基因工程载体构建.doc

黄酮醇合成酶基因原核表达载体的构建与
黄酮合成酶Ⅱ和黄酮醇合成酶真核表达载体的构建
黄酮类化合物是一类多酚类化合物，广泛存在于自然界，根据对中心C环的不同修饰，可以分为黄酮、异黄酮、黄烷酮、黄酮醇和花青素等主要酮醇类化合物广泛分布于多种植物中，研究表明，它们是与几种细胞内传导和细胞转化有关激酶的抑制剂，具有多种生物学活性。由于它们能有选择地阻断细胞内信号传导通路，因此黄酮类化合物被认为是资料癌症的潜在化合物。
黄酮是由黄酮合成酶催化黄烷酮形成的。在植物中，存在两种黄酮合成酶 ，即黄酮合成酶 I ( f l a v o n e s y n t h a s e I ，F S I ) 和黄酮合成 酶 I I( f l a v o n e s y n t h a s e I I ，F SI I ) 。F S I是可溶性的，存在有些伞形科植物中 ，它是 2 ．氧 代 戊 二 酸 依赖的酶 ；F S I I 存在于大多数植物中，属于细胞色素 P 4 5 0单氧化酶，催化反应依赖于 NADP H ，是催化生成黄酮的关键酶。 黄酮合成酶通过在黄烷酮 C一2、C ．3 之间引入双健形成黄酮 。
黄酮醇合成酶（FLS）作为黄酮类合成途径与儿茶素合成途径的桥梁，在植物中非常保守，它催化黄酮结构中的C3位羟基化，从而形成了各类黄酮醇类物质。
一、材料
T载体：pMD18-T_Vector
原核表达载体：pET-28a(+)
真核表达载体：pBⅠ121和pCAMBIA-1304
二、载体构建
1．洋桔梗FSⅡ基因cds序列的获得
洋桔梗FLS基因cds序列的获得
以洋桔梗的FLS为例
洋桔梗FLS基因的克隆
提取洋桔梗叶片RNA，并以之为模板在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。根据NCBI上公布的编码的FLS cDNA序列，根据设计合成一对特异引物，在其5’端引物的上游加入NcoⅠ酶切位点，在其3’端引物的上游加入NheⅠ酶切位点。以反转录的cDNA第一链为模板PCR扩增洋桔梗FLS基因。
引物F: 5'-gcccatggatggaggtgcaaagagtgca -3'（NcoⅠ）
引物R: 5'-gcgctagctcactgtggaagcttattga-3'（NheⅠ）

FLS
Nco
I
Nhe
I

2、PCR产物与T- Vector 连接：

pmd18-T
FLS
Nco I

Nhe I

用DNA连接酶进行连接，连接产物用Ca2+借介导法转化大肠杆菌感受态，并在含Amp的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确目的基因。
pET-28a(+)
Nco I

Nhe I

（3）目的片段与表达载体的双酶切及连接
pmd18-T
FLS
Nco I

Nhe I

NcoⅠ和NheⅠ双酶切
NcoⅠ和NheⅠ双酶切

T4 DNA连接酶连接

pET-F3'5'H
F3'5'H
Nhe I

Nco I

连接产物转化大肠杆菌，并在含Kan的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确表达载体。重组载体转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，并检测目的产物表达情况。
3．真核表达载体的构建
（1） FSⅡ和FLS基因的扩增并与T- Vector 连接（步骤同原核表达载体构建）

引物F: 5'-gcccatggatggaggtgcaaagagtgca -3'（XbaⅠ）
引物R: 5'-gcagatctctaagaaatgtaagcactt-3'（SacⅠ）
FSⅡ
XbaⅠ
SacⅠ

引物F: 5'-gcagatctatgtctccattgattgttgc-3'（BglⅡ）
引物R: 5'-gcggtnactcactgtggaagcttattga-3'（BstEⅡ）
FLS
BglⅡ
Bst EⅡ

PCR产物与T- Vector 连接：
pmd18-T
F3H
BglⅡ
Bst EⅡ
Ⅱ
I

pmd18-T
F3'5'H
XbaⅠ
SacⅠ
Ⅱ
I

（2）pBI121-F3'5'H表达框的构建

pmd18-T
FSⅡ
XbaⅠ
SacⅠ
Ⅱ
I

pBI121
gusA
NOS ter
CaMV 35S
Eco
RI
Hin
dIII
Xba
I
Sac
I

pBI121- F3'5'H
F3'5'H
NOS ter
CaMV 35S
Eco
RI
Hin
dIII
Xba
I
Sac
I
XbaⅠ和SacⅠ分别进行双酶切，获得FSⅡ基因和载体
T4 DNA连接酶连接

连接产物转化大肠杆菌，并在含Kan的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确的pBI121-FSⅡ表达框。
（3）pCAM-FSⅡ- FLS双元表达载体的构建
pCAMBIA-1304载体经BglⅡ和BstEⅡ双酶切后，与目的基因FLS连接，构成pCAM-FLS，再经HindⅢ和EcoRⅠ双酶与pBI121-FSⅡ表达框连接，构成pCAM-FSⅡ- FLS双元表达载体。

pmd18-T
FLS
BglⅡ
Bst EⅡ
Ⅱ
I

pCAMBIA-1304
gfp
gus
CaMV 35S
BglⅡ
HYG(R)
Eco
RI
Hin
dIII
Bst EⅡ

BglⅡ和BstEⅡ双酶切
T4 DNA连接酶连接

pCAMBIA- FLS
F3H

CaMV 35S
HYG(R)
BglⅡ
Bst EⅡ
Eco
RI
Hin
dIII

pBI121- FSⅡ
FSⅡ
NOS ter
CaMV 35S
Eco
RI
Hin
dIII
Xba
I
Sac
I

HindⅢ和EcoRⅠ双酶切
T4 DNA连接酶连接

pCAM- FSⅡ- FLS
FSⅡ
FLS
CaMV 35S
CaMV 35S
Xba l
NOS ter
Sca l
HYG(R)
BglⅡ
Bst EⅡ
Eco
RI
Hin
dIII

连接产物转化大肠杆菌，并在含卡那的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确的pCAM-FSⅡ- FLS双元表达载体。
（4）采取农杆菌叶盘法进行植物转化
将表达载体pCAM-FSⅡ- FLS转入根癌农杆菌。挑取经转化含有目的基因的单菌落。在含卡那和潮霉素的液体培养基中过夜培养。将植物叶片预培养3d，在材料切口刚开始膨大时即可进行侵染，浸染时间为10min。叶片与农杆菌共培养2～3d后，用无菌水冲洗叶片并在灭菌的滤纸上沾干，再放入分化培养基(含氨苄)中诱导分化出苗。化苗移至生根培养基中生根，形成完整植株。