大豆红色种皮的色素鉴定和基因定位.pdf

中国农业科学 2023,56(14):2643-2659 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.002 收稿日期：2023-03-03；接受日期：2023-04-23 基金项目：国家重点研发计划（2021YFD1201600）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（S2022ZD02）联系方式：曹杰，E-mail：。通信作者邱丽娟，E-mail： 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：大豆红色种皮的色素鉴定和基因定位 曹杰1,2，谷勇哲2，洪慧龙2，吴海涛2，张霞2，孙建强3，包立高4，邱丽娟1,2?1吉林农业大学生命科学学院，长春 130118；2中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；4内蒙古自治区农牧业技术推广中心，呼和浩特 010018 摘要：【目的】揭示种子发育过程中种皮花青素（anthocyanin）的含量变化以及导致泰兴矮脚红（TXAJH）红色种皮的主要花青素成分；定位控制花青素合成积累的关键基因，为深入了解红色种皮形成的调控机制奠定基础。【方法】利用超高效液相色谱串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）检测黄色种皮大豆绥农 14（SN14）和红色种皮大豆 TXAJH 不同发育阶段种皮的花青素成分与含量，分析与种皮颜色变化密切相关的花青素成分；利用 SN14 和 TXAJH 杂交构建的重组自交系（recombinant inbred lines，RIL）群体进行分离群体分组混合分析（bulked segregant analysis，BSA），初步定位红色种皮相关基因的候选区域，在此基础上，结合标记连锁分析缩小候选区间并预测红色种皮候选基因；最后通过 qRT-PCR 验证候选基因的表达情况。【结果】检测 SN14 和TXAJH 4 个发育阶段的种皮，共发现 12 种花青素。在成分上，总花青素的聚类分析表明，TXAJH 与 SN14 之间以及 TXAJH显色前后之间的种皮花青素组成均存在明显差异。在含量上，种子发育过程中，SN14 种皮花青素的含量逐渐下降，而TXAJH 种皮的含量迅速升高并保持稳定，种皮显色后，二者的花青素含量呈现极显著差异，在成熟阶段，TXAJH 种皮花青素的含量是 SN14 的 200 倍以上。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside，Cy-3-glu）、芍药花素-3-O-葡萄糖苷（Peonidin-3-O-glucoside，Pn-3-glu）和牵牛花素-3-O-葡萄糖苷（Petunidin-3-O-glucoside，Pt-3-glu）是导致 TXAJH 种皮呈现红色的重要原因。BSA-seq 关联分析将红色种皮基因的候选区间定位于第 8 染色体上，长度为 8.66 Mb。利用 27 个多态性标记进行连锁分析得到 10 种单倍型，最终将候选区间缩小至 702 kb。该区间中在亲本间存在非同义变异的基因共 37 个，其中，Glyma.08g059900编码 MYB 转录因子，Glyma.08g061300和Glyma.08g063900编码 bHLH转录因子，它们可能参与花青素的生物合成调控；Glyma.08g062000编码花青素还原酶 1，可以将花青素转化为原花青素（proanthocyanidin，PA）。基因表达分析结果表明，候选基因和花青素生物合成途径相关基因在 SN14 与 TXAJH 中的表达模式相似，均为前者低于后者。种皮花青素主要成分与候选基因表达水平的关联分析结果显示二者之间存在极强的相关性。【结论】SN14 与 TXAJH 的种皮花青素组成存在差异，TXAJH 红色种皮呈现红色可能是 Cy-3-glu、Pn-3-glu 和Pt-3-glu 积累的结果。预测Glyma.08g059900、Glyma.08g061300、Glyma.08g062000和Glyma.08g063900为红色种皮候选基因，其中Glyma.08g059900、Glyma.08g061300和Glyma.08g063900可能对花青素生物合成途径的多个基因产生调控作用。关键词：大豆；种皮色；花青素；BSA-seq；基因定位；转录因子 Pigment Identification and Gene Mapping in Red Seed Coat of Soybean CAO Jie1,2,GU YongZhe2,HONG HuiLong2,WU HaiTao2,ZHANG Xia2,SUN JianQiang3,BAO LiGao4,QIU LiJuan1,2?2644 中 国 农 业 科 学 56 卷 1 College of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130118;2 Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;3 College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030;4 Agriculture and Animal Husbandry Technology Promotion Center of Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot 010018 Abstract:【Objective】To identify the key genes controlling anthocyanin synthesis and accumulation,to uncover changes in anthocyanin content of the seed coat during seed development,and the primary anthocyanin components responsible for the red seed coat of Taixingaijiaohong(TXAJH);and to lay the groundwork for a thorough understanding of the regulatory mechanism of red seed coat formation.【Method】Using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS),the anthocyanin composition and concentration of the yellow seed coat of soybean Suinong 14(SN14)and the red seed coat of soybean TXAJH at various developmental stages were identified.The potential areas of red testa-related genes were first identified using bulked segregant analysis(BSA)on the recombinant inbred lines(RILs)made by crossing SN14 and TXAJH.Based on this discovery,we performed marker linkage analysis to restrict the candidate intervals and predict the candidate genes,and qRT-PCR to confirm the expression of the anticipated candidate genes.【Result】When seed coats from the four developmental phases of SN14 and TXAJH were analyzed,a total of 12 anthocyanins were discovered.Cluster analysis of total anthocyanins revealed substantial changes in the seed coats anthocyanin composition between TXAJH and SN14 as well as between TXAJH before and after color development.The anthocyanin content of the SN14 seed coat gradually decreased as the seed developed,whereas the TXAJH seed coats content increased quickly and remained stable.After the development of the seed coats color,the anthocyanin contents of SN14 and TXAJH showed highly significant differences,and at the mature stage,the TXAJH seed coats anthocyanin content was more than 200 times that of SN14.The crimson coloring of the TXAJH seed coat was largely due to cyanidin-3-O-glucoside(Cy-3-glu),peonidin-3-O-glucoside(Pn-3-glu),and petunidin-3-O-glucoside(Pt-3-glu).The candidate interval for the red seed coat gene on chromosome 8 was discovered at 8.66 Mb by BSA-seq association analysis.27 polymorphic markers were used in the marker linkage analysis,which produced 10 haplotypes and reduced the candidate interval to 702 kb.Nonsynonymous variations in 37 genes between the parents were found during this interval,these include the genes for encode the anthocyanin reductase 1(Glyma.08g062000),the bHLH transcription factor(Glyma.08g061300 and Glyma.08g063900),and the MYB transcript factor(Glyma.08g059900).These genes may be involved in regulating the biosynthesis of anthocyanins,and anthocyanin reductase 1 can convert anthocyanins to proanthocyanidins(PA).The results of gene expression analysis revealed that candidate genes and genes related to the anthocyanin biosynthesis pathway had comparable expression patterns in SN14 and TXAJH,and both were expressed at lower levels in SN14 and at higher levels in TXAJH.It was discovered that there was a significant link between the principal constituents of seed coat anthocyanins and the level of candidate gene expression.【Conclusion】The anthocyanin makeup of SN14 and TXAJHs seed coats differed,and Cy-3-glu,Pn-3-glu,and Pt-3-glu may be to blame for the TXAJHs seed coats red hue.According to predictions,Glyma.08g059900,Glyma.08g061300,Glyma.08g062000,and Glyma.08g063900 will likely be a candidate gene for the red seed coat,in which Glyma.08g059900,Glyma.08g061300,and Glyma.08g063900 may control a number of anthocyanin biosynthesis pathway genes.Key words:soybean;seed coat color;anthocyanin;BSA-seq;gene mapping;transcription factors 0 引言【研究意义】大豆（Glycine max(L.)Merr.）是重要的经济作物，可以为人类和牲畜提供优质的植物蛋白和油脂1-2。大豆种皮颜色是一类非常便于观察的生物学性状，在遗传学研究中常作为形态标记3。使用不同颜色来标记区分用于制药、食品饲料加工等商业用途的大豆将有望极大地降低原料筛选成本4。植物种皮的颜色主要取决于所合成花青素（anthocyanin）的种类和含量5。花青素是具有良好抗氧化活性的天然色素，长期食用花青素或富含花青素的食物对健康有一系列的好处，包括但不限于保护心血管、保护神经、改善视力、促进新陈代谢、抗菌抗炎症以及预防和治疗癌症等6-12。此外，花青素可以有效清除植物中由于非生物胁迫而产生的过量活性氧（reactive oxygen species，ROS），降低干旱、低温、高盐和重金属污染等逆境对植物造成的直接或间接损伤13-17。大豆中红色种皮较为罕见，鉴定其中的花青素成分，发掘与红色种皮形成相关基因，对解析种皮颜色形成机制，提升大豆品质和经济效益具有一定的参考意义。【前人研究进展】经典遗传研究表明，大豆籽粒颜色是一个受多位点控制的复杂性状，已发现至少 9 个位14 期 曹杰等：大豆红色种皮的色素鉴定和基因定位 2645 点（I、R、T、K1、O、W1、G、D1 和 D2）参与控制大豆种皮颜色18。G、D1 和 D2 位点通过影响叶绿素代谢，使种皮表现绿色3,19。I、R、T、K、O 和 W1位点通过控制大豆种皮中花青素的合成与分布使种皮的整体或局部发生色素沉积进而形成各种颜色的种皮20-28。花青素是类黄酮（flavonoids）物质下面的重要子类，在可见光波段具有广泛的吸收范围，是使植物产生颜色的重要物质，通常导致种皮呈现棕色、红色、双色、黑色等颜色5。在影响大豆种皮颜色的遗传位点中，I 是查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因的重复区域20。CHS 是催化花青素生物合成途径初始步骤的专用酶，多个 CHS 的存在会降低其自身在种皮中的表达水平进而抑制种皮的花青素合成21。T 和 W1 位点分别与黄烷酮 3-羟化酶（flavonoid 3-hydroxylase，F3H）基因和黄烷酮 35-羟化酶（flavonoid 35-hydroxylase，F35H）基因共分离22-24。F3H 和 F35H 对黄烷酮 B 环不同位置的羟基化修饰将决定最终合成花青素的颜色类型，对植物颜色的呈现有重要影响25-26。R 和 K 位点分别与编码R2R3-MYB 转录因子和 Argonaute5（AGO5）蛋白的基因有关27-28。R2R3-MYB 转录因子调控花青素合成途径部分关键基因的表达，可导致纯黑/纯褐色种皮或双色条纹种皮27。AGO5 蛋白具有调控 CHS siRNAs在种皮中分布的功能，使种皮特定部位例如种脐和鞍区发生色素沉积形成鞍挂种皮28。O 位点与红棕色种皮有关，但只在 I 和 R 位点均为隐性的时候才影响种皮颜色18。在基因定位方法上，传统的 QTL 图谱通常涉及使用分布于整个基因组中的分子标记对群体中的大量个体进行基因型和表型分析以保证足够的统计能力，这一过程需要耗费大量的时间和人力物力成本29。相比之下，利用分离体分组混合分析（bulked segregant analysis，BSA）方法可以通过构建目标性状极端差异的基因混池快速筛选与目标性状紧密相关的位点来定位基因30-31。新一代测序技术的发展迭代使更多物种陆续完成全基因组测序，基于全基因组测序的 BSA 方法可以在没有遗传图谱的情况下，对目标性状进行快速精准的定位分析，具有经济、方便、快捷的优点32-33。目前，BSA-seq 方法已被广泛应用于小麦34、水稻35、玉米36、花生33,37、大豆等的基因定位中，并取得显著成果。【本研究切入点】目前，大豆种皮花青素的研究多集中于黑色种皮的成熟种子，而对红色种皮以及种皮发育过程花青素含量变化的研究较为罕见，且已发现的位点/基因尚不能完全解释种皮颜色的形成机制。【拟解决的关键问题】本研究通过对红、黄 2 种颜色大豆不同发育阶段的种皮进行花青素成分含量检测，揭示种子发育过程中种皮花青素的含量变化规律以及决定红色种皮的主要花青素成分；利用绥农 14 与泰兴矮脚红杂交构建的重组自交系（recombinant inbred lines，RIL）群体进行 BSA-seq和基因定位，预测红色种皮颜色候选基因，为深入解析种皮颜色形成的调控机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 植物材料 前期以黄色种皮栽培品种绥农 14（SN14，ZDD22648）为母本，红色种皮地方品种泰兴矮脚红（TXAJH，ZDD04430）为父本，通过杂交和连续自交的方法构建了 F9 RIL 群体。SN14 和 TXAJH 以及 RIL 群体的 188 个品系于2022年6月在中国农业科学院作物科学研究所试验田（11620E，3957N）种植，采用常规田间管理模式。播种后第 30 天收集亲本及每个品系的幼嫩叶片用于BSA-seq 和基因定位。分别在开花后第 30、40、50、60 和 70 天剥取 SN14 和 TXAJH 的种皮用于花青素含量检测和 qRT-PCR 分析，每个时期的每个样品均包含3 个生物重复。以上所有样品离体后立即在液氮中速冻，-80 保存备用。1.2 种皮花青素提取 分别选取 SN14 与 TXAJH 开花后第 40、50、60和 70 天的种皮进行花青素成分检测。样品经充分研磨后，每份取 0.1 g 冻干粉末溶解于 1 mL 70%甲醇中，充分涡旋混匀，4 C 过夜萃取，然后 12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 m pore size）过滤得花青素提取液，避光 4 保存备用。1.3 花青素检测 用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）进行花青素检测。将所有待测样品的等量混合物作为QC 样本，每 8 个待测样本中插入一个 QC 样本以监测在相同的处理方法下分析过程的重复性。液相条件主要包括：1）色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 1.8 m，2.1 mm100 mm；2）流动相：各含 0.1%甲酸的超纯水（A 相）和乙腈（B 相）；3）洗脱梯度（v/v）：0 min 水/乙腈为 95/5，10.0 min 为 5/95，11.0 min 为5/95，11.1 min 为 95/5，15.0 min 为 95/5；4）流速 0.4 mLmin-1；柱温 40；进样量 2 L。质谱条件主要包括：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温2646 中 国 农 业 科 学 56 卷 度为 550，质谱电压为 5 500 V/-4 500 V，离子源气体（gas，GS）为 55 psi，气体（gas，GS）为 60 psi，气帘气（curtain gas，CUR）为 25 psi，碰撞诱导电离（collision-activated dissociation，CAD）参数设置为高。检测结束后，根据二级谱信息利用岛津株式会社（https:/ sulfoxide，DMSO）为标准品，利用三重四级 杆 质 谱 的 多 反 应 监 测 模 式（multiple reaction monitoring，MRM）进行花青素的定量分析。1.4 DNA 和 RNA 提取 将保存于-80 的叶片和种皮样品分别在液氮中充分研磨。每份叶片样本取 0.1 g 冻干粉末，用 CTAB法提取基因组 DNA38。每份种皮样本取 0.1 g 冻干粉末，用植物总 RNA 提取试剂盒 FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（#RC411,Vazyme）按照产品说明书提取种皮总 RNA。用 Gene Company Limited（基因有限公司）的 NanoDrop-1000 分光光度计检测 DNA 和 RNA 的浓度和质量，-80 保存备用。1.5 BSA 测序分析 1.5.1 文库构建和测序 依据 大豆种质资源描述规范和数据标准39，从 RIL 群体中选择 30 个黄色种皮品系和 30 个红色种皮品系，将 DNA 分别等量混合，构成 2 个子代基因池，命名为 Y 和 R。在亲本 SN14和 TXAJH 中各取 10 个单株，将 DNA 分别等量混合，构成 2 个亲本基因池，命名为 SN 和 TX。文库的构建和测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。试验流程按照 Illumina 公司提供的标准protocol 执行，首先用超声破碎的方法将 DNA 随机打断成 350 bp 大小的片段，DNA 片段经末端修复、3端加 A、加测序接头、纯化后进行 PCR 扩增，最终通过 Illumina HiSeq 进行测序。亲本池测序深度为 10，后代混池测序深度为 30。1.5.2 变异检测和关联分析 利用 Bcltofastq（v1.8.4）对测序结果进行碱基识别，原始序列过滤得到 clean reads，以大豆参考基因组（Wm82.a2.v1）为模板，利用 bwa 软件对 clean reads 进行拼接组装40。使用 samtools（v1.9）过滤冗余 reads。使用 GATK 的HaplotypeCaller（局部单体型组装）算法进行 SNP 和InDel 的变异检测41-42。使用 SnpEff 软件对变异位点集进行注释和预测43。通过欧式距离（euclidean distance，ED）算法和 index 算法进行关联分析44-45。ED 算法用于计算变异位点与性状的关联程度，ED 值越大表明该位点在两混池间的差异越大。ED 值计算公式如下：2222)()()()(wtmutwtmutwtmutwtmutTTGGCCAAED+=式中，Amut、Cmut、Gmut、Tmut分别表示碱基 A、C、G、T 在突变混池中的频率，Awt、Cwt、Gwt、Twt分别表示碱基 A、C、G、T 在野生型混池中的频率。index 算法用于寻找混池之间变异位点基因型频率显著差异的位点，变异位点与性状关联度越强，则index 越接近于 1。index 值计算方法如下：index(aa)=Maa/(Maa+Paa)index(ab)=Mab/(Mab+Pab)index=index(aa)-index(ab)式中，Maa（Mab）表示 aa（ab）池来源于母本的深度，Paa（Pab）表示 aa（ab）池来源于父本的深度。对关联分析结果区域应用 BLAST 软件在 NR46、Swiss-Prot、GO47、COG48、KEGG49等数据库中对候选区域编码基因进行匹配和注释。1.6 基因定位 利用 Misa 软件在 BSA 候选区域检索 SSR 位点，通过 SoyBase（https:/soybase.org/）网站从大豆参考基因组（Wm82.a2.v1）提取位点上下游 200 bp 序列，使用 NCBI 网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）进行引物设计（电子附表 1）。将 DNA用 ddH2O 稀释至 50 ngL-1后用于 PCR 反应。使用96孔板配置50 L反应体系，包括25 L 2Rapid Taq Master Mix（#P222，Vazyme）、1 L 稀释后的 DNA、各 2 L 的正向和反向引物（10 molL-1），以及 20 L ddH2O。在 BIO-RED T100 PCR 仪上进行反应，反应程序为 95 3 min；95 15 s，57 15 s，72 1 5 s，35 个循环；72 5 min。PCR 产物经 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，银染后读取基因型。1.7 qRT-PCR 分析 使用 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）网站设计引物（电子附表 2）。每个样品取 1 000 ng 总 RNA 使用逆转录试剂盒 HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper，#R323，Vazyme）进行逆转录，产物经无核酸酶水稀释至 1 ngL-1后用于 qRT-PCR 分析。使用 Hard-Shell 384孔板（BIO-RAD）配置 20 L 反应体系 10 L Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（#Q712，Vazyme）、14 期 曹杰等：大豆红色种皮的色素鉴定和基因定位 2647 5 L 稀释后的 cDNA、各 2 L 的正向和反向引物（10 molL-1），以及 4.2 L 无核酸酶水。在 QuantStudio 7 Flex 上进行反应。反应程序为 95 30 s；95 10 s，60 30 s，40 个循环；熔解曲线分析为 95 10 s，60 60 s，95 15 s。以无模板反应作为阴性对照，每个反应设置 3 个技术重复。1.8 数据分析 利用卡方分析检验群体的分离比例，计算方法如下：=EEOX22)(式中，O 表示实际频数，E 表示理论频数。使用-Actin 作为内参基因，根据 2-Ct方法计算 qRT-PCR 反应中目的基因的相对表达量，采用 log2计算以后的 FPKM 值绘制热图。用 GraphPad Prism 9（v9.4.1）软件进行统计分析和绘图。2 结果 2.1 种皮花青素含量差异 2.1.1 不同发育阶段的种皮颜色分析 从开花后第30 天开始对 SN14 和 TXAJH 的种皮颜色进行以 10 d为间隔的连续观察直至种子脱水成熟（第 70 天）。如图 1 所示，在第 40 天以前，二者种皮均为绿色，从第50 天开始，SN14 种皮逐渐变黄而 TXAJH 种皮则出现红色且逐渐加深，表明导致二者种皮颜色差异的代谢物在第 40 天以后才开始出现明显积累。图 1 SN14 和 TXAJH 不同时期种皮颜色 Fig.1 Seed coat color of SN14 and TXAJH in different periods 2.1.2 种皮着色过程花青素含量分析 为了解种皮发育过程中花青素的含量变化，利用 UPLC-ESI-MS/MS 方法检测了 SN14 和 TXAJH 在开花后第 40、50、60 和 70 天的种皮花青素成分。对 SN14 和 TXAJH各时期种皮样本的总花青素进行层次聚类分析，以了解各组样本之间花青素的总体差异和组内样本之间的重复性。如图 2-A 所示，花青素总成分的聚类分析将SN14 与 TXAJH 分别聚为一类，TXAJH 显色前后的种皮也分别聚为一类。各组样本间的重复性良好，但SN14 第 60 天的 1 个生物重复样本（S_60_2）与第 50天的样本（S_50_1,2,3）聚到一起，表明前者在组间的相似性高于组内，因此，将 S_60_2 样本剔除再进行后续分析。在 SN14 和 TXAJH 各时期的种皮中共检测到 12种花青素。如图 2-B 所示，在种子成熟过程中花青素总含量随种皮颜色变化而变化。TXAJH 种皮内花青素含量在着色前较低，第 50 天出现激增并继续升高，在第 60 天以后含量稳定；而 SN14 种皮内花青素含量较低，且随着种子的成熟持续下降。这一趋势与 SN14和 TXAJH 种皮颜色变化情况一致，表明种皮颜色与种皮花青素含量相关。在被检测的4个时期中，TXAJH种皮的色素含量始终高于 SN14，种皮显色后这一差异达到极显著水平。红色时期的 TXAJH 种皮中含量占比最高的 3 种花青素分别是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside，Cy-3-glu）、芍药花素-3-O-葡萄糖苷（Peonidin-3-O-glucoside，Pn-3-glu）和牵牛花素-3-O-葡萄糖苷（Petunidin-3-O-glucoside，Pt-3-glu）；而 SN14 则分别为矢车菊素（Cyanidin，Cy）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（Pelargonidin-3-O-beta-D-glucoside，Pg-3-glu）和锦葵色素-3-O-葡萄糖苷（Malvidin-3-O-glucoside，Mv-3-glu）。2 组花青素的总含量在成熟种子的种皮中相差超过 200 倍。由此推测 Cy-3-glu、Pn-3-glu 和 Pt-3-glu 3 种花青素是导致TXAJH 种皮显示红色的重要原因。2648 中 国 农 业 科 学 56 卷 SN14 TXAJH花青素含量 Content of anthocyanins*矮牵牛素-3-O-芸香糖苷Petunidin-3-O-rutinoside矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷Petunidin-3-O-glucoside芍药花素-3-O-葡萄糖苷Peonidin-3-O-glucoside芍药花素-3,5-二葡萄糖苷Peonidin-3,5-O-diglucoside天竺葵素-3-O-D-葡萄糖苷Pelargonidin-3-O-beta-D-glucoside锦葵素-3-O-葡萄糖苷Malvidin-3-O-glucoside飞燕草素-3-O-葡萄糖苷Delphinidin-3-O-glucoside飞燕草素Delphinidin矢车菊素-3-O-半乳糖苷Cyanidin-3-O-galactoside矢车菊素-3-(6-丙二酰葡萄糖苷)Cyanidin-3-O-(6-Malonylglucoside)矢车菊素Cyanidin40 d50 d60 d70 d47%37%12%Other 4%76%21%3%Other 0%GroupB*SN14 TXAJHSN14 TXAJHSN14 TXAJH011042104510511061.51063104矢车菊素-3-O-葡萄糖苷Cyanidin-3-O-glucoside121086420S_70_3S_70_1S_70_2S_40_3S_40_1S_40_2S_60_2S_50_2S_50_1S_50_3S_60_1S_60_3T_40_1T_40_2T_40_3T_70_2T_70_1T_70_3T_50_1T_50_2T_50_3T_60_1T_60_2T_60_3S_40S_50S_60S_70T_40T_50T_60T_70A A：种皮总花青素聚类分析，横坐标为不同样本之间的距离，纵坐标为样本编号，其中，S：SN14；T：TXAJH，字母后数字分别表示相应时期和生物重复，不同样本的组别通过颜色区分。B：种皮发育过程花青素含量分析，柱形图表示花青素含量，饼图表示 70 d 时花青素在 SN14 和 TXAJH 中的相对占比，同一花青素用相同颜色填充，*表示差异极显著（P0.01）A:Cluster analysis of the anthocyanin composition of the seed coat,horizontal coordinates are distances between samples,vertical coordinates are sample numbers,where S for SN14,T for TXAJH,and the numbers after the letters indicate the corresponding periods and biological replicates,respectively,and the groups of different samples are distinguished by color.B:Analysis of anthocyanin content during seed coat development,bar graphs indicate anthocyanin content and pie charts indicate the relative proportions of anthocyanins in SN14 and TXAJH at 70 d,the same anthocyanins are filled with the same colour.*indicates highly significant difference(P0.01)图 2 种皮花青素分析 Fig.2 Analysis of seed coat anthocyanins 14 期 曹杰等：大豆红色种皮的色素鉴定和基因定位 2649 2.2 BSA-seq 初步定位候选区间 2.2.1 种皮色性状的遗传分析 前期以黄色种皮品种 SN14 和红色种皮品种 TXAJH 为亲本通过杂交和单粒下传的方式最终构建了 F9 RIL 群体。其中，F1种皮颜色为黄色，表明种皮颜色性状黄色相对红色为显性。在 F9 RIL 群体中，黄色种皮的品系共 109 个，红色种皮的品系共 79 个。如表 1 所示，卡方值 2=4.5562(0.05,1)=3.841，表明种皮颜色性状分离比不符合预期的 31，即红色种皮基因受 2 对及以上的等位基因控制。表 1 种皮色性状遗传分析 Table 1 Genetic analysis of seed coat color traits 杂交组合杂交组合 Combinations 世代世代 Generation 黄色种皮数量黄色种皮数量 Number of yellow 红色种皮数量红色种皮数量 Number o