SC∕T 7219.5-2015 三代虫病诊断规程 第5部分：细锚三代虫病(水产).pdf

ICS 65.020.30 B 50 :才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7219.5-2015 三代虫病诊断规程第5部分:细锚三代虫病Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis-Part 5: Infection with Gyro彻ctylussprostonae 2015-02-09发布2015-05-01实施中华人民共和国农业部发布SCjT 7219.5-2015 目。ESC/T 7219 (三代虫病诊断规程为系列标准:一第1部分:大西洋娃三代虫;一一第2部分:皖三代虫病;一一第3部分:链兰代虫病;一第4部分:中型三代虫病;一一第5部分:细锚三代虫病;一一第6部分:小林三代虫病;本部分为SC/T7219的第5部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管理局提出o本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:李文祥、王桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。I 1 范围三代虫病诊断规程第5部分:细锚三代虫病SC/T 7219.5一2015本部分规定了细锚兰代虫病的感染对象与临床症状，细锚三二.代虫(也叫史若兰兰代虫，Gyrodactylus srostonae)的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及细锚兰代虫病的综合判定。本部分适用于鲤、蝉的细锚三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SCjT 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3 试剂和材料3.1 水=符合GBjT6682中一级水的规格。3.2 乙醇:分析纯。3. 3 Taq酶:一200C保存，避免反复冻融。3. 4 dNTPs:含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/Lo 3.5 上游引物:5-TTTCCGTAGGTGAACCT -3。3.6 下游引物:5-TCCTCCGCTTAGTGATA -3。3.7 矿物油:不含DNA酶和RNA酶。3. 8 DNA marker 2 000: 2 000 bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。3.9 其他试剂见附录Ao4 仪器和设备4. 1 解剖盘、剪刀、慑子、解剖针、于术刀。4. 2 体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。4. 3 盖玻片、载玻片、培养皿。4.4 电子天平。4. 5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6 普通冰箱和超低温冰箱。4. 7 微量移液器。4.8 PCR扩增仪。4. 9 离心管和PCR管。4. 10 紫外透射仪。4.11 水平电泳系统。1 SC/T 7219.5-2015 5 感染对象与临床症状5. 1 感染对象细锚三代虫能感染挪CCara川usauratusuratus)、东北鲤CCynnuscar户iohematopterus)、翘嘴红鲍(Erythrolterilishaeformis)和馀(Silurusspp. )等。5. 2 临床症状细锚三代虫主要寄生于体表，病鱼常出现蹭擦池壁、跃出水面的行为;有些病鱼反应迟饨，常在水流缓慢的地方出现，体表因素占液增多变成淡灰色，背鳝、尾鳝和胸鳝的边缘出现廉烂。6 三代虫采集与固定6. 1 病鱼采集仔细观察待检鱼类的临床症状和行为，捞取具有典型症状的鱼类。采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。6. 2 三代虫样品的收集6.2. 1 现场采集剪取鳝条、鲤、丝或刮取部分体表教液，置于载玻片上。滴加数滴清水，置于体视显微镜下观察。用解剖针将三代虫从鳝条或螺丝或体表教液中分离，用吸管吸出，放在盛有清水的培养皿中，每尾病鱼至少采集成虫10条。6.2.2 固定病鱼中的采集剪取病鱼鳝条或鲍丝放在载玻片上，逐滴加入自来水浸泡10min，置于体视显微镜下观察。发现兰代虫后，用解剖针将虫体分离，放在盛有清水的培养皿中;同时，镜检固定病鱼所用容器底部的沉淀物。如发现有从鱼体脱藩的三代虫，用吸管吸出，放在盛有清水的培养皿中。6. 3 三代虫样晶的固定与保存加一滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到水基本吸干为止。加上-滴APG恪液(见附录A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙o用于形态学鉴定的虫体样本可用70%酒精保存，用于PCR鉴定的虫体样品可用95%酒精保存。7 细锚三代虫的鉴定7. 1 细锚三代虫的形态学鉴定细锚兰代虫运动如尺攫;虫体呈长叶形，体长O.2 mmO. 5 mm，体前有2个头器，无黑色眼点;虫体后端具几T质的伞状后吸器，其上有1对锚钩、16个边缘小钩和1根腹联结片;锚钩基部较长，与钩尖几乎等长，腹联结片上窄下宽，突起间长小于腹联结片长，可依次进行鉴定。细锚士气代虫后吸器的锚钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其大小见附录B。如果虫体后吸器的形态特征和测量大小与附录B相符，则可判定为细锚兰代虫。7.2 细锚三代虫的分子检测7.2. 1 虫体DNA的提取将80%乙醇同定的三代虫(1个虫体作为1个样品)充分干燥去除乙醇，置入1.5 mL的离心管中，加入500LDNA抽提缓冲液1(见附录A.的于550C消化3h，冷却至室温后加入500LDNA抽提缓冲液I1C见附录A.日，摇匀，11000 g离心10min，收集上清液。然后，加入2倍上清液体积的一200C预冷无水乙醇，40C下5000g离心10min弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于40LTE缓冲液(见附录A.2), -20oC保存备用。SC/T 7219.5-2015 7.2.2 rDNA -ITS的PCR扩增PCR反应体系(25L)中，加入20mol/L的上游引物和下游引物各1L，dNTPs2L，MgC12 2.5 L，Taq酶缓冲液2.5L，O.5 U Taq酶以及模板基因组DNA1L，最后用无菌去离子水定容到25L，无热盖加的PCR仪应加矿物油25LPCR扩增时，应设置阴性对照和阳性对照。在PCR扩增仪中，940C预变性4min，再940C30 s500C30 s720C 1 min，共35个循环P最后720C延伸10min。7.2.3 PCR产物电泳与测序取5LPCR产物，加入1L澳酣蓝指示剂洛液(见附录A的，混匀。用1.0%琼脂糖(含0.5fJ-g/mL EB)于TAE缓冲溶液(见附录A7)中电泳分离，同时设置DNA分子量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约1300bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序，其序列参见附录C。序列相似性在99%以上者，判定虫体为细锚三代虫。8 综合判定8. 1 细锚三代虫的判定如果在显微镜下观察到鲤、卸的鳝条或鲍丝或体表的三代虫符合7.1的形态特征和测量数据，或根据7.2的方法对PCR扩增产物测序，与附录C给出的序列进行比对分析，序列相似性在99%以上者均可判定虫体为细锚兰代虫。8. 2 细锚三代虫病的判定鲤、挪(包括金鱼)感染细锚三代虫，数量多于其他三代虫种类的，且病鱼临床症状符合5.2描述，则判定为细锚三代虫病。3 SC/T 7219.5-2015 附录A(规范性附录)试剂及其配制本附录所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1 APG溶液将饱和的苦味酸镀洛液和甘油按照1: 1的比例混合。A.2 TE缓冲液1 mL Tris -HC1(l mol/ L, pH 8.0)和0.2mL EDTA(O. 5 mol/L,pH 8.0)混合，加元菌去离子水定容至100mL，高压灭菌后40C保存。A.3 10% SDS溶液10 g SDS榕于90mL蒸馆水中，680C助溶，用盐酸调pH至7.2，最后加蒸馆水定容至100mL，室温保存。A.4 DNA抽提缓冲液I400LTE缓冲液、16L蛋白酶K(5mg/mL)和20L10% SDS的混合溶液。A.5 DNA抽提缓冲液E按Tris-HCl溶液饱和过的重蒸酣、氯仿、异戊醇以25: 24 : 1的比例混合，密闭避光40C保存。A.6 Taq酶缓冲液(10倍PCRbuffer) O. 5 mol/ L pH8. 8的Tris-HCl、0.5mol/L的氯化饵(KCl)和1%的TritonX-100的混合溶液。A.7 TAE电泳缓冲液(50倍)242.0 g Tris碱、37.2g NazEDTA. 2HzO混合，然后加入800mL的去离子水充分搅拌洛解，再加人57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，室温保存。A.8 核酸染色剂(ethidiumbromide, EB) 用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。使用时，每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0L的EBoA.9 滇酣蓝指示剂溶液澳酣蓝100mg，加双蒸7(5 mL，在室温下过夜。待溶解后再称取在糖25g，加双蒸水洛解后移人澳酣蓝溶液中o摇匀后加双蒸水定容至50mL，j日入氢氧化饷(NaOH)溶液1滴，调至蓝色。4 附录B规范性附录)细锚三代虫后服器的形态测量B.1 细锚三代虫后吸器锚钩的测量部位及大小见图B.l。说明za 全长(42.0m53.0m); b一一钩柄长36.。m40.0m);旦旦旦-t一一钩尖长07.。m23.0m); d 基部长03.0m21.0m)。图B.l锚钩的测量部位及大小B.2 细锚三代虫后吸器边缘小钩的测量部位及大小见图B.2o10m 说明za 全长(18.1m25.8m); c-一一柄部长01.0m19.0m)。b一一镰部长(3.9m6.0m);图B.2边缘小钩的测量部位及大小SC/T 7219.5-2015 户口SC/T 7219.5一2015B.3 细锚气代虫后吸器腹联结片见图B.3。10 m 说明:a 联结片长(15.0m21.0m); 一一膜长05.0m18.。m);b 突起间长02.5m18.2m); f 中间总宽度09.0m25.0m); 一一基部宽度(6.0m7.0 f1-m); g 基部总宽度(21.0m25. 0m)。d-一一中闵宽度(4.1m6.2m);图B.3腹联结片的测量部位及大小6 SCjT 7219.5一2015附录C (资料性附录)细锚三代虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列细锚丁代虫核糖体DNA内转录间隔区(lTS)扩增产物的参考序列如下，下划线为引物。1 tttccgtau: tgaacctgcg gaaggatcat taaacatagt ttcctgtttg tgtgtaattc 61 agttgtgatt gctaacagct aatatagctg agctctatga gcgagtgaga gattaacgaa 121 atgaaacctg aataataccc aaggttatca taaataatgc cacccaataa tactgcacgt 181 ttgccacacg cagtaaaaag aaaccaaacg aacgagatac gaacgagatt cgaacgagat 241 aataagcgca tcgcgcaaaa gcaatcacac tgttttattc gcatttcatc tgccctataa 301 aattaggggt gaactatgta gtaacccctc actgtcattc agacagttgc tatttacaat 361 acgcaatgtg gtgaactggt aatcttccgt gctaaaatgg taatggctag ctacggtaag 421 gtctgattat cggtttggct acggccagcc cattggtgta tccgctatta ccaaaacctt 481 ctctacagtg gttcgttgga gttccacact cactgcctcg gcaccttcgg gtgaactgat 541 cgtagtgctt agcgccccgt aaaaagggaa gaagctttgc ttattacaac tccatgtggt 601 ggatcactcg gctcacgtat cgatgaagag tgcagcaaac tgtgttaacc aatgtgaaac 661 gcaaactgct tcgatcatcg gtctctcgaa cgcaaatggc ggctaagggc ttgctcttag 721 ccacgttcga tcgagtgtcg gcttttacct atcgtaacgc ttaattagtt acggattggg 781 aagcatacca tggctacgcg attaacttgt tgctgaaagt gggaacagtg ggtattacac 841 ggtctttacg gtttgcccat tggtgttcgg attctggtat tacacggtct ttttacggtt 901 tgccagatga attcacgctc ttacaagtaa gcgcttcaaa gtattacacg gtctctacgg 961 tttgctttga agtaaagacc tctatatcat acacgacttc tacggtttga tatggagtga 1021 agtagctcta gtggttcttc cttaattact tgggtagtat tgttgtatac tttatggtct 1081 gctctgcaca gggtgcgtgg cttagttcgc tttgtaacgc tgtactgttg tggatagatt 1141 tgtgtatgat atacccagtg aaataaagtc ctgacctcga ttcgagcgtg aatacccgct 1201 gaacttaagc atatcactaa SQgg 7