大白猪PGAM2基因多态性与生长繁殖性状的关联分析 (1).pdf

-237-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 大白猪PGAM2基因多态性与生长繁殖性状的关联分析陈 鑫1，罗 柯1，李清春1，卢世豪1，赵玉强2*，黄 涛1,3*（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.乌鲁木齐正大畜牧有限公司博士后科研工作站，新疆乌鲁木齐 830000；3.新疆生猪种业工程技术研究中心，新疆昌吉 831100）摘 要：实验旨在挖掘大白猪磷酸甘油酸变位酶2（PGAM2）基因单核苷酸多态位点（SNPs），分析遗传多样性、连锁不平衡程度及其不同基因型与生长、繁殖性状的相关性。选取大白母猪 316 头，提取 DNA，采用混合DNA 样本 PCR 扩增产物测序，确定PGAM2基因 SNPs 位点。采用多重 PCR 靶向基因捕获技术对每个个体进行目标 SNPs 位点分型，并分别与大白猪初产和经产的总产仔数、产活仔数、木乃伊数和死胎数进行关联分析，与大白猪生长性状的达 100 kg 日龄、达 100 kg 背膘厚、达 100 kg 眼肌厚和初生重进行关联分析。共鉴定出 5 个突变位点，均为已知 SNP，其中 rs331014516 和 rs346188790 位点为稀有突变，不适合用作分子标记；所有位点均处于 Hardy-Weinberg 平衡（P0.05）；rs331014516 与 rs346188790 完全连锁，rs80977507与 rs80902904 完全连锁且与 rs343549757 强连锁；rs80977507 及其完全连锁位点与初产母猪总产仔数、产活仔数显著相关；rs343549757 位点与大白猪经产死胎数显著相关。这 5 个位点的基因型与大白猪达 100 kg 日龄、达 100 kg 背膘厚、达 100 kg 眼肌厚和母猪出生重均无显著相关。本研究在大白猪群体共鉴定出 5 个PGAM2基因突变位点，4 个 SNP 两两完全连锁；筛选到 3 个与繁殖性状显著相关的突变位点，为大白猪的分子标记辅助选育提供了参考依据。关键词：大白猪；PGAM2基因；SNPs；生长性状；繁殖性状中图分类号：S828.2 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20220627-04磷酸甘油酸变位酶（PGAM）是一种管家酶，在糖酵解过程中负责催化 3-磷酸甘油酸转化为 2-磷酸甘油酸以释放能量。除了主要的变位酶活性外，PGAM 还具有 2,3-二磷酸合成酶或 2,3-二磷酸甘油酸变位酶活性和 2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶活性1。依据对辅因子的依赖性，PGAM 分为不需要辅因子的 iPGAM（主要存在于植物、真菌和细菌）和需要辅因子的 dPGAM（主要存在于所有脊椎动物和大多数无脊椎动物）。两者序列没有显著相似性，催化机制和三维结构也不相同2。在哺乳动物组织中，辅因子2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPGA）通过使组氨酸发生磷酸化，从而活化 dPGAM。dPGAM存在 2 个不同亚基，即 B 型（脑型，也称为 PGAM1）和 M 型（肌肉型，也称为 PGAM2），同型二聚体 MM主要存在于肌肉中，BB 型主要存在于肝、肾和脑，而异形二聚体 BM 型主要在心脏中发现4。PGAM2 在骨骼肌中特异性高表达，参与骨骼肌中的糖酵解过程。猪PGAM2基因定位于 18 号染色体，包括 3 个外显子和 2个内含子，CDS 区为 762 bp，编码 253 个氨基酸，其氨基酸序列与人的相似性为 96%，与大鼠和小鼠的相似性为 94%3。人PGAM2基因定位于人染色体 7p12-7p13，与猪PGAM2基因具有同源性5-6。人类中已经证明，一些突变会导致 PGAM2 缺乏，从而导致急性肌肉功能障碍，伴随有运动不耐受和肌肉分解7-10。猪 QTL 数据库中，PGAM2基因所在的染色体区域存在与屠宰率、脂肪率、瘦肉率和肌肉纤维直径相关的QTL11-12。因此，PGAM2是影响骨骼肌发育相关性状收稿日期：2022-06-27；修回日期：2022-07-28资助项目：中国博士后科学基金（2019M663961XB）；国家国际科技合作项目（2014DFA31840）作者简介：陈鑫（1997-），男，重庆人，硕士研究生，专业方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail:*通讯作者：赵玉强（1984-），男，新疆乌鲁木齐人，博士，主要从事生猪遗传改良和种猪繁育研究，E-mail：1105336407 ；黄涛（1978-），男，湖北随州人，博士，教授，从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：-238-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期的候选基因，值得进一步研究。KEGG PATHWAY 数据库注释PGAM2基因参与糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、氨基酸的生物合成（Biosynthesis of Amino Acids）和胰高血糖素信号通路（Glucagon Signaling Pathway）。董丽13在核受体 4A 亚家族成员1（Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 1，NR4A1）对卵巢颗粒细胞糖和脂代谢调节研究中发现，过表达NR4A1基因与外源添加胰岛素和胰岛素增敏剂均能显著提高小鼠卵巢颗粒细胞PGAM2基因的表达，推测PGAM2基因在颗粒细胞生长发育过程中发挥代谢调控作用。以上研究提示，PGAM2基因可能与猪生长繁殖性状相关。目前，PGAM2基因多态性与大白猪生长、繁殖性状的关联分析未见报道。鉴于此，本实验以大白猪为研究对象，应用混池 PCR 扩增，通过 Sanger测序挖掘多态位点，结合基于多重 PCR 的靶向捕获技术（GenoPlexs）对实验个体进行基因分型，并与实验群体的生长、繁殖性状进行关联分析，挖掘与生长繁殖性状显著关联的 SNP 位点，以期为大白猪的分子标记辅助选育提供数据支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 从新疆某公司所属猪场选取具有生长、繁殖记录的健康经产大白母猪 316 头。1.1.2 实验器材与仪器 梯度 PCR 仪（SensoQuest，德国）、NanoDrop 2000 型超微量分光光度计（Thermo Fisher，德国）、TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）（天根，中国）。1.2 方法1.2.1 实验样品采集 利用耳缺钳收集上述大白母猪的耳缘组织于 1.5 mL 离心管中，耳缺钳每次使用后先用酒精棉球擦拭污渍，再用酒精喷壶喷洗以避免交叉污染；记录离心管编号，与母猪耳标个体号对应。1.2.2 DNA 提取 使用眼科剪将耳组织剪碎后，遵照天根组织基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）说明书上的步骤提取 DNA。完成后分别用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 2000 型超微量分光光度计进行 DNA 完整性、浓度和纯度检验，条带完整明亮且浓度纯度均合格的样品用于后续实验。1.2.3 引 物 设 计 与 合 成 从 Ensembl 数 据 库 下 载 猪PGAM2基因全长序列（Gene ID:ENSSSCG00000016 720），利用 Primer 5.0 软件设计引物用于扩增上述基因的各个外显子区域，利用 NCBI primer-BLAST 在线网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）预测引物特异性，选择合适的引物序列交由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表 1。1.2.4 混池建库与 PCR 测序 从样本库中随机选取 40 头大白猪的 DNA 样本，每个样本各取 5 L 至同 1 个 1.5 mL离心管中，混匀。通过梯度 PCR 探索引物最适温度，普通 PCR 扩增 40 个大白猪的混合 DNA 样。PCR 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行 Sanger 测序，利用Chromas DNA 测序分析软件筛选多态位点。1.2.5 GenoPlexs 分型 筛选出基因多态位点后，将目的多态位点信息和 316 头大白猪 DNA 样本送交石家庄博瑞迪生物技术有限公司，利用 GenoPlexs 技术对每个个体进行基因分型。1.2.6 数据收集整理与分析 生长数据和繁殖数据均来源于场内自有记录。利用 Excel 2016 对数据进行整理，利用 SPSS 19.0 进行数据分析，结果用平均值 标准误差表示。利用单因素方差分析，LSD 法检测其显著性，将各 SNP 位点的基因型分别与生长性状的达 100 kg 日龄、达 100 kg 背膘厚、达 100 kg 背膘厚和出生重，以及繁殖性状的初产（头胎）和经产数据（28 胎）的总产仔数、产活仔数、木乃伊数和死胎数进行关联分析。1.2.7 多态位点遗传多态性分析 利用 r 语言 SNPassoc包统计 314 只大白猪PGAM2基因的 SNPs 位点野生型、杂合型、突变纯合型的基因型频率、等位基因频率以及检验是否符合 Hardy-Weinberg 平衡，利用 Excel 软件计算PGAM2基因 SNPs 位点的杂合度（He）、纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。表 1 猪PGAM2基因 PCR 引物信息序号 序列（53）GC 含量,%产物长度,bp退火温度,1F:CCAGCTCTTGGACTGCCTGACACTC6070563R:GCATCCACACTGCGTTCACTCCC612F:ATGGATGAGAAGCACCCCTACTACA4847862R:GACCCGCCCAGTTGAAGTCAGTTTG563F:CAGATGGAGCGAGGTCCTGGTTC6143363R:GATGGGGTGAGGTGCCTTTATTGCC56-239-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 2 结 果2.1 PCR 扩增结果 如图 1 所示，各引物均能获得目的条带，可用于后续胶回收及测序实验。2.2 突变位点测序峰图 通过混池测序共发现 5 个SNP 位 点（图 2），均 为 已 知 突 变 位 点，分 别 为：rs331014516（A/G）、rs80977507（C/T）、rs346188 790（C/T）、rs343549757（G/C）、rs80902904（A/C）。其中，rs331014516 是位于第 1 外显子 197 位的5UTR 区突变，rs80977507 是位于第 1 外显子 520 位的同义突变，rs346188790 是位于第 2 内含子 108 位的突变，rs343549757 是位于第 2 内含子 1 163 位的突变，rs80902904 是位于第 3 外显子 125 位的同义突变。rs331014516、rs80977507、rs346188790 和 rs80902904突变类型为颠换，rs343549757 突变类型为转换。2.3 分型结果 送样个体中有 2 个样本由于严重降解导致分型失败，其余样本分型成功，分型成功率达99.37%。2.4 群体遗传多样性分析 如表 2 所示，5 个 SNPs 位点中 rs331014516、rs80977507、rs346188790、rs343549757和 rs80902904 的优势基因型分别为 GG、TT、CC、CC和 AA 型，均为纯合型；rs331014516 和 rs346188790位 点 的 次 等 位 基 因 频 率（Minor Allele Frequency，MAF）小于 5%，属于稀有突变，不适合用作候选分子标记，后续该位点与各性状关联分析时仅进行统计描述，不做分析；5 个 SNPs 位点均处于 Hardy-Weinberg平衡（P0.05）。PGAM2基因遗传多样性分析结果见表 3。5 个 SNPs 位点纯合度（Ho）均高于杂合度（He）；rs80977507 和 rs80902904 位点属于中度多态（0.25PIC0.5）说明这些位点所受到的选择压力较小，可用作候选分子标记，rs331014516、rs346188790 和rs343549757 位点属于低度多态（PIC0.25）。2.5 连 锁 不 平 衡 分 析 如 图 3 所 示，rs331014516 与rs346188790 完全连锁（D=1，r2=1），rs80977507 与rs80902904 完全连锁（D=1，r2=1）且与 rs343549757强连锁。2.6 PGAM2基因多态位点与初产繁殖性状的关联分析 如表 4 所示，初产数据中，rs80977507 位点 CC 型的总产仔数为 16.75，比 TT 型高 2.62 且差异显著，比图 2 PGAM2基因突变位点测序峰图M 代表 Marker，泳道 13 分别对应表 1 中引物 1-3 的 PCR 产物。图 1 PCR 扩增结果bp500040003000200010009008007006005004003002001001 M 2 3rs343549757rs80902904GCGAAAGGCACGGGGCCGCCAGCACGGGCAGCCTTrs80977507rs331014516rs34618879030150abced-240-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期CT 型高 2.24 但差异不显著；rs80977507 位点 CC 型产活仔数为 16.00，比 TT 型高 3.10 且差异显著，比 CT型高 2.42，但差异不显著；与 rs80977507 完全连锁的rs80902904 位点具有同样的显著性。其余位点不同基因型的总产仔数、产活仔数、木乃伊数、死胎数差异均不显著。2.7 PGAM2基因多态位点与经产繁殖性状的关联分析 如表 5 所示，经产数据（28 胎）中，rs343549757 位点 CC 型死胎数为 1.05 头，显著高于 GC 型的 0.84 头，GG 型与 CC 型和 GC 型差异均不显著。其余位点不同基因型差异均不显著。2.8 PGAM2基因多态位点与生长性状的关联分析 如表 6 所示，rs80977507、rs343549757、rs80902904 不同基因型间达 100 kg 日龄、达 100 kg 日增重、达 100 kg背膘厚、达 100 kg 眼肌厚和初生重差异均不显著。3 讨 论参照农业农村部发布的全国畜禽遗传改良计划（20212035 年），未来 15 年，生猪产业以提高畜禽种业高质量发展为主攻方向14。随着科学技术的发展，育种学家开始借助分子生物学方法来提高育种效率15。其中，标记辅助选择（MAS）将分子生物技术与常规育种方法结合，借助分子标记选择目标等位基因以改变其基因频率。MAS 不受性别、年龄限制，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选种准确性以及选择强度，在生猪育种中具有广阔的应用价值16。作为一种基因分型技术，GenoPlexs 技术是挖掘分子标记的有力工具。GenoPlexs 是在单一 PCR 反应体系中加入 2 对或 2 对以上引物，用于富集目的片段，结合图 3 PGAM2基因 SNP 连锁分析表 3 PGAM2基因遗传多样性分析表 2 PGAM2基因的基因型频率及基因频率SNPs位置基因型基因型频率,%等位基因基因频率,%P值rs33101451618：48710543AA 0.31（1）A3.660.3415AG 6.68（21）G96.33GG92.99（292）rs8097750718：48710866CC 2.54（8）C17.990.5649CT30.89（97）T82.00TT66.56（209）rs34618879018：48711359CC92.99（292）C96.330.3415TC 6.68（21）T3.66TT 0.31（1）rs34354975718：48712414CC73.24（230）C85.661GC24.84（78）G14.33GG 1.91（6）rs8090290418：48712707AA66.56（209）A82.000.5649CA30.89（97）C17.99CC 2.54（8）SNPsHeHoNePICrs3310145160.0670.9331.0720.071rs809775070.3090.6911.4470.295rs3461887900.0670.9331.0720.071rs3435497570.2480.7521.3300.245rs809029040.3090.6911.4470.295rs343549757rs80902904rs80977507rs331014516121717171722227676Block 1(1 kb)345rs346188790-241-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 二代测序即可对样品进行准确分型17-18。本实验送测的 316 个样本，成功检测并分型 314 个样本，检出率为99.37%，充分说明了该技术的可靠性。稀有突变即样品基因组的突变比例非常低。全基因组关联分析（GWAS）中常常将稀有变异忽略（MAF5%），很可能导致了“缺失的遗传力”问题，即 GWAS 所检测的位点只能解释复杂性状一部分的加性方差19。人类复杂疾病的研究已成功鉴定到许多具有效应的稀有变异，目前在畜禽上对稀有变异的研究很少，主要原因是关联分析对样本群体规模的要求及其昂贵的测序费用20。本研究中，rs331014516 及其完全连锁的 rs346188790 位点的次等位基因频率仅为 3.66%，且次等位纯合基因型仅检测到 1 例，不适合用于方差分析。该位点次等位纯合基因型个体的首胎产仔数和产活仔数相比其他基因型没有明显优势，而生长性状相比其他基因型个体具有一定优势，但由于个体数较少，不具有统计学意义，后续需增加群体检测数量以验证该稀有突变位点对于生长繁殖性状的影响。表 5 PGAM2基因多态位点与经产繁殖性状的关联分析表 4 PGAM2基因多态位点与初产繁殖性状的关联分析注：同一位点不同基因型同列肩标字母不同表示差异显著（P0.05），下同。多态位点基因型总产仔数,头产活仔数,头木乃伊数,头死胎数,头rs331014516AA（N=1）13.0013.000.000.00AG（N=21）15.380.7114.230.790.420.240.710.24GG（N=292）14.250.1913.120.210.470.060.650.06rs80977507CC（N=8）16.751.14a16.001.26a0.250.390.500.39CT（N=97）14.510.32ab13.580.36ab0.350.110.570.11TT（N=209）14.130.22b12.900.24b0.530.070.690.07rs346188790TT（N=1）13.0013.000.000.00TC（N=21）15.380.7114.230.790.420.240.710.24CC（N=292）14.250.1913.120.210.470.060.650.06rs343549757CC（N=230）14.230.2113.040.230.500.070.680.07GC（N=78）14.390.3613.440.400.380.120.560.12GG（N=6）16.661.3215.661.470.330.450.660.45rs80902904CC（N=8）16.751.14a16.001.26a0.250.390.500.39CA（N=97）14.510.32ab13.580.36ab0.350.110.570.11AA（N=209）14.130.22b12.900.24b0.530.070.690.07多态位点基因型总仔数,头活仔数,头木乃伊数,头死胎数,头rs331014516AA（N=7）12.281.4610.851.480.710.300.710.64AG（N=97）15.020.3913.420.390.420.081.170.17GG（N=1283）14.580.1013.270.100.310.020.990.04rs80977507CC（N=37）15.240.6313.700.640.400.131.130.27CT（N=425）14.730.1813.470.190.380.040.870.08TT（N=925）14.520.1213.150.120.290.021.060.05rs346188790TT（N=7）12.281.4610.851.480.710.300.710.64TC（N=97）15.020.3913.420.390.420.081.170.17CC（N=1283）14.580.1013.270.100.310.020.990.04rs343549757CC（N=1018）14.530.1213.170.120.300.02 1.050.05aGC（N=339）14.780.2113.550.210.370.04 0.840.09bGG（N=30）15.100.7013.330.710.460.14 1.300.30abrs80902904CC（N=37）15.240.6313.700.640.400.131.130.27CA（N=425）14.730.1813.470.190.380.040.870.08AA（N=925）14.520.1213.150.120.290.021.060.05-242-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期卵泡的发育伴随着卵母细胞成熟及颗粒细胞增殖，但卵母细胞缺乏合成葡萄糖代谢相关酶的能力，因此需要颗粒细胞糖酵解途径产生丙酮酸，通过单羧酸转运系统转运至卵母细胞的线粒体中，作为卵母细胞 ATP 能量产生的底物，进而为卵母细胞胞浆及胞核成熟提供能量支持26。董丽13在NR4A1对卵巢颗粒细胞糖和脂代谢调节研究中发现过表达NR4A1基因与外源添加胰岛素和胰岛素增敏剂对小鼠卵巢颗粒细胞的影响相似，均能显著提高PGAM2基因的表达，提示PGAM2基因在卵巢颗粒细胞的糖代谢中发挥作用，从而可能影响卵母细胞的发育成熟，进而影响母猪的产仔数。本研究发现，rs80977507 及其完全连锁的 rs80902904 位点不同基因型的初产总产仔数、产活仔数差异显著，其次等位基因纯合型的总产仔数和产活仔数显著增加。但纯合型个体数较少，后期还需扩大样本量进行大群验证。龙清孟等21研究发现，PGAM2基因具有一定的广谱表达效应，在从江香猪和大白猪各组织中均能检测到表达，但在骨骼肌中特异性高表达。伍晓雄等22研究发现，通城猪和长白猪在胚胎骨骼肌发育过程中表现出不同的表达模式，通城猪在妊娠 33 d、65 d 和 90 d时呈波浪式表达，而长白猪呈上调表达。杨昊欣23在PGAM2与猪肉系水力的相关性研究中发现，PGAM2基因表达与系水力呈显著负相关。Fontanesi 等24-25研究发现PGAM2与后腿重、滴水损失和糖原含量显著相关。以上研究都表明，PGAM2基因与产肉性状相关，可进一步研究其与生长的关联性。本研究中，挖掘的大白猪PGAM2基因的 5 个 SNPs 位点不同基因型的达100 kg 日龄、背膘厚、眼肌厚和出生重差异均不显著，可能需要扩大实验群体进一步验证。同时，由于实验样本来源于大白种猪，无法开展屠宰试验，后续可在商品猪中进一步研究该基因多态位点与产肉性状的相关性。4 结 论本研究共鉴定到 5 个 SNPs，其中 rs331014516 与rs346188790 完 全 连 锁，rs80977507 与 rs80902904 完全连锁且与大白猪初产总产仔数、产活仔数显著相关，rs343549757 与大白猪经产死胎数显著相关；共鉴定到3 个与繁殖性状显著相关的 SNPs，可为大白猪的分子标记辅助选育提供数据支持。参考文献：1 Fothergill-Gilmore L A,Watson H C.The phosphoglycerate mutasesJ.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1989,62(1):227-313.2 王芬,李润花,殷国荣.磷酸甘油酸变位酶研究进展 J.中国血吸虫病防治杂志,2012,24(3):353-357.3 Qiu H,Zhao S,Xu X,et al.Assignment and expression patterns of porcine muscle-specific isoform of phosphoglycerate mutase geneJ.J Genet Genomics,2008,35(5):257-260.4 Omenn G S,Cheung S C.Phosphoglycerate mutase isozyme marker of tissue differentiation in manJ.Am J Hum Genet,1974,26(3):393-399.5 Charmley P,Shan W,Concannon P.Polymorphisms in the 表 6 PGAM2基因多态位点与生长性状的关联分析多态位点基因型达 100 kg 体重日龄,d达 100 kg 背膘厚,mm达 100 kg 眼肌厚,mm出生重,kgrs331014516AA（N=1）146.8712.3466.81.8AG（N=21）148.801.5213.650.6356.141.221.390.05GG（N=292）149.550.4113.840.1757.720.321.460.01rs80977507CC（N=8）148.902.4713.041.0355.561.991.470.09CT（N=97）148.900.7113.790.2957.400.571.450.02TT（N=209）149.780.4813.860.2057.840.391.450.01rs346188790TT（N=1）146.8712.3466.81.8TC（N=21）148.801.5213.650.6356.141.221.390.05CC（N=292）149.550.4113.840.1757.720.321.460.01rs343549757CC（N=230）149.700.4613.830.1958.000.371.460.01GC（N=78）148.930.7913.840.3356.700.631.430.03GG（N=6）148.692.8513.001.1856.362.291.500.11rs80902904CC（N=8）148.902.4713.041.0355.561.991.470.09CA（N=97）148.900.7113.790.2957.400.571.450.02AA（N=209）149.780.4813.860.2057.840.391.450.01-243-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 Tcrb-V2 gene segments localize the Tcrb orphon genes to human chromosome 9p21J.Immunogenetics,1993,38(4):283-286.6 Goureau A,Yerle M,Schmitz A,et al.Human and porcine correspondence of chromosome segments using bidirectional chromosome 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