热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的影响.doc

热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的
影响

【关键词】 神经元

【Abstract】 AIM: To study the effects of hyperthemia

on the morphology and apoptosis of neurons, as well as the

changes of neural vitality at different temperature. METHODS:

The morphology of neurons was observed by microscope, their

apoptosis was detected by Klenow method and the results were

analyzed by image analysis system. The vitality of neurons was

detected by MTT reduction assay. RESULTS: The average gray of

Klenow positive cells increased with temperature and the highest

average gray was 133.40±4.49 while the value of the control

group was 69.54±2.70. The vitality of neurons decreased with

temperature. CONCLUSION: Hyperthemia induces the apoptosis of

neurons and 39℃ is the temperature to induce the peak point of

apoptosis. The vitality of neurons decreases with the increase

of temperature.

【 Keywords 】 hyperthermia; neuron; Klenow method;

apoptosis

【摘要】 目的： 研究热刺激对神经元形态及凋亡的影响, 观

察不同温度下神经元活力的变化. 方法：利用倒置相差显微镜观察高

温后神经元的形态学改变. 应用 Klenow 法对不同高温后神经元进行

1

凋亡检测，应用图像分析仪对检测的结果进行分析. MTT 法进行平均

吸光度检测. 结果： 高温处理后神经元出现形态学改变. Klenow 法

检测发现未经高温处理的对照组神经元平均灰度为 69.54±2.70，高

温处理后平均灰度升高，39℃时达高峰 133.40±4.49，而后随着温度

升高，平均灰度逐渐降低. MTT 法测定显示随着温度升高细胞活力逐

渐降低. 结论： 高温处理神经元可诱导其凋亡，39℃时达高峰. 神经

元细胞活力随温度升高而降低.

【关键词】 高温；神经元；Klenow 法；凋亡

0 引言

热刺激是一种物理致伤因素，常是引起人类中暑、热痉挛、

热衰竭等病症的重要因素. 其致损伤机制目前尚不清楚. 我们采用体

外原代培养的神经元，模拟体内梯度高温环境，用倒置相差显微镜、

Klenow 原位杂交、MTT 细胞活力测定技术，研究不同程度高温对体外

原代培养神经元形态、活力及凋亡的影响.

1 材料和方法

1.1 材料① 动物：孕 15 d 昆明种二级孕鼠由第四军医大学

实验动物中心提供（陕动字 003 号）. ② 主要试剂和仪器：胎牛血清

（杭州四季青公司） DMEM（Gibco 公司） 胰酶（华美公司） DNA 聚
； ， ；

合 酶 Ⅰ Klenow 片 段 介 导 的 dATP 生 物 素 切 口 末 端 标 记 试 剂 盒

（Oncogene） MTT（华美公司） 真彩色图像分析仪（LeicaQ570 c）
； ； ；

全自动可调水浴加热器（第四军医大学教保处）.

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1.2 方法

1.2.1 细胞培养取孕 15 d 昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死,

消毒后,逐层剖开腹部，取出胎鼠,体视显微镜下分离胎鼠大脑脑泡外

侧部的皮质. 剪碎脑组织,经 125 mg・L-1 胰酶消化,1000

r・min-1, 离 心 1 min, 终 止 消 化 , 以 完 全 培 养 基 (10

mL・L-1 胎牛血清,青、链霉素 1×105 U・L-1)稀释至 7

×108・L-1 密度并接种于经多聚赖氨酸处理过，加有玻片的培

养皿及 96 孔板中,送 入 50 mL・L-1 CO2 的培养箱, 37.4℃培

养 48 h 后,加入阿糖胞苷(10 mg・L-1)以抑制非神经元的继续

生长,每隔 2 d 半量换液,培养第 7 日时，经btubulin 免疫荧光染色

显示 80%以上细胞为阳性， 可认为是纯神经元培养， 进行后续实验 1］ ［.

1.2.2 热应激损伤模型的建立培养好的神经元移入经乙醇消

毒的全自动水浴加热器，处理 30 min.

1.2.3 实验分组将培养好的神经元随机分为高温组和对照组

① 高温组： 按高温模型分别于 38, 39, 40, 41 和 42℃温度处理 30 min.

② 对照组： ℃正常培养的神经元. 上述实验及对照组均随机选取 37.4

3 个细胞爬片.

1.2.4 倒置相差显微镜观察在倒置显微镜下观察处理组及对

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