代谢组分析不同碳源对铜绿假单胞菌ZS1代谢的影响.pdf

浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷文章编号押 2096原4730穴圆园23雪园3原0338原08代谢组分析不同碳源对铜绿假单胞菌 ZS1 代谢的影响马昀灏，张增平，杨支力，刘建华(浙江海洋大学海洋科学与技术学院，海洋生物基因工程实验室，浙江舟山316022)摘要：通过代谢组学分析了解葡萄糖培养基与 YE 培养基中培养的 ZS1 菌株生物合成鼠李糖脂的规律。发现 Eetner-Doudoroff 通路和 EMP 通路下游的代谢产物表达上调，而 EMP 通路上游和磷酸戊糖氧化途径的代谢产物表达下调。同时，丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的代谢产物表达上调，参与 TCA 循环的代谢产物表达下调。结果表明，与 YE 培养基相比，葡萄糖培养基培养的 ZS1 细胞将葡萄糖转化为乙酰辅酶 A 的酶活性有所提高。此外，在葡萄糖培养基中培养的 ZS1 细胞内，3-羟基癸酸酯(3-羟基癸酸衍生物)大量积累，这表明鼠李糖脂的合成受到 dTDP-鼠李糖的限制，但不受 3-羟基癸酸的限制。综上所述，葡萄糖培养基中培养的 ZS1 鼠李糖脂的促进作用受到 dTDP-鼠李糖的限制，研究结果为研究 ZS1 鼠李糖脂生物合成的调控机制提供了新的思路。关键词：假单胞菌；生物表面活性剂；代谢组学中图分类号：Q591.9文献标识码：AMetabolome Analysis of the Effects of Carbon Sources on theMetabolism of Pseudomonas aeruginosa ZS1MA Yunhao,ZHANG Zengping,YANG Zhili,et al(School of Marine Science and Technology of Zhejiang Ocean University,Laboratory of Marine BiologicalGenetic Engineering,Zhoushan316022,China)Abstract:In this study,we performed metabolomic profiling to understand regulations of rhamnolipidbiosynthesis in ZS1 cultivated in glucose medium compared to that in YE medium.We showed that metabolitesinvolved in Eetner-Doudoroff and lower part of Embden-Meyerhof-Parnas pathways were upregulated,whilethose in upper part of Embden-Meyerhof-Parnas pathway and oxidative pentose phosphate pathway weredownregulated.Meanwhile,metabolites involved in pyruvate conversion into acetyl-coA were upregulated,while those involved in TCA cycle were downregulated.These results indicated that enzymatic activities toconvert glucose into acetyl-coA in ZS1 cells cultivated in glucose medium are increased compared to that inYE medium.Furthermore,metabolomic analysis indicated an increased level of 3-hydroxydecanoate,a derivativeof 3-hydroxydecanoyl-ACP in ZS1 cells cultivated in glucose medium.Notably,decanoyl-hydroxydecaoate,aderivative of 3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate,was greatly accumulated,suggesting that rhamnolipid收稿日期：2022-05-27基金项目：国家自然科学基金面上项目(31571392)作者简介：马昀灏(1994-)，男，山东枣庄人，硕士研究生，研究方向：海洋微生物.通信作者：刘建华.Email:浙江海洋大学学报穴自然科学版雪允燥怎则灶葬造 燥枣 在澡藻躁蚤葬灶早 韵糟藻葬灶 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠穴晕葬贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻雪第 42 卷 第 3 期圆园23 年 5 月Vo1.42No.4Jul.,2023第 4 期synthesis in ZS1 cells cultivated in glucose medium is limited by dTDP-rhamnose but not 3-hydroxydecanoateor 3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate.This notion was supported by the observation that addition ofvegetable oil supplement didn忆t increase rhamnolipid production by ZS1.Taken together,our results demonstratethat enhancement of rhamnolipid production by ZS1 in glucose medium is limited by dTDP-rhamnose.Thisanalysis provides insights into mechanisms for regulation of rhamnolipid biosynthesis in ZS1.Key words:Pseudomonas;biosurfactant;metabolomics鼠李糖脂是去除原油污染最有效的生物表面活性剂之一，能够有效地乳化石油，加快微生物降解污染的石油，它包含 1 个糖基和 1 个脂基1-2。其中糖基部分的前体是 dTDP-鼠李糖，由葡萄糖-1-磷酸经葡萄糖-1-磷酸基转移酶 RmlA、dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶 RmlB、dTDP-4-脱鼠李糖 3,5-异二甲基酶 RmlC和 dTDP-脱鼠李糖还原酶 RmlD 等一系列酶催化而成3-4。脂质部分的前体是 3-羟基癸酰-ACP，一类 FAS-II代谢的中间体。在 3-羟基癸醇-3-羟基癸酸(HAA)转酰基酶 RhlA 催化下，两分子 3-羟基癸酰-ACP 酯化生成 3-羟基癸酸酯5-9。鼠李糖基转移酶-1RhlB 催化 dTDP-鼠李糖和 HAA 形成单鼠李糖脂分子5,7。鼠李糖基转移酶-2 RhlC 向单鼠李糖脂添加 1 个鼠李糖分子催化形成双鼠李糖脂10。代谢组学主要应用于探究相对分子质量小的分子物质，如多糖、脂质、蛋白质等次生代谢物和终产物，这些小分子物质不仅能够体现细胞内部生理代谢的变化，也表现出细胞对外界因素如营养、药物等的影响11。目前对鼠李糖脂的代谢研究比较广泛12-13，然而培养基中不同碳源对鼠李糖脂代谢影响的研究较少。本课题组前期从舟山海域油污泥中筛选出 1 株能被葡萄糖诱导高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌 ZS1。为了解不同碳源下生长的 ZS1 菌株次生代谢物质变化，通过代谢组分析来探究不同碳源对 ZS1 合成鼠李糖脂的影响。结果发现，在以葡萄糖(Glc)为唯一碳源的培养基中，ZS1 更倾向于将葡萄糖转化为乙酰辅酶A，而不是 ATP。另外，与酵母提取物 YE 相比，ZS1 在葡萄糖作为唯一碳源的情况下产生更多的鼠李糖脂的同时生物量更少，这些结果为 ZS1 合成鼠李糖脂的机制提供理论支持，也有助于今后优化 ZS1 大规模生产鼠李糖脂的条件。1 材料与方法1.1 ZS1 菌株的培养及生物量测定ZS1 菌株在矿物盐培养基 MS(NaNO34 g L-1，CaCl20.01 g L-1，Na2HPO40.6 g L-1，KH2PO40.2 g L-1，FeSO4 7H2O 0.018 g L-1，MgSO40.615 g L-1)中培养，额外添加 2%酵母提取物(YE)或 2%葡萄糖(Glc)作为碳源。用比色法(colorimetric method)14测量 OD600处的吸收值来估计细胞密度，使用称重法(细胞干重)15估计生物量。每个取样点做 3 次生物学重复。1.2 表面活性检测鼠李糖脂是一种表面活性剂，可采用油扩散试验16半定量地估计其活性，所测量排油圈面积大小可以近似与每个时间点鼠李糖脂的量对应。实验方法如下：将 50 mL 蒸馏水加入直径 15 cm 的培养皿中，随后将 20 滋L 原油添加到水面上，静置 20 s 待其展开形成薄层。然后再次在水面上添加 5 滋L 原油，在表面形成稳定的油滴，将 5 滋L 上清液滴在油滴的中心，等待 30 s，拍摄记录形成的排油圈区域(oil-spreading zone,OSZ)面积大小。使用 Image J(http:/www.imagej.nih.gov)分析 OSZ 和培养皿的像素点(Pixel)，OSZ 的面积计算公式为 AreaOSZ=AreaDISH(PixelOSZ/PixelDISH)，其中 AreaOSZ和 AreaDISH分别代表 OSZ 和培养皿面积；PixelOSZ和PixelDISH分别为 Image J 软件统计出的 OSZ 和培养皿的像素点。1.3 代谢组学检测和分析方法样品准备：湿细胞(50 滋L)与 200 滋L 预冷的 80%甲醇混合超声处理 6 min。所得混合物用液氮研磨，匀浆用预冷的 80%甲醇和 0.1%甲酸再悬浮。样品在冰中孵育 5 min，然后离心(4 益，15 000 r min-1,5 min)。马昀灏等：代谢组分析不同碳源对铜绿假单胞菌 ZS1 代谢的影响339浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷上清液用 LC-MS 级水稀释至甲醇最终浓度为 53%。将样品转移到洁净的离心管中离心(4 益，15 000 r min-1,5 min)，最后将上清液注入 LC-MS/MS 系统进行分析。UHPLC-MS/MS 程序：采用 Vanquish UHPLC 系统(Thermo Fisher)结合 Orbitrap Q Exactive 系列质谱仪(Thermo Fisher)进行 LC-MS/MS 分析。样品以 0.2 mL min-1的流速，16 min 的线性梯度注入 Hyperil Gold 色谱柱(100伊2.1 mm,1.9 滋m)。正极性模式洗脱液为洗脱液 A(0.1%甲酸)和洗脱液 B(甲醇)。负极性模式洗脱液为洗脱液 A(5 mmol L-1乙酸铵，pH 9.0)和洗脱液 B(甲醇)。溶剂梯度设置为：2%B，1.5 min；2%耀100%B，12 min；100%B,14 min；100%耀2%B，14 min；2%B，17 min。在正/负极性模式下，喷雾电压 3.2 kV，毛细管温度 320 益，鞘气流量 35 arb，辅气流量 10 arb。数据库检索：使用 Compound Discoverer 3.1(CD3.1,Thermo Fisher)对 UHPLC-MS/MS 生成的原始数据文件进行处理，对每个代谢物进行峰排列、峰提取和定量。然后，将峰强度归一化为总光谱强度。利用归一化后的数据，根据添加离子、分子离子峰和碎片离子预测分子式。使用统计软件 R(v3.4.3)、Python(v2.7.6)在CentOS(v6.6)系统中进行统计分析，当数据不是正态分布时，尝试使用面积归一化方法进行正态转换。数据分析：使用 KEGG 数据库(http:/www.genome.jp/kegg/),HMDB 数据库(http:/www.hmdb.ca/)和Lipidmaps 数据库(http:/www.lipidmaps.org/)对代谢组数据进行注释。在 metaX 上进行主成分分析(PCA)。应用单变量分析(t 检验)来计算统计显著性(P-value)，并在多个检验中使用 BH 校正17进行调整。2 结果2.1 不同碳源培养 ZS1 的产鼠李糖脂水平和生物量比较使用细胞干重(CDW)衡量细胞最大密度，发现 YE 作为碳源的 MS 培养基中细胞干重(4.2 g L-1，P0.05，n=3)较 Glc(3 g L-1，P0.05，n=3)增长了 1.4 倍(图 1A)。而 Glc 作为碳源的培养基单位体积上清液生物表面活性剂活性水平(160 cm2 滋L-1，P0.05，n=3)较 YE 培养提高了 6 倍(26.5 cm2 滋L-1，P0.05，n=3)(图 1B)。依照鼠李糖脂分子的浓度标准曲线，估计 Glc 和 YE 培养上清中鼠李糖脂的数量分别为 3%(或30 g L-1)和 0.5%(或 5 g L-1)。结果表明，Glc 培养的 ZS1 的鼠李糖脂能量转化率和细胞生物量(10 RL/CDW，P0.05，n=3)比 YE 培养的 ZS1 高 8.4 倍(1.19 RL/CDW，P2，P1.25，P1.25，P1.2)，说明 ED 通路可能被激活(图 3B)。为验证这种可能性，研究了这些途径中涉及的酶的转录变化。研究342第 4 期BACLevelRatio1.26Pyruvate1.24Gluconate-6PYEGlc/YEFCCpd约-8 0 跃8(log 10)约-4 0 跃4(log 2)12EnzymeECFCLevelRatioGrpGlc/YENo.YE123.13.24567.17.28910111213.113.214.114.215161718.118.21920212223242526约-3 0 跃3(log 10)约-2 0 跃2(log 2)4.701.882.971.022.931.692.242.220.433.701.773.551.931.144.322.680.420.400.891.010.146.050.410.400.220.460.720.390.551.070.29OPRB1.1.5.21.1.99.31.1.99.3GNTPKGUT2.7.1.21.1.1.491.1.1.493.1.1.312.7.1.122.7.1.131.1.1.434.2.1.124.1.2.144.1.2.141.2.1.121.2.1.122.7.2.35.42.124.2.1.112.7.1.402.7.1.405.3.1.14.1.2.133.1.3.115.3.1.95.1.3.15.3.1.62.2.1.12.2.1.2Outer-membrane porin OprBOuinoprotein glucose DHaseGluconate 2-DHaseGluconate 2-DHaseGluconate transpotrer2-Kelogluconate transporterGlicokinaseGlucose-6P 1-DHaseGlucose-6P 1-DHase6-phosphogluconolactonaseGluconokinsae2-Kelogluconate kinase2-Kelogluconate 6P reductasePhosphogluconate dehydratase2-deH-3-deO-P-gluconate aldolase2-deH-3-deO-P-gluconate aldolaseGlyceraldehyde-3PDHaseGlyceraldehyde-3PDHasePhosphogycerate kinasePhosphogycerate mutaseEnolasePyruvate kinasePyruvate kinaseTniosephosphate isomeraseFructose-bisphosphate aldolaseFructose-1,6-bisphosphataseGlucose-6-phosphate isomeraseRibulose-phosphate 3-epimeraseRibose 5-phosphate isomerase ATransketolaseTransaldolase发现，参与 ED 从葡萄糖到磷酸甘油醛通路的 13 个拷贝中的 12 个酶中度上调(FC1.2，P=2.33e-04)(图3C，见 ED)。相比之下，参与从葡萄糖到甘油醛-3-磷酸的 EMP 通路上部的 5 个拷贝中的 4 个中度下调(FC1.2，P=1.24e-03)(图 3C，见 EMP-up)。另外，参与 OPP 通路的酶的 4 个拷贝中有 3 个被中度下调(FC1.2，P=3.39e-03)(图 3C，见 OPP)。这些结果支持了 ED 通路优先用于葡萄糖分解的观察。此外，在 EMP 途径下部分(从 G3P 到丙酮酸)的 4 个反应中的 3 个是由至少 1 个拷贝的催化酶的转录水平不减少(图 4c，见EMP-lw)，结果表明，与 EMP 通路的上半部分不同，在葡萄糖培养基中培养的 ZS1 中，EMP 通路的下半部分的活性没有明显降低。通过代谢组学分析发现，在丙酮酸轻度上调(FC1.2)的同时，TCA 循环环路中的 3 种化合物(S)-苹果酸、延胡索酸和柠檬酸均下调(FC1.2)(图 4A 和 4B)。TCA 循环中编码酶的 18 个基因拷贝中有 16 个被下调(FC1.2，P=1.18e-03)(图 4C，见 loop)。代谢组学数据表明，从葡萄糖中产生的丙酮酸优先用于产生乙酰辅酶 a，这是用于脂肪酸从头生物合成的基石，而不是在 TCA 循环中减少 NADH。(A)ED 通路、OPP 通路、EMP 通路示意图。红色、灰色和绿色圆圈分别表示中度增加、不变和减少的化合物。未被检测的化合物表示为开环。差异增加和减少的化合物分别用红色和绿色圆线表示。酶的 EC number 的红色、灰色和绿色轮廓分别表示酶转录本的适度增加、不变和减少。未检测到的酶没有 EC number 的轮廓。酶的差异增加和减少分别用红色和绿色 EC 数表示。不同的颜色比例反映了多拷贝酶的不同变化。(B)在(A)中发现的化合物的热图。显示了平均折射率变化(FC)和化合物名称(cpd)。(C)在(A)中发现的酶的热图。从左至右分别为在 1 个代谢通路中酶的组(Grp)，倍数变化(FC)，EC 数，酶的名称。图 3参与 entner-doudoroff(ED)途径、氧化戊糖磷酸(OPP)途径和 embden-meyer-parnas(EMP)糖酵解途径的代谢产物和酶的变化Fig.3Alteration of metabolites and enzymes involved in the entner-doudoroff(ED)pathway,oxidative pentose phosphate(OPP)pathway,and embden-meyerhof-parnas(EMP)glycolytic pathway4.1.2.134.2.1.112.7.1.404.1.2.14OPRBPyruvateGluconate-6PPyruvateGlucoseGlucoseGluconateGlucoseGluconate1.1.5.2GCT2-KetogluconateCytoplasm2-KetogluconateMediumPeriplasm2-Oxo-3-deoxygluconate-6PRibulose-5P1.1.1.445.3.1.6Ribose-5P5.1.3.1Glycer-aldehyde-3PXylu-lose-5PEDGluconolactone-6PGlucose-6P2.7.1.21.1.1.494.2.1.125.3.1.92.7.1.121.1.1.432.7.1.131.1.99.33.1.1.313.1.3.115.3.1.11.2.1.12Fructose-6PFructose-1,6-bPDihydroxyacetone-PGlycerate-1,3-bPEMP-uPEMP-lWGlycerate-3P2.7.2.3P-enoPyruvate5.4.2.122-Ketogluconate-6PGlNTPOPP2.2.1.1Glyceralde-hyde-5PSedoheptulose-7PEryth-rose-4PFructose-6PFructose-6PXylulose-5PKGUT马昀灏等：代谢组分析不同碳源对铜绿假单胞菌 ZS1 代谢的影响343浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷3 讨论鼠李糖脂是研究最深入的生物表面活性剂之一1-2。在本文中，通过 UHP LC-MS/MS 非靶向代谢组学分析表明，在葡萄糖培养基培养的假单胞菌 ZS1 中，鼠李糖脂的产生受 dTDP-鼠李糖限制，不受 3-羟基癸酸及其衍生物的限制。假单胞菌通过 ED 途径分解葡萄糖18-19，本文证明了，与 YE 培养基相比，使用葡萄糖培养基培养的 ZS1 菌株，其 Eetner-Doudoroff(ED)通路和糖酵解途径下游的代谢产物上调，而糖酵解途径上游和氧化戊糖磷酸通路的代谢产物下调。同时，参与丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的代谢产物上调，而参与 TCA 循环的代谢产物下调。这些结果表明，在葡萄糖培养基中培养的 ZS1 细胞将葡萄糖转化为乙酰辅酶 A 的酶活性比在 YE 培养基中更高。而在葡萄糖培养基培养的 ZS1 细胞中，TCA 循环环路中的酶和代谢物均发生下调。下调 TCA 循环，同时下调核糖体蛋白、氧化磷酸化，表明 ZS1 细胞在葡萄糖培养基中获得的能量并没有被积极地用于细胞生长所需的 ATP 的产生。相反，能量流倾向于合成乙酰辅酶 A，这是从头合成游离脂肪酸的基石(图 4)。此外，代谢组学分析表明，游离脂肪酸水平降低，相反，3-羟基癸酸酯的含量增加。这些结果表明，脂肪酸代谢活性的增加似乎会增加鼠李糖脂前体分子的合成，但不会增加游离脂肪酸的合成。同时负责合成dTDP-鼠李糖的酶被下调。这解释了 ZS1 细胞中观察到 3-羟基癸酸及其衍生物的积累是因为鼠李糖脂合成酶 rhlB 和 rhlC 的上调。最后，与 YE 培养液相比，葡萄糖培养基中 ZS1 生物量较少，但产生的鼠李糖脂较多。ZS1 在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中，促进了葡萄糖转化为乙酰辅酶 A 的活性，而不促进转化为 ATP。脂肪酸代谢活性的增加导致鼠李糖脂前体 3-羟基癸酸酯及其衍生物的积累，不导致游离脂肪酸的积累。脂质部分前体的积累归因于 dTDP-鼠李糖生物合成的减少。综上所述，葡萄糖对 ZS1 合成鼠李糖脂具有重要的促进作用。BAC(A)TCA 循环示意图。红色、灰色和绿色圆圈分别表示中度增加、不变和减少的化合物。未被检测的化合物表示为开环。差异增加和减少的化合物分别用红色和绿色圆线表示。酶的 EC number 的红色、灰色和绿色轮廓分别表示酶转录本的适度增加、不变和减少。未检测到的酶没有 EC number 的轮廓。酶的差异增加和减少分别用红色和绿色 EC 数表示。不同的颜色比例反映了多拷贝酶的不同变化;(B)在(A)中发现的化合物的热聚图;(C)在(A)中发现的酶的热聚图。图 4参与 TCA 循环的代谢产物和酶的变化Fig.4Alteration of metabolites and enzymes involved in the TCA cycleLevel Ratio1.26 Pyruvate0.25(S)-Malate0.24 Fumarate0.37 CitrateYE Glc/YE FCCpd约-8 0 跃8(log 10)约-3 0 跃3(log 2)1234YE6.050.411.361.260.647.801.390.852.621.150.290.290.070.550.451.881.420.570.120.100.080.070.170.530.170.180.170.190.250.250.292.7.1.402.7.1.401.2.4.11.2.4.11.2.4.12.3.1.122.3.1.122.3.1.121.8.1.41.8.1.44.1.1.496.4.1.16.4.1.11.1.5.41.1.5.44.2.1.24.2.1.24.2.1.21.3.5.11.3.5.16.2.1.56.2.1.51.2.4.22.3.1.611.8.1.41.1.1.421.1.1.424.2.1.32.3.3.14.1.3.12.3.3.91.11.22.12.22.33.13.23.34.14.256.16.27.17.28.18.28.39.19.210.110.211121314.114.215161718约-3 0 跃3(log 10)约-4 0 跃4(log 2)Pyruvate kinasePyruvate kinasePyruvate DHase E1 beta subunitPyruvate DHase E1 alpha subunitPyruvate DHase E1Dihydrolipoyl acetyltransferaseDihydrolipoyl acetyltransferaseDihydrolipoyl acetyltransferaseDihydrolipoamide DHaseDihydrolipoamide DHasePhosphoenolpyruvate carboxykinasePyruvate carboxy transferase subunit APyruvate carboxy transferase subunit BMalate:quinone 佼xidoreductaseMalate:quinone oxidoreductaseFumarate hydratase class IlFumarate hydratase class IIFumarate hydratase class ISuccinate dehydrogenase flavoprotein subunitSuccinate dehydrogenase iron-sulfur proteinSuccinyl-CoA ligase beta chainSuccinyl-CoA ligase alpha chain2-Oxoglutarate DHase E1Dihydrolipoamide succinyltransferase E2Dihydrolipoamide DHaseIsocitrate DHaseIsocitrate DHaseAconitate hydrataseCitrate synthaseIsocitrate IvaseMalate synthaseEnzymeECFCLevel RatioGrpGlc/YENo.YETCA cycle1.2.4.11.8.1.42.3.1.122.7.1.40P-enol-pyruvate4.1.1.496.4.1.1PyruvateAcetyl-CoA1.1.5.4Lipid met.Oxalo-acetateCitrate4.2.1.32.3.3.9(S)-malateGlyoxylatelsocitrateFumarate4.2.1.21.3.5.1/41.1.1.426.2.1.51.2.4.21.1.1.421.8.1.44.1.3.1SuccinateSuccinyl-CoA2.3.1.612-OxoglutarateOxalosac-cinate344第 4 期参考文献：1 ABDEL-MAWGOUD A M,HAUSMANN R,L魪PINE F,et al.Rhamnolipids:Detection,Analysis,Biosynthesis,GeneticRegulation,and Bioengineering of ProductionM/SOBER譫N-CH譧VEZ 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