对主要有：Aur-Pita/Pita、Aur-Pik/Pik、A u r Piz t/Piz t、A u r-Pia/Pia、A v r l-20122021b49卷第5期CO39/Pi-CO39、A v r Pi 54/Pi 54、A u r Pi 9/Pi g E8 、AurPib/Pib13和Aur-Pi/Pil14。研究发现，水稻R蛋白Pi-ta 的LRR结构域能够直接和稻瘟菌的AVR蛋白Avr-Pita 相互作用，诱导植物的局部细胞死亡，阻止稻瘟菌进一步扩散15，这是水稻和稻瘟菌互作系统中首次证明R蛋白和相应的AVR蛋白直接相互作用。随后发现AVR蛋白AvrPi54与R蛋白Pi54能够在水稻原生质膜上直接互作激发特异性抗病反应16 。近来研究表明，植物中 NLR蛋白也以成对的形式发挥作用,称为 Senser NLR和 Helper NLR。Se n s e r NLR整合了特殊的结构域来识别病原菌AVR蛋白，而HelperNLR负责起始下游免疫信号。如Pikp由SenserNLR蛋白Pikp-1和Helper NLR蛋白Pikp-2组成，Pikp-1含有HMA结构域（heavy-metal-associated domain）,能够与Avr-PikD直接相互作用；Pikp-1和Pikp-2协同行使功能对含有Aur-PikD的稻瘟菌小种产生免疫反应17。HMA 结构域氨基酸序列的差异决定了水稻对AVR蛋白的特异性抗性。因此,水稻R 基因Pik的多个等位基因（Pikm、Pik s、Pik p 和Pikh）分别对含有相应Aur-Pik 的稻瘟菌小种表现特异抗性18 。类似地，水稻抗病蛋白 Pia 由Senser NLR蛋白RGA5和Helper NLR蛋白RGA4组成,对携带Aur-Pia或Aurl-CO39的稻瘟菌表现特异的抗性19。RGA5能够抑制RGA4的激活，Avr-Pia和Avrl-CO39与RGA5的HMA结构域特异性结合，解除RGA5对RGA4的抑制作用从而激发免疫反应2 0 1。大多数水稻R蛋白与对应的稻瘟菌 AVR蛋白不直接相互作用，这些R蛋白在水稻中的关键互作因子介导了R蛋白对AVR蛋白的识别。如NLR蛋白 Pii 和相对应的 Avr-Pii 均与水稻胞吐作用相关蛋白OsExo70-F2和OsExo70-F3相互作用，而OsExo70-F2和OsExo70-F3是R基因Pii介导抗性的必需因子2 1。近来发现NLR蛋白 Pib和相应的AvrPib与水稻 SH3结构域的蛋白质 SH3P2相互作用，在正常情况下SH3P2抑制Pib的激活，稻瘟菌侵染时AvrPib与SH3P2互作抑制SH3P2-Pib复合物的形成从而激活Pib22。此外，研究发现，转录因子WRKY45和RAI1分别特异地与NLR蛋白Pb1或PID3 相互作用,是 NLR蛋白抗病途径中的必需因子2 3-2 4。稻瘟菌AVR基因与水稻R 基因的王如意等：稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展35互作机制研究为拓展R基因的抗谱提供了关键理论基础。2.3广谱NLR抗病蛋白信号通路水稻NLR蛋白Piz-t、Pi9 和Pigm等对多个稻瘟菌小种具有抗性，表现出广谱抗性特征，受到广泛关注和深人研究。Piz-t特异性识别稻瘟菌AvrPiz-t蛋白并通过多种信号通路激发水稻的免疫反应。AvrPiz-t能够抑制水稻bZIP类型转录因子APIP5转录活性和蛋白积累，促进效应蛋白激发的细胞坏死，而Piz-t通过靶向APIP5，阻止APIP5介导的细胞坏死2 5。AvrPiz-t 可以抑制 E3 泛素连接酶APIP10的体外泛素化活性抑制水稻的基础防卫反应,APIP10与维管植物单锌指转录因子OsVOZ1与OsVOZ2相互作用促进其通过2 6 S蛋白酶体途径降解，抑制OsVOZ1/OsVOZ2的表达会削弱Piz-t蛋白积累和对非亲和小种的抗病性2 6 ，说明APIP10通过OsVOZ1/OsVOZ2调控Piz-t介导的免疫反应。此外,抗病蛋白 Piz-t 促进水稻胰蛋白酶抑制剂APIP4蛋白积累,增强其活性从而增强免疫2 7 ，因此OsVOZ1/OsVOZ2作用于R蛋白Piz-t上游，正调控Piz-t蛋白积累，激活的Piz-t进一步通过其下游蛋白APIP5和APIP4调控稻瘟病抗性。R蛋白 Pi9能够特异性识别稻瘟菌AvrPi9蛋白，近来发现AvrPi9与含有类泛素结构域的蛋白ANIP1互作并维持其稳定性，而ANIP1促进稻瘟菌抗性正调控因子OsWRKY62的降解，减弱寄主免疫反应。虽然Pi9也能够稳定ANIP1，但Avr-Pi9可以促进ANIP1和Pi9的解离从而激活Pi928。目前R基因Pigm相应的稻瘟菌无毒基因还没有报道，研究发现PigmR能够促进具有RRM结构域的转录因子PIBP1在细胞核中积累,PIBP1与细胞壁相关激酶基因OsWAK14 和苯丙氨酶基因OsPAL1的启动子直接结合并促进它们的表达，增强水稻对稻瘟病的抗性2 9。此外,PigmR能够稳定去泛素化酶PICI1,PICI1使甲硫氨酸合成酶OsMETS1去泛素化并维持其结构稳定，促进乙烯的生物合成从而激活免疫30 。因此，广谱NLR抗病蛋白一方面通过APIP5、O s V O Z1/O s V O Z2、O s-WRKY62和PIBP1等转录因子促进下游抗病相关基因的表达；另一方面，泛素化/去泛素化修饰酶APIP10、A NI P1 和PICI1参与了抗病信号的调控。下游抗病信号通过代谢防御途径的关键酶，比如36PAL参与的苯丙氨酸代谢和OsMETS1 参与的乙烯代谢途径参与了广谱NLR抗病基因介导的抗病信号通路。3水稻感病基因/负调控因子研究进展感病基因（susceptibility gene，S)是指植物中有利于病原菌侵染的基因，是病原菌成功侵染寄主必需的关键因子8 。在稻瘟病抗病性研究过程中，发现一些感病基因/抗病负调控因子的功能缺失突变表现广谱抗病性(图3)。虽然这些S基因编码的蛋白没有保守性，但是一些感病基因介导的信号转导存在类似性。比如,Bsr-d1 编码 C2H2 类转录因子,Bsr-dl蛋白促进下游过氧化物酶基因的转录导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的消除，使水稻感病。而bsr-d1 突变体导致活性氧增加,表现出对稻瘟病广谱抗病性31（图3）。ROD1基因编码包含C2结构域的钙感应蛋白，能促进CatB介导的庆祝植物保护创利6 0 周年专辑Pyriculariaoryzae病害篇过氧化氢酶活性，抑制活性氧的积累导致感病。而ROD1缺失突变体表现出对稻瘟病的广谱抗性32 1（图3）。说明Bsr-dl和ROD1都通过调控ROS的产生介导抗病性。Bsrk1 编码 TPR(tetratricopep-tide repeats)类型蛋白,能够与苯丙氨酸代谢限速酶基因 OsPAL（O s PA L1O s PA L7)的 mRNA结合促进其降解，导致木质素合成减少进而削弱免疫反应。而Bsr-k1功能丧失突变体中木质素合成增多，赋予水稻对稻瘟病菌的广谱抗性L33（图3)。RLK类型激酶（receptor-likekinases)BDR1能够磷酸化MPK3,抑制稻瘟菌诱导的茉莉酸（jasmonic acid,JA)信号和枯类生物合成基因TPS3和TPS29的表达,负调控稻瘟抗性。BDR1功能缺失突变体抑制JA信号和类代谢物途径,增强稻瘟病抗性34(图3）。表明Bsr-k1和BDR1都通过参与抗病代谢物合成介导抗病性。近来发现稻瘟菌侵染水稻时，水稻磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸被招募到侵染菌丝周围2023PABsr-d1ROD1BDR1Bsr-k1RBL1Bsr-dDrPeroxidaseCatBMPK3Bsr-k1A)nCDP-DAGOsPALmRNA过氧化物酶H,O,清除PeroxidaseH,O,scavengingJA生物合成Biosynthesis ofJATerpenoid枯烯木质素LigninPI(4,5)P2水稻稻瘟病抗性RiceblastresistanceBsr-d1能够促进下游过氧化物酶基因的转录导致活性氧的清除负调控水稻抗病。ROD1蛋白能促进CatB的酶活性,抑制活性氧的积累导致感病。激酶BDR1能够磷酸化MPK3,抑制稻瘟菌诱导的茉莉酸(JA）信号和类生物合成基因的表达，负调控稻瘟病抗性。Bsr-k1与苯丙氨酸代谢限速酶基因OsPAL(OsPAL1OsPAL7）的mRNA结合促进其降解，导致木质素合成减少进而削弱免疫反应。水稻感病基因RBL1参与磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的生物合成促进稻瘟菌的侵染。P.oryzae induces the expression of Bsr-dl in blast-susceptible rice cultivars.The Bsr-dl protein is recruited to the promoters of peroxidases to promoteH,O,scavenging and,eventually,benefic to pathogen infection.The Ca*-sensor,resistance of rice to diseases 1(ROD1),which interacts with thecatalase protein CatB and promotes CatB activity to catalyze H,O,scavenging to suppress immunity.BDRI phosphorylates MPK3,which suppressesblast-elicited JA signaling and terpenoid biosynthesis.Bsr-k1 can bind to and promote the mRNA turnover of OsPAL(OsPAL1-OsPAL7),the decreasedOsPAL transcripts cause reduced lignin biosynthesis and resistance.RBL1 is important for the biosynthesis of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphatePI(4,5)P2,which contributes to pathogen infection.图3水稻感病基因介导的稻瘟病抗性分子机制Fig.3 Molecular mechanism of rice blast resistance mediated by rice susceptibility genes49卷第5期促进其侵染。水稻感病基因RBL1编码胞嘧啶二脂酰甘油合成酶（CDP-DAG合成酶），参与磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的生物合成。rbl1突变体中细胞膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸含量显著减少,抑制了稻瘟菌的侵染351（图3）。感病基因的鉴定及其信号转导的解析为水稻抗病育种提供了新的切入点。4其他抗病相关基因4.1其他稻瘟病正调控因子除了稻瘟病抗病基因和感病基因,研究发现一些参与水稻生长发育调控的调控因子兼具广谱抗病性。IPA1是调控水稻理想株型的关键基因，近来发现稻瘟菌能够诱导IPA1磷酸化，促进IPA1与抗病正调控因子WRKY45启动子的结合，促进其表达,增强水稻对稻瘟菌的广谱抗病性36 。水稻捕光复合体亚基LHCB5的高表达促进LHCB5的磷酸化水平,磷酸化的LHCB5增加了叶绿体中ROS的累积和对稻瘟病菌多个小种的广谱抗性37。水稻中蛋白酶体成熟因子UMP1编码基因的一个天然等位基因UMP1R2115，增加了蛋白酶体的丰度和活性，促进过氧化物酶和过氧化氢酶的降解，导致ROS 积累,赋予水稻对稻瘟病菌等的广谱抗性38。与抗病基因相比，尽管这些基因表现出不完全抗性，但这些基因介导的抗病性不依赖稻瘟菌AVR基因的限制具有重要的潜在应用价值。4.2microRNA介导的稻瘟病抗性microRNAs（m iRNA s）是一类调控转录后基因表达水平的非编码 RNA391。mi RNA s 与AGROUNATE（A G O)蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体，该复合体的miRNA与靶基因序列碱基互补配对,通过切割mRNA、促进DNA甲基化或阻遏翻译等方式来抑制下游基因表达39-42 ,研究表明多个“miRNA-靶基因”参与调节植物生长发育和抗逆等生物学过程43。其中miR398b靶向4个超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SO D）基因OsCSD1、O s C SD 2、O s C C SD 和 OsSODX。在水稻中过表达miR398b或敲除靶基因OsCSD1、OsCSD2和OsSODX能够增强 SOD活性，增加H,O2的累积，提高水稻对稻瘟病的抗性4。miR160a靶向5个生长素响应因子（auxinresponsefactor，A RF）编码基因 OsARF8、O s A RF10、O s-ARF13、O s A RF18 和OsARF22。在水稻中超表达王如意等：稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展抗病基因的聚合虽然抗病基因具有垂直抗性，但是抗病蛋白仅能识别包含有相应无毒效应因子的病原小种，限制了单个抗病基因抗病品种的大面积推广。采用多个抗病基因的聚合有助于培育广谱稻瘟病抗性品种。例如：以0 7 GY31水稻材料为基础，将抗病基因Pi9和Piz-t分别与抗病基因Pi54进行聚合，创制了叶瘟和穗瘟抗性均显著提高的新材料49；类似地，以YD6号 水稻材料为基础，将Pi不同等位基因（Pigm、Pi40、Pi9、Pi2 和 Piz）和Pil、Pi33以及Pi54分别进行聚合，发现Pigm/Pil、Pig m/Pi54和Pigm/Pi33组合表现广谱抗性，且对其他农艺性状没有明显影响50 。另外，Pita和Pi3/Pi5/Pii聚合，以及Pita和Pia聚合也能产生较强37miR160a或敲除OsARF8、O s A RF18 或OsARF22增强对稻瘟病的抗性45。此外,研究发现miRNA及其靶基因也能够负调节稻瘟病抗性。miR319b靶向 JA信号通路关键基因OsTCP21。过表达miR319b抑制JA合成通路多个基因表达，促进稻瘟菌的侵染；而过表达OsTCP21增强了JA合成通路中这些基因的表达,抑制了稻瘟菌的侵染46 。miR1871 靶向一个定位于细胞壁的基因OsMFAP1。过表达 miR1871或敲除OsMFAP1削弱水稻的基础免疫反应，而抑制miR1871的功能或过表达OsMFAP1不仅提高了水稻对稻瘟菌的抗性，还显著提高了水稻的产量，暗示miR1871可能是一个具有抗病育种应用价值的潜在感病基因47 。此外,miR168 能够靶向并抑制OsAGO1 的表达，负调控多个miRNAs的积累。通过负调控miR1320的表达能增强稻瘟病抗性,通过负调控miR535和miR164的表达能增加水稻穗数并延长抽穗时间，最终提高产量。抑制miR168的表达能同时提高稻瘟抗性和水稻产量48 。这些研究表明,microRNA作为一种非蛋白的抗病相关基因广泛参与水稻对稻瘟病抗性的调控,在水稻抗病育种中具有应用潜力。5水稻稻瘟病抗病育种策略稻瘟病抗病基因、感病基因以及其他抗病相关基因的挖掘、克隆与应用，大幅提升了生产上水稻主推品种的稻瘟病抗性。然而，随着全球气候变化和水稻种植制度的变革，新品种需要进一步拓展抗病谱和广泛适应性，以应对变化的新环境。5.1#38庆祝植物保护创利6 0 周年专辑病害篇一2023的穗瘟抗性51。然而，虽然聚合Pib、Pi 2 5和Pi54能够显著提高稻瘟病抗性，但同时严重影响产量52 。因此,抗病基因聚合的应用价值还需评价其综合农艺性状表现。通过选用优良骨干亲本作为共同遗传背景，构建不同单基因的精确渗人系，在此基础上再进行聚合，是解决这一技术瓶颈的有效手段。5.2分子设计育种随着水稻全基因组测序的完成，功能基因组学以及生物信息学的发展，分子设计育种成为引领水稻遗传改良的关键技术。该技术在明确全基因组序列的基础上，优化选择最佳亲本基因组组合，通过杂交和分子标记选择等技术，聚合大量优异基因，从而培育高产、优质、高抗和广泛适用性的优良新品种。分子设计育种能够实现从经验育种到定向高效的精确育种转变，大幅提高育种效率。Wei等根据报道的2 2 5个水稻QTL基因信息,结合等位变异的序列信息，将关键功能变异位点对应到水稻基因组位置上，获得包含348 个变异位点和56 2 个等位基因的图谱，通过收集来自2 6 个国家的40 4份种质材料，获得了覆盖大部分等位基因（9 5.5%）的水稻材料53,为水稻遗传改良提供了丰富的供体资源。研究者从40 4份材料中发现7 份材料中包含抗病基因Pi9,而Pi9 位点的单碱基等位基因导致强的稻瘟病抗性，因此，含有这些等位基因的材料可作为育种应用的重要供体53。另一方面，高产、优质和抗病多性状聚合是分子设计育种呕待解决的关键科学问题。通过对江苏、浙江、山东等地大面积推广应用的200余份梗稻品种进行重测序和全基因组分析，及关键性状基因定位，发现控制千粒重和每穗粒数等关键性状基因的强化选择是促进该区域梗稻品种产量提高的重要遗传基础。与此同时，发现选育的高产水稻品种稻米的直链淀粉含量呈现显著下降，稻瘟病抗性水平表现降低的趋势，表明稻米品质和抗稻瘟病性状存在显著的负相关。通过全基因组连锁图谱的构建，发现6 号染色体Pi基因座感病等位基因连锁是制约品种产量品质抗病平衡的关键因素。以此为基础，利用基因组设计育种策略，通过选择核心亲本和打破关键基因累赘连锁，利用抗病基因Piz-t和Pigm分别创制了高产优质抗病新品系“XY99和 JXY154。5.3感病基因编辑水稻抗病基因赋予其对病原生理小种的垂直抗性，被育种家优先应用于水稻品种改良，但抗病基因的小种特异性使得其抗病谱较窄，限制了抗病品种的大面积推广。感病基因是寄主植物中协助病原菌成功侵染的关键因子，随着对稻瘟菌致病性的认知和基因编辑技术的发展，通过对感病基因的编辑可以阻止病原菌在寄主体内完成侵染循环，成为提高水稻抗病性的一种新策略。研究表明在日本晴中敲除感病基因 Pi21或Bsr-d1增强了水稻对稻瘟病的抗性,敲除感病基因Xa5 增强了水稻对白叶枯病的抗性,同时敲除Pi21、Bs r-d 1和Xa53个感病基因显著提高了水稻对稻瘟病和白叶枯病的广谱抗性，且敲除材料的株高和千粒重等农艺性状无明显变化55。在杂交水稻骨干不育系隆科6 38 S中同时敲除感病基因Bsr-d1、Pi 2 1和OsERF922显著增强了对稻瘟病的抗性56 。以上研究为稻瘟病育种提供了新的种质资源。因此，通过CRISPR-Cas9技术编辑水稻感病基因有望创制广谱抗病新材料，对水稻抗病分子育种和其他作物抗病性改良具有重要指导意义。5.4抗病基因的病原诱导表达病原菌侵染激活植株抗病基因及信号通路赋予植株抗病性,而抗病基因的组成型激活往往导致自我免疫，影响植物的生长发育。例如，拟南芥的抗病关键调控因子NPR1通过调控水杨酸信号增强抗病性。在小麦和水稻中异源表达NPR1分别显著提高对小麦纹枯病、水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性。但NPR1的组成型激活影响农作物的产量等性状，限制了其在生产上的应用。在水稻中,利用TBF1基因上游开放阅读框（uORF)在翻译水平上精准调控NPR1的表达，使得在没有病原菌侵染时,NPR1蛋白处于低表达水平；而当有病原菌侵染时,NPR1蛋白快速高表达，阻止病原菌的侵染。uORFTBFI-NPR1水稻材料对稻瘟病、白叶枯病和细菌性条斑病均有较好的抗性，并且不影响其他主要农艺性状57 。类似地,病原菌诱导的PR16启动子以及水稻乙醇脱氢酶5-UTR的翻译增强子共同驱动WRKY45的表达，显著增强水稻对稻瘟病的抗性58 。因此,病原诱导以及在翻译水平精准调控抗病基因的表达，能够显著提高作物对不同类型病原菌的广谱抗性，同时不影响其他农艺性状。该技术在农作物生产上具有潜在重要应用价值。49卷第5期5.5基于结构生物学的抗病蛋白改造NLR抗病蛋白的结构解析使抗病机制研究有了突破性进展，也为抗病蛋白的改造提供了重要参考。水稻中,稻瘟菌Avrl-CO39 蛋白能与水稻R蛋白RGA5的HMA结构域直接互作，参照Avrl-CO39与RGA5-HMA互作界面,基于 Avr-Pib与Avrl-CO39结构基础，科研人员对RGA5的HMA结构域进行改造，设计出能识别非对应无毒效应蛋白 Avr-Pib的新型抗病蛋白RGA5-HMA2,并证明含有RGA5-HMA2抗病蛋白的水稻对含有 Avr-Pib的稻瘟菌具有抗性59。类似地,Pikm-1整合了HMA结构域,研究发现该结构域的两个相邻的氨基酸的突变拓展了对其他Avr-Pik效应蛋白的识别6 0 。近来,研究者利用特异结合GFP的纳米抗体序列替换Pikm-l的HMA结构域获得Pikm-1-GFP,当Pikm-1-GFP和Pikm-2以及GFP共同在烟草中表达时能够产生类似于Pikm-1,Pikm-2和AvrPiKD共表达产生的过敏反应6 1,该技术的进一步优化完善有望在水稻中创制广谱抗病新材料。通过改变抗病蛋白特定结构域或关键氨基酸拓展抗病蛋白对效应蛋白的识别，有望有效扩展抗病基因的抗病谱。6挑战和展望6.1种质资源评价及优异等位基因发掘从丰富的水稻种质资源中挖掘抗稻瘟病基因是创新种质的有效途径。科学家从8 2 个国家收集了413份不同水稻种质，利用全基因组关联分析（ge-nome-wide association study,GWAS)鉴定种质资源库中的核心抗稻瘟病基因6 2 。用5个稻瘟菌小种对413份水稻种质资源进行抗病鉴定，利用GWAS技术鉴定到具有稻瘟病抗性功能的新基因LABR_6463。我国科学家开展了代表7 8 万份水稻种质资源95%遗传多样性的30 10 份亚洲栽培稻基因组研究，建立了核心种质的基因型和重要农业性状表型数据库，为开展水稻全基因组分子设计育种提供基因来源和遗传信息，为培育高产、优质和多抗水稻新品种奠定基础6 4。Shang等组装了具有基因型和表型变异代表性的2 51份亚洲栽培稻核心种质材料的基因组。利用泛基因组图谱通过整合 NLRs注释信息，构建了水稻泛NLRome,确定了泛NLRs家族基因的共线性，,为抗病基因功能和进化研究提供了重王如意等：稻瘟病抗性分子机制及抗病育种策略研究进展39要基础6 5。6.2禾利用抗性蛋白互作网络和信号通路挖掘新基因水稻蛋白质互作组能够为蛋白网络和功能研究提供宝贵信息。Wierbowski等将带条形码接头与核酸分子相连接，获得了覆盖2 30 0 个基因的水稻ORFeome,构建了由2 8 9 个蛋白质之间的32 2 对相互作用组成的高质量蛋白质-蛋白质互作组图谱6 。转录因子是调控水稻生长发育和环境适应性的关键分子,科学家构建了包括16 8 3个水稻转录因子的文库,覆盖水稻转录因子总量的7 0%左右6 7 ，为水稻转录因子互作组的研究奠定了关键基础。水稻基因组包含1515个E3泛素连接酶基因，近来研究者通过PCR扩增和大规模基因合成获得了149 9 个E3泛素连接酶的全长编码序列（覆盖E3泛素连接酶的9 8.9 4%）,并以此创制了均一化的水稻E3泛素连接酶酵母文库（U