比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用.doc

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李娟娟，等. 比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的
预防作用

李娟娟，王有为，马凤霞，杜文静，宋宝全，王 昕，冯 影，田健健，韩忠朝(中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020)
引用本文：李娟娟，王有为，马凤霞，杜文静，宋宝全，王昕，冯影，田健健，韩忠朝. 比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用[J].中国组织工程研究，2017，21(5):693-700.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.007 ORCID: 0000-0003-3254-5008(李娟娟)

文章快速阅读：
人脐带和胎盘间充质干细胞预防小鼠急性移植物抗宿主病的比较

检测指标：
移植后11 d，进行GVHD临床症状评分；移植后3周，进行生存时间分析；移植后2周，进行皮肤、肝脏及小肠病理组织学分析。
结果表明：
脐带和胎盘间充质干细胞均可预防小鼠急性GVHD，两者之间未见明显差异。
分组：
单纯照射组
同基因脊髓移植组
异基因骨髓移植组
急性GVHD组
脐带干细胞组
胎盘干细胞组

文题释义：
移植物抗宿主病：是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，显著增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。急性移植物抗宿主病的发生率为30%-45%，慢性者发生率低于急性。
间充质干细胞移植治疗移植物抗宿主病：间充质干细胞不仅抑制免疫细胞增殖，还可通过调节免疫细胞细胞因子的分泌谱，促使树突状细胞、幼稚或效应T细胞(TH1、TH2)、自然杀伤细胞转化为更加抗炎耐受的表型，减缓异常免疫反应。

摘要
背景：目前脐带、胎盘间充质干细胞在一些急性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)临床实验及动物模型中展现了良好的预防效果，但两种干细胞哪一个对GVHD的治疗更为有效尚无文献报道。
目的：观察比较人脐带和胎盘间充质干细胞的免疫调节功能，以及对小鼠急性GVHD的预防作用。
方法：①体外实验：取人外周血单个核细胞，分4组培养，单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组。5 d后，检测外周血单个核细胞增殖及培养上清干扰素γ分泌水平；②动物体内实验：取BABL/c(H-2d)小鼠57只，8.5 Gy全身照射后分6组，单纯照射组尾静脉注射生理盐水0.5 mL；同基因脊髓移植组尾静脉注射同种异体骨髓有核细胞悬液0.5 mL；异基因骨髓移植组尾静脉注射异种骨髓有核细胞悬液0.5 mL；急性GVHD组尾静脉注射异种骨髓有核细胞与脾脏单个核细胞混合液0.5 mL；脐带干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人脐带间充质干细胞混合液 0.5 mL；胎盘干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人胎盘间充质干细胞混合液0.5 mL。移植后11 d，进行GVHD临床症状评分；移植后3周，进行生存时间分析；移植后2周，进行皮肤、肝脏及小肠病理组织学分析。
李娟娟，女，1986年生，山东省济宁市人，汉族，北京协和医学院在读博士，主要从事血液病的基础与临床研究。

通讯作者：韩忠朝，教授，中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市
300020

中图分类号:R394.2
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2017)05-00693-08
稿件接受：2016-11-26

Li Juan-juan, Studying for doctorate, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Corresponding author:
Han Zhong-chao, Professor, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

结果与结论：①体外实验：与脐带间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞具有更强的抗炎功能；②动物体内实验：脐带干细胞组、胎盘干细胞组GVHD临床症状评分低于急性GVHD组(P < 0.05)，小鼠存活率高于急性GVHD组(P < 0.05)。急性GVHD组、胎盘间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组均未发生皮肤组织病变，各组均可见小肠组织黏膜脱落病变，组间差异不明显；急性GVHD组小鼠肝脏组织可见多发性灶性坏死和大量炎症细胞浸润，胎盘干细胞组和脐带干细胞组仅见小的坏死病灶和较少的炎症细胞浸润；③结果表明，脐带和胎盘间充质干细胞均可预防小鼠急性GVHD，两者之间未见明显差异。
关键词：
干细胞；移植；脐带间充质干细胞；胎盘间充质干细胞；急性移植物抗宿主病；小鼠模型；国家自然科学基金
主题词：
脐带；胎盘；间质干细胞；移植物抗宿主病；小鼠；组织工程
基金资助：
国家自然科学基金重点项目(81330015)

3
P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
Effect of human umbilical cord versus placenta mesenchymal stem cells in prevention of mouse acute graft versus host disease

Li Juan-juan, Wang You-wei, Ma Feng-xia, Du Wen-jing, Song Bao-quan, Wang Xin, Feng Ying, Tian Jian-jian, Han Zhong-chao (State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China)

Abstract
BACKGROUND: Recently, the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) and placenta-derived mesenchymal stem cells (PDMSCs) on treatment of acute graft versus host disease (aGVHD) have been confirmed in some in vitro studies or animal models. But there are still no reports comparing the therapeutic effects of these two cell types.
OBJECTIVE: To compare the immunosuppressive function of hUCMSCs and PDMSCs in vitro or in a mouse aGVHD model.
METHODS: (1) In vitro experiment. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and divided into four groups: PBMCs cultured alone, PBMCs stimulated with phytohaemagglutinin (PHA), PHA stimulated-PBMCs cocultured with hUCMSCs, PHA stimulated-PBMCs cocultured with PDMSCs. After 5 days, PBMCs proliferation and interferon-γ level in cell supernatant were measured. (2) In vivo experiment. Fifty-seven BABL/C(H-2d) mice exposed to 8.5 Gy irradiation were randomly divided into five groups: only saline injection group, syngeneic bone marrow transplantation group, allogeneic bone marrow transplantation group, aGVHD group, hUCMSCs treatment group, PDMSCs treatment group. The clinical aGVHD score, histopathology of skin, liver, and small intestine, and survival time were analyzed at days 11, 14, 21 after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro test: compared with the hUCMSCs, PDMSCs had stronger anti-inflammatory function. (2) In vivo test: The clinical scores on acute graft versus host disease were significantly lower in the hUCMSCs and PDMSCs treatment groups than that in the aGVHD group (P < 0.05). The survival rates of mice were significantly increased in the hUCMSCs and PDMSCs treatment groups compared to the aGVHD group (P < 0.05). Evident skin lesions were not found in all groups. Although small intestine mucosal lesions were found in all groups, the damage level seemed similar. Notably, significant difference was found in the liver that multifocal necrosis and a large number of inflammatory cells were seen in the aGVHD group, but less necrosis and inflammatory cells in the hUCMSC and PDMSC treatment groups. In conclusion, hUCMSC and PDMSC are comparably effective in the treatment of aGVHD in mice.
Subject headings: Umbilical Cord; Placenta; Mesenchymal Stem Cells; Graft vs Host Disease; Mice; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81330015

Cite this article: Li JJ, Wang YW, Ma FX, Du WJ, Song BQ, Wang X, Feng Y, Tian JJ, Han ZC. Effect of human umbilical cord versus placenta mesenchymal stem cells in prevention of mouse acute graft versus host disease. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(5):693-700.

697
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
异基因造血干细胞移植是可治愈血液系统肿瘤和造血功能异常性疾病的一种有效治疗措施。急性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)是其主要的严重并发症，发病率高，致死率高，致残率高，为恶性血液病非复发死亡的重要原因。类固醇激素为治疗急性GVHD的一线治疗药物，但约50%的患者出现激素耐药，GVHD反应无法得到控制。其他针对GVHD反应的二线治疗药物如针对T细胞表面抗原的单抗(CD3、CD25等)、化疗药物(吗替麦考酚酯、他克莫司等)，虽然对GVHD具有可靠的治疗效果，但随之而来的免疫力低下、机会性感染，严重削弱了这些药物的优势，最终并没有延长患者的生存时间[1]。因此急需寻找一种新的有效控制激素耐药型急性GVHD的治疗措施。
间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，经体外诱导可向成骨、成脂及成软骨分化[2]。间充质干细胞广泛存在于骨髓和脂肪、胎盘、脐血等组织中，可在体外迅速大量扩增，便于临床应用[3-5]。间充质干细胞具有特殊的低免疫原性和免疫调节能力，可用于治疗自身免疫紊乱性疾病，包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、GVHD等。目前骨髓间充质干细胞对GVHD的治疗作用已有大量临床及实验室研究。许多临床实验结果显示，供者来源或第三方来源骨髓间充质干细胞对于糖皮质激素耐药的急性GVHD具有安全有效的治疗作用[6-7]。但osiris公司发起的大规模多中心的随机对照临床三期试验结果显示，间充质干细胞治疗组起始治疗 28 d的总缓解率与对照组相比没有统计学差异，而间充质干细胞治疗组对肠道肝脏急性GVHD反应具有显著治疗效果。分析原因大概有一下几点：间充质干细胞来源不同，制备方法不同，给予剂量不同，注射时间不同，免疫原性不同，冻存处理差异，另外值得注意的一点是受者体内环境的差异也是影响间充质干细胞疗效的重要因素[8]。与骨髓来源间充质干细胞相比较，脐带、胎盘来源间充质干细胞是从废弃的胎盘与脐带中提取出来的，无伦理学限制，无创伤性，获取便利，数量丰富，因此脐带、胎盘来源间充质干细胞替代骨髓来源间充质干细胞具有良好的应用前景[3-4]。
目前脐带、胎盘间充质干细胞在一些急性GVHD临床实验及动物模型展现了良好的预防治疗效果[9-10]。脐带和胎盘间充质干细胞哪一个对GVHD的治疗更为有效，尚无文献报道。因此在实验中，通过构建小鼠急性GVHD模型，观察比较脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠GVHD的预防作用。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞水平比较和小鼠移植实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年11月在天津血液病研究所完成。
1.3 材料
胎盘：胎盘标本由天津市中心妇产医院提供，均为正常足月妊娠产妇行剖宫产取出(产妇因盆腔狭窄行剖宫产)。取标本前征得产妇及其家属同意并签署知情同意书，在严格无菌条件下采集胎盘组织。
实验动物：6-8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(H-2b)和雌性BALB/c小鼠(H-2d)，体质量16-21 g，购于中国医学科学院血液病研究所。所有实验小鼠均饲养于SPF级别隔离笼中，饲料及垫料均经灭菌处理，小鼠购买后，饲养1周后进行实验。所有动物实验均按照动物伦理委员要求操作。
主要试剂：流式抗体PE-CD73FITC-CD90PE- CD105PE-CD19、FITC-CD45PE-CD11bFITC-HLA-DR (BD Biosciences公司)；Ficoll 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；CellTraceTM CSFE(Invitrogen公司)；油红O、茜素红(sigma公司)；ABI PRISM 7900、PowerUpTM SYBR® Green Master Mix(Applied Biosystems)；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgene)；人IFN-γELisa试剂盒(欣博盛)。
1.4 实验方法
1.4.1 脐带和胎盘间充质干细胞的分离培养 在无菌条件下，将脐带华通胶组织和胎盘组织分别经PBS冲洗后，剪成小块，加入0.1%胶原酶Ｉ消化30 min，离心洗涤后再加入0.125%胰酶消化30 min，200目筛网过滤后，离心沉淀消化液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/DF12培养基, 37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱内培养培养，每3 d换液1次，细胞长至80%融合时，用0.125%胰酶消化，按1∶3的比例传代培养。
1.4.2 脐带和胎盘间充质干细胞的表型鉴定 脐带和胎盘间充质干细胞培养至第3代，胰酶消化离心制备单细胞悬液，分别加入以下抗体：PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105、PE-CD19、 FITC-CD45、PE-CD11b、FITC-HLA-DR，4 ℃孵育30 min，离心后取细胞沉淀，加入300 μL PBS，在BD CantoII流式细胞仪检测表面分子的表达情况，Flowjo 软件分析结果。
1.4.3 绘制细胞生长曲线 将脐带胎盘间充质干细胞以2.5×104接种于6孔板内，每天取3孔计数，绘制细胞生长曲线。
1.4.4 诱导脐带和胎盘间充质干细胞向成脂成骨细胞分化 将培养至第3代脐带和胎盘间充质干细胞接种至6孔板内，分别加入成脂、成骨诱导培养基，每3 d换液1次，诱导分化21 d，油红O染色观察成脂情况，茜素红染色观察成骨情况。成脂诱导培养基组分：IMDM培养基、体积分数10%FBS、100 U青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸、 2 mmol/L左旋谷氨酰胺、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、0.5 mmol/L消炎痛和10 μmol/L胰岛素；成骨诱导培养基组分：IMDM培养基、体积分数10%FBS、100 U青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 mg/L抗坏血酸磷酸盐。
1.4.5 实时定量PCR检测 检测转化生长因子β、环氧酶2、白细胞介素6、肝细胞生长因子、吲哚胺2，3-二氧化酶基因mRNA的表达水平。Trizol 提取第3代脐带和胎盘间充质干细胞的mRNA，利用全式金的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix将mRNA反转成为cDNA，通过 PowerUpTM SYBR® Green Master Mix检测试剂盒在ABI PRISM 7900 PCR检测仪上检测RNA的相对表达水平。通过2-∆∆Ct方法对目的基因进行相对定量PCR每个标本重复3次，GAPDH作为内参。
∆∆Ct=实验组(CT目的基因-CTGAPDH)-对照组(CT目的基因-CTGAPDH)。

引物序列：
基因
5’-3’
白细胞介素6
正向：5’-CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT-3'
反向：5’-TTG CCT TTT TCT GCA GGA AC-3'
环氧酶2
正向：5’-ACT CTG GCT AGA CAG CGT AA-3’
反向：5’-ACC GTA GAT GCT CAG GGA C-3
转化生长因子β
正向：5'-ACT GCA AGT GGA CAT CAA CG-3'
反向：5'-TGC GGA AGT CAA TGT ACA GC-3'
吲哚胺2，3-二氧化酶
正向：5’-GCC AGC TTC GAG AAA GAG TTG-3'
反向：5’-ATC CCA GAA CTA GAC GT GCA A-3'
肝细胞生长因子
正向：5’-GCC AGC TTC GAG AAA GAG TTG-3'
反向：5’-ATC CCA GAA CTA GAC GTG CAA-3'
GAPDH
正向：5’-CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGAC-3’
反向：5’-TGA GCG ATG TGG CTC GGC T-3’

1.4.6 体外实验
间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养：采用Ficoll 人外周血淋巴细胞分离液提取人外周血单个核细胞(健康供者自愿捐献)，预先标记CellTraceTM CFSE，加入10 μg/L白细胞介素2，分4组培养：单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组，加入的植物凝集素质量浓度为2.5 mg/L。培养5 d，流式检测外周血单个核细胞的增殖情况，结果以% divided(发生过增殖的细胞数目除以增殖刺激前的细胞总数)表示。

脐带干细胞组 胎盘干细胞组

D

C

50
40
30
20
10
0
脐带干细胞 胎盘干细胞

细胞数目(×104)
CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD45 HLA-DR CD34

图1 脐带和胎盘间充质干细胞的培养及鉴定
Figure 1 Isolation and identification of mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord and placenta
图注：图中A为光学显微镜下观察两种间充质干细胞的形态(×40)，均呈细小短梭形；B为流式检测两种干细胞表面标记抗原的表达情况；C为诱导两种干细胞向成脂、成骨细胞分化，油红O成脂染色可见细胞浆内有红色脂肪小滴(×100)；茜素红成骨染色可见红色钙化结节(×40)；D为两种干细胞生长曲线，细胞生长均较快。

时间(d)
脐带干细胞 胎盘干细胞

A

0 2 4 6 8
B

脐带干
细胞
胎盘干
细胞

成骨分化 成脂分化

胎盘干
细胞

C

脐带干
细胞

基因相对表达
B

脐带干
细胞

基因相对表达
胎盘干
细胞

基因相对表达
A

脐带干
细胞

脐带干
细胞

胎盘干
细胞

A

B

PBMC PBMC+PHA
PBMC+PHA+UMSC
PBMC+PHA+PMSC

PBMC PBMC+PHA
PBMC+PHA+UMSC
PBMC+PHA+PMSC

PBMC+PHA+PMSC

PBMC+PHA+UMSC

PBMC+PHA

PBMC

细胞增殖(%)
50
40
30
20
10
0

c

b

c

b

干扰素γ(ng/L)
b

c

2 000
1 500
1 000
500
0

C

胎盘干
细胞

a

图2 实时定量PCR检测脐带和胎盘间充质干细胞中的相关基因表达
Figure 2 Real-time PCR analysis of TGF-β, IDO, COX-2, HGF, IL-6 levels in mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord and placenta
图注：图中A-E分别为转化生长因子β、吲哚胺2，3-二氧化酶、环氧酶2、肝细胞生长因子及白细胞介素6基因相对表达水平。
图3 脐带和胎盘间充质干细胞与植物凝集素刺激的外周血单个核细胞共培养
Figure 3 Coculture of mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord and placenta with peripheral blood mononuclear cells stimulated with phytoagglutinin
图注：图中A为流式检测外周血单个核细胞CFSE的荧光强度变化，B为单个核细胞增殖，C为培养上清干扰素γ的分泌量。UMSC为脐带间
充质干细胞，PMSC为胎盘间充质干细胞，PHA为植物凝集素，PBMC为单个核细胞。a代表P < 0.05，b代表P < 0.01，c代表P < 0.001。
2.0
1.5
1.0
0.5
0

1.5
1.0
0.5
0

1.5
1.0
0.5
0

P < 0.001

P < 0.001

1.5
1.0
0.5
0

P < 0.05

1.5
1.0
0.5
0

胎盘干
细胞

脐带干
细胞

基因相对表达
基因相对表达
D

E

图4 输注异基因骨髓和脾脏单个核细胞小鼠的移植物抗宿主病反应
Figure 4 Clinical manifestations of graft versus host disease were evident in mice transfused with allogenic bone marrow and spleen mononuclear cells
图注：移植后六七天，小鼠开始出现弓背腹泻症状，并逐渐加重，移植后2周出现明显的弓背腹泻。图中A小鼠弓背现象，B为小鼠出现明显腹泻、便血症状。
A

B

701
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

图6 各组小鼠皮肤、肝、小肠组织病理变化(苏木精-伊红染色，×40)
Figure 6 Histopathological changes of the mouse skin, liver and small intestine (hematoxylin-eosin staining, ×40)
图注：各组发病小鼠皮肤组织变薄，均未见明显炎症细胞浸润；急性GVHD组肝脏发生了多发性坏死病灶，大量炎症细胞浸润，而脐带和胎盘干细胞组肝脏仅有小的坏死病灶，可见少量炎症细胞浸润或在肝汇管区可见炎症因子浸润，较急性GVHD组明显减少；各组小肠组织均可见小肠黏膜绒毛变性、脱落，隐窝受损，未见明显差异。GVHD为移植物抗宿主病。
急性GVHD组 脐带干细胞组 胎盘干细胞组

图5 脐带和胎盘间充质干细胞可预防小鼠急性移植物抗宿主病的发生
Figure 5 Mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord and placenta can prevent acute graft versus host disease in mice
图注：图中A为移植后11 d各组小鼠质量变化；B为移植后11 d各组小鼠移植物抗宿主病临床评分；C为移植后21 d各组小鼠生存时间分析。脐带和胎盘干细胞治疗可减轻移植物抗宿主病引发的两床症状及临床评分，提高移植物抗宿主病小鼠生存率。
22
20
18
16
14
12

体质量(g)
0 d 3 d 6 d 9 d 12 d

A

同基因骨髓移植组
异基因骨髓移植组
急性GVHD组
脐带干细胞组
胎盘干细胞组

单纯照射组
同基因骨髓移植组
异基因骨髓移植组
急性GVHD组
脐带干细胞组
胎盘干细胞组

10
8
6
4
2
0

移植物抗宿主病
临床评分
急性
GVHD组

B

脐带
干细胞组
胎盘
干细胞组
100

50

0

生存率(%)
0 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d

C

小肠 肝脏 皮肤

Elisa 试剂盒检测培养上清人干扰素γ：收集各组培养上清，利用人干扰素γELISA检测试剂盒检测干扰素γ的分泌量。具体步骤如下：将各组标本稀释后，取100 μL加入已铺被干扰素γ抗体的96孔板中，37 ℃孵育90 min，洗涤后加入100 μL稀释后的浓缩生物素化抗体，孵育60 min后洗涤，然后加入稀释后的酶结合物孵育30 min，洗涤后加入100 μL显色底物，孵育15 min后，加入100 μL显色终止液，3 min内用酶标仪测定450 nm波长处的A值。
1.4.7 动物体内实验 所有动物实验均按照动物伦理委员要求操作。
移植前处理及实验分组：移植前1周喂食BALB/c小鼠含有200 mg/L庆大霉素的无菌酸化水，移植前24 h内给予小鼠8.5 Gy全身照射(铯源)。以C57BL/6小鼠作为骨髓移植供鼠，BABL/c作为受体鼠，进行异基因骨髓移植，或同时经尾静脉输入C57BL/6小鼠脾脏单个核细胞建造小鼠急性GVHD模型。
骨髓细胞的制备：断颈处死供鼠，体积分数75%乙醇浸泡5 min，在超净台内无菌条件下取出小鼠两股骨和胫骨，置于含体积分数2%胎牛血清的RPMI1640培养基中。用RPMI1640培养基冲洗骨髓腔，取出骨髓细胞，无菌洗液管吹打成骨髓悬液，200目滤网过滤制后，1 500 r/min离心10 min，收集细胞沉淀，加入生理盐水重悬。另外取少量细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞后，计数有核细胞的量。并调整骨髓悬液有核细胞浓度为5×1010 L-1。
实验分组：
组别
n
干预
单纯照射组
10
尾静脉注射生理盐水0.5 mL
同基因脊
髓移植组
7
尾静脉注射同种异体骨髓有核细胞悬液0.5 mL(含细胞1×107 )
异基因骨髓
移植组
9
尾静脉注射C57BL/6小鼠骨髓有核细胞悬液0.5 mL(含细胞1×107 )
急性GVHD组
10
尾静脉注射C57BL/6小鼠骨髓有核细胞(含细胞1×107)与脾脏单个核细胞(含细胞5×106)混合液0.5 mL
脐带干细胞组
11
尾静脉注射C57BL/6小鼠骨髓有核细胞(含细胞1×107)、脾脏单个核细胞(n=10)(含细胞5×106)与人脐带间充质干细胞(含细胞1×106)混合液0.5 mL
胎盘干细胞组
10
尾静脉注射C57BL/6小鼠骨髓有核细胞(含细胞1×107)、脾脏单个核细胞(n=10)(含细胞5×106)与人胎盘间充质干细胞(含细胞1×106)混合液0.5 mL

脾脏单个核细胞的制备：无菌剪剪开脾脏包膜，置于并200目滤网上，浸泡在含体积分数2%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，用无菌注射器柄端轻轻碾磨脾脏，用培养基冲洗滤网数次，收集过滤后的脾脏细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，收集脾脏细胞沉淀。PBS重悬后吹打成单细胞悬液，轻轻置于小鼠脾脏淋巴细胞分离液上层，1 800 r/min离心20 min，收集白膜层细胞，PBS洗涤2次，细胞计数后，调整细胞密度为5×1010 L-1，置于4 ℃冰箱待用。
脐带和胎盘间充质干细胞悬液的制备：同一供者来源的胎盘和脐带间充质干细胞在培养至3-6代时用于实验。将正在培养的胎盘、脐带间充质干细胞用0.125%胰酶消化，离心洗涤后，用生理盐水调整细胞浓度为5×109 L-1。
尾静脉输注细胞悬液：根据实验分组将以上细胞悬液混合经尾静脉缓缓输入小鼠体内(输注过快小鼠会发生肺栓塞而死亡)，每只小鼠输注0.5 mL(生理盐水补足)。
小鼠GVHD症状评分：移植后每天观察小鼠的一般情况，包括体质量、皮毛、姿势、活动度、腹泻及精神状态，判断小鼠有无发生急性GVHD。根据Cooke等[11]的临床GVHD症状评分标准，在移植后11 d，对各组小鼠的临床GVHD症状进行评分。
GVHD症状评分标准：
标准
0级
1级
2级
体质量减少
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