单增李斯特菌Lm4b_02325基因缺失株的构建及其生物学特性研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211002单增李斯特菌基因缺失株的构建及其生物学特性研究曾东东，刘彩霞，寇丽君，秦赫，晋瑞婕，王静，任静静，蒋建军*，马勋*(石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000)摘要：为研究单增李斯特菌(LM)抗转录抑制因子编码基因对LM的生物学特性的影响，本研究采用同源重组技术构建基因缺失株LM928和回补株CLM928并均经PCR和测序鉴定。同时采用PCR鉴定该菌的遗传稳定性。上述结果表明基因缺失株与回补株均正确构建，且缺失株的遗传稳定性较强。根据培养不同时间的OD600nm值绘制缺失株、回补株和亲本株的生长曲线；对小鼠腹腔注射不同浓度(109cfu/mL105cfu/mL)的3株菌，观察感染后小鼠的临床症状，统计死亡率并计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。以MOI 10将上述3种菌分别感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)，1 h后裂解各菌，10倍倍比稀释，并涂布于BHI固体培养基，37 培养1 d后经菌落计数，分析各株菌对HBMEC的粘附力；按照上述方法感染各菌后1 h加入庆大霉素以及感染各菌后不同时间加入庆大霉素杀死未粘附的细菌，裂解各细菌，10倍倍比稀释并涂布于BHI固体培养基，通过菌落计数结果分析各菌株对HBMEC的侵袭力及在该细胞内的增殖能力。生长曲线结果显示3株菌的生长趋势基本相似。小鼠的致病性实验结果显示，接种109cfu/mL107cfu/mL 3株菌的小鼠出现被毛凌乱、厌食或神经症状与昏睡等临床症状，死亡率接近100%。而接种106cfu/mL105cfu/mL 3株菌的小鼠临床症状较轻，死亡率较低。经计算LM928对小鼠的LD50约105.45cfu/mL，毒力明显高于LM928株及CLM928株(0.05)。粘附、侵袭力及胞内生存能力结果显示，黏附及侵入HBMEC的LM928菌株数量极显著(0.01)或者显著高于LM928(0.01)与CLM928株(0.05)；胞内存活试验结果显示，感染后各时间点LM928较其余两种菌在HBMEC内的增殖速度均显著(0.05)或者极显著(0.01)加快，且前者在HBMEC中的存活数较后两者均显著(0.05)或者极显著(0.01)升高；采用荧光定量PCR(qPCR)检测黏附侵袭相关毒力基因、，胞内感染相关毒力基因、，内毒素调节基因共9种毒力相关基因的转录水平，结果显示，LM928株、的转录水平显著降低(0.05)，、的转录水平极显著下调(0.01)。其余基因转录水平均无显著变化。本研究结果首次表明基因缺失增强了LM对小鼠的致病性、对细胞的粘附性、侵袭力及胞内增殖能力，且其毒力基因、转录水平显著下调。本研究为基因的功能及在LM致病机致中作用的研究奠定基础。关键词：单增李斯特菌；缺失株；基因；胞内生存中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0575-08Construction and biological characteristics ofgenedeletion strain of收稿日期：2022-11-01基金项目：国家自然科学基金项目(32160834、32260895、32160833)作者简介：曾东东(1997-)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事动物传染病与细菌学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author单核细胞增生李斯特菌(，LM)简称单增李斯特菌，是一种革兰阳性细菌，具有很强的抗应激能力1，是人类感染李斯特菌病的病原，可引发胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等2。自2000年我国将食品中的LM纳入食品污染物监测网以来，大量研究显示我国不同城市食品中检出了LM，检出率大于10%3，肉制品或乳制品等食品中存在的LM对人畜的健康有重大危害4，LM已成为威胁我国人群健康与畜牧业发展的潜在病原菌。致病李斯特菌的毒力基因常聚于毒力岛，李斯特菌属ZENG Dong-dong,LIU Cai-xia,KOU Li-jun,QIN He,JIN Rui-jie,WANG Jing,REN Jing-jing,JIANG Jian-jun*,MA Xun*(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832000,China)Abstract:To investigate the effect of anti-transcription suppressant encoding geneon the biologicalcharacteristics of(LM),thegene deletion strain LM928and complementarystrain(CLM928)were constructed by homologous recombination technology and identified by PCR and sequencing,and the genetic stability of the bacteria was identified by PCR.The results showed that the deletion strain and the complementarystrain were correctly constructed,and the deletion strain possesses strong genetic stability.The growth curves of the deletion,thecomplementary and the parental strains were plotted according to the OD600nmvalue at different culture times.Mice were injectedwith 3 strains of different concentrations(109cfu/mL-105cfu/mL),the clinical symptoms of the mice were observed,the mortalityrate was calculated,and the median lethal dose(LD50)of the 3 strains was calculated by Kochs calculation method.Human brainmicrovascular endothelial cells(HBMEC)were infected with the above bacteria at MOI 10,respectively.The bacteria were lysedafter 1 hours,10-fold serially diluted,coated on BHI solid medium,and cultured at 37for 1 day,the adhesion of each strain toHBMEC was analyzed by colony counting.According to the above methods,gentamicin was added to the HBMEC at 1 hour afterinfection with each strain and gentamicin was added at different times after infection with each strain to kill non-adherent bacteria.The bacteria were lysed,10-fold serially diluted,spread on BHI solid medium.The invasion ability of each strain on HBMEC andits proliferation ability in the cell were analyzed by colony counting.The growth curve showed that the growth trends of the threestrains were basically similar.The results of pathogenicity test in mice showed that the mice inoculated with 3 strains at a dose of109cfu/mL-107cfu/mL showed clinical symptoms such as rough hair,anorexia or neurological symptoms and lethality,and themortality rate was close to 100%.The mice inoculated with 3 strains at a dose 106cfu/mL-105cfu/mL had mild clinical symptomsand lower mortality.The LD50of LM928to mice was about 105.45cfu/mL,and the virulence of LM928was significantly higher than that of LM928 and CLM928(0.05).The results of adhesion,invasionand intracellular viability showed that the survival rate of LM928which adhered to and invaded HBMEC cells wassignificantly higher than that of LM928(0.01)and CLM928(0.05).The results of intracellular survival experimentshowed that the proliferation rate of LM928was significantly(0.05)or extremely significantly(0.01)fasterthan that of the other two strains in HBMEC at each time point after infection.The survival rate of the former in HBMEC cellswas significantly(0.05)or extremely significantly(0.01)higher than that of the latter two.Fluorescence quantitative PCR(qPCR)was used to detect the transcription levels of 9 virulence genes including adhesion and invasion related genes(,and),intracellular infection-related virulence genes(,and),and endotoxin regulatory gene.Theresults showed that the transcription levels of,andin LM928strain were significantly decreased(0.05),and the transcription levels ofandwere significantly down-regulated(0.01).There were no significant changes in thetranscription levels of other tested genes.This work suggested for the first time that the deletion ofgene enhancedthe pathogenicity,cell adhesion,invasion and intracellular proliferation of LM in mice,and the transcription levels of virulencegenes,andwere significantly down-regulated,which laid a foundation for the study of the functionofgene and its role in the pathogenesis of LM.;deletion strain;gene;intracellular survival中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年576表 1PCR 引物信息引物名称Primer nameF1R1F2R2P1P2C-FC-R引物序列Primer sequences(5-3)AACTGCAGAAACCGAGTCATTTGGATAGCCCACTCCTTCAAACTTAGCATTTTTAATCACCGGTGATTAAAAATGCTAAGTTTGAAGGAGTGCGGAATTCGTTTCTTGTCCGACTAATCCATGCATTTAACGTTAGGTAAGCCGTTGACCTTCAATTCCGATTGTCATATCACAACTGCAGATGCTAAATCAACGTCAAAAAAACACCGCTCGAGCCTCTCACTCCTTCAAACTTACTCG酶切位点Restriction sitesRI扩增产物大小Amplicon size/bp42135111391956注：红色字母表示相应的酶切位点，下划线字母表示保护性碱基。Note:The red letter represents the corresponding enzyme cleavage site,and the underlined letters represent the protective alkali base.曾东东，等.单增李斯特菌基因缺失株的构建及其生物学特性研究第 6 期577G+C含量低，并与芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、乳杆菌属的亲缘关系较近5。LM可感染巨噬细胞和侵入非吞噬细胞，利用自身的毒力因子介导细菌在细胞内的增殖及在细胞间的传播，并通过各种途径帮助LM定植在胞内以保持其持久的毒力。LM基因组中存在多个毒力基因簇，这些基因簇编码的蛋白在感染机体的过程中发挥重要作用。其中 LM毒 力 岛 4(pathogenicityisland 4，LIPI-4)由6个基因簇构成6，编码磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)磷酸转移酶系统(Phosphotransferase system，PTS)。在近几年的研究中，有学者认为LIPI-4是首个与宿主中枢神经系统感染密切相关的特异性毒力因子7。Maury等对携带LIPI-4的LM09-00558株进行了初步探究，并建立了小鼠感染模型，发现PTS基因簇的缺失有效降低了LM穿越宿主血脑屏障的能力，而不会影响其在其他组织中的定植。这些结果证明PTS系统有助于LM对宿主的神经侵袭性7。LIPI-4中的基因约1 956 bp8，编码抗转录抑制因子BglG。目前对LM抗转录抑制因子的相关研究较少，但对大肠杆菌中的抗转录抑制因子(BglG)和枯草芽孢杆菌抗转录抑制因子LicT的研究较为成熟9。LM LIPI-4中的基因是否影响LM的生长，对细胞的粘附、侵袭及对小鼠的致病性尚不清楚。因此，本实验利用同源重组技术构建基因缺失株和回补株，并检测各菌株对小鼠的半数致死量(LD50)、对人脑微血管细胞(HBMEC)的黏附、侵袭、胞内增殖能力以及LM部分重要毒力因子的转录水平，为进一步研究该基因的功能、对LM致病性的影响及为筛选LIPI-4中的主效基因奠定基础。1材料与方法1.1菌株、质粒、细胞及实验动物LM928(4b型)菌株由本实验室分离并保存；pMD19-T(Simple)克隆载体购自TaKaRa公司；DH5琢感受态 细 胞 购 自(北 京)全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司；pKSV7穿梭质粒由浙江大学动物科学学院分子微生物与食品安全试验室提供；整合型质粒pIMK2由扬州大学殷月兰副教授惠赠。心脑微血管内皮细胞HBMEC购自北京北纳创联生物技术研究院。8周龄健康昆明系小鼠由石河子大学试验动物中心提供。1.2主要试剂脑心浸液培养基(BHI)购自青岛高科园海博生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、2伊PCR Mix均购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；HEPES、氯霉素、卡那霉素、青霉素G、氨苄青霉素、氯霉素与溶菌酶均购自Promega公司。1.3引物设计及合成根据GenBank登录的LM928株基 因 序 列(CP046478.1)，利 用 DNA-MAN软件对该基因进行同源性分析，选择其保守区域，利用Primer5.0软件设计PCR扩增基因的上游同源臂引物F1/R1、下游同源臂引物F2/R2且在F1/R2引物5端添加酶切位点与保护性碱基。引物P1/P2用于鉴定基因缺失株；引物C-F/C-R用于鉴定回补株，C-F的5末端添加I酶切位点和保护性碱基，C-R的5端添加I酶切位点(表1)。引物均由北京华大基因公司合成。1.4缺失株LM928的构建、鉴定与遗传稳定性检测利用细菌基因组 DNA试剂盒提取LM928株的DNA作为模板，以F1/R1为引物，PCR扩增基因上游同源臂；以F2/R2为引物，PCR扩增基因下游同源臂；以F1/R2为引物，以上述上下游同源臂基因为模板，通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增基因的上下游同源臂融合基因片段(该基因片段共缺失1 956 bp的基因)，并克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19-驻，经PCR及测序鉴定，正确的重组质粒pMD19-驻双酶切后与pKSV7温度敏感型穿梭载体相连接，构建重组质粒pKSV7-驻，并经PCR及测序鉴定正确后电转化LM928感受态细胞中，在42 和氯霉素抗性(10 滋g/mL)筛选发生同源重组的菌株(阳性转化子)，并每隔2代采用P1/P2引物经PCR鉴定。将该菌在无抗性30 条件下连续传12代，每隔3代均通过引物P1/P2经PCR鉴定并测序及氯霉素抗性筛选丢失质粒的 菌 株 即基 因 缺 失 株 LM928驻。将该菌继续在无抗性培养基中37 连续传15代，每隔2代采用引物P1/P2经PCR鉴定LM928驻的遗传稳定性。1.5CLM928驻基因回补株的构建与鉴定利用细菌基因组 DNA试剂盒提取亲本株LM928的DNA作为模板，以C-F/C-R为引物，经PCR扩增基因，克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19-，经PCR及测序鉴定。正确 的 重 组 质 粒 pMD19-经 双 酶 切 后 与pIMK2 载 体 连 接，构 建 重 组 质 粒 pMD19-驻，并 经 PCR 及 测 序 鉴 定 后 电 转 化 LM928驻感受态细胞中，通过卡那霉素筛选阳性转化子，并通过引物C-F/C-R经PCR和测序鉴定。1.6各菌株生长曲线的测定将LM928、LM928和CLM928株分别于BHI液体培养基中37 振荡培养，每隔2 h平行取3个样测定OD600nm值。以OD600nm值为纵坐标，时间为横坐标，绘制3株菌的生长曲线。1.7各菌株对小鼠半数致死量(LD50)的测定将LM928、LM928和CLM928均 于 BHI 液 体 培 养 基 中 37 、180 r/min 培 养 至OD600nm值抑0.40时，分别离心收集菌体，将菌液10倍倍比稀释(109cfu/mL105cfu/mL)。将96只雌雄各半的8周龄昆明系小鼠随机分为16组，每组6只，将上述各剂量细菌分别以0.2 mL/只经腹腔注射小鼠；对照组小鼠腹腔注射灭菌 PBS，0.2 mL/只。在10 d的观察期内，观察各组小鼠临床症状，统计各组小鼠的死亡率，并利用寇氏法计算各细菌对小鼠的LD50。1.8各菌株对HBMEC黏附力与侵袭力的测定待12孔板中培养的HBMEC汇合度达90%时，将LM928、LM928和CLM928分别以MOI 10感染HBMEC，1 h后PBS洗细胞2遍，加入1 mL/L的TritonX-100 1 mL裂解各细菌15 min后分别10倍倍比稀释为1021043个稀释度，每个稀释度做3个平行涂布BHI固体培养基，37 培养1 d进行菌落计数，分析缺失株和回补株对HBMEC的黏附力。上述各细菌感染HBMEC 1 h后，PBS洗细胞2遍，加入庆大霉素(100 滋g/mL)杀死未黏附的细菌，在感染后2 h PBS洗2遍，裂解各细菌并10倍倍比稀释为1011033个稀释度，每个稀释度3个平行涂布于BHI固体培养基，37 培养1 d进行菌落计数，分析LM928和 CLM928对 HB-MEC的侵袭力。1.9各 菌 株 在 HBMEC 内 增 殖 能 力 的 测 定将LM928、LM和CLM928LM928分别以MOI 10感染12孔细胞板中汇合度达90%的HBMEC，1 h后加入1 mL含10 滋g/mL庆大霉素的DMEM培养液(此时为时间起点t=0)杀死培养液中的细菌，继续培养。加入含100 滋g/mL庆大霉素的DMEM培养液，分别在t=2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，共6个时间点分别用PBS洗2遍，加入1 mL/L的TritonX-100 1 mL裂解15 min后，分别10倍倍比稀释为1021054个稀释度后，每个稀释度3个平行涂布于BHI固体培养基，37 培养1 d进行菌落计数。分析各菌株在HBMEC内的增殖能力。1.10亲本株和缺失株主要毒力基因的荧光定量PCR(qPCR)检测利用细菌基因组DNA试剂盒分别提取LM928及LM928驻Lm4b-02325株的DNA作为模板，经前期的内参筛选试验，选择作为内参基因，采用qPCR检测两个菌株与黏附侵袭相关的毒力基因、，胞内感染相关毒力基因、，内毒素调节基因共9种毒力相关基因的转录水平10，每个菌株的内参基因与目的基因各设3个平行。PCR反应条件：95 5 min；94 30 s，53或55 30 s，72 30 s，共40个循环；72 10 min。-驻Ct=内参基因Ct值减去目的基因Ct值，以2-驻驻Ct法计算各菌株各毒力基因的相对转录水平。1.11数据的统计与分析采用GraphPad Prism 9.0软件处理各组试验数据，采用One-way ANOVA方法中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年578曾东东，等.单增李斯特菌基因缺失株的构建及其生物学特性研究第 6 期579分析各组试验数据之间的差异性。*：0.05，表示差异显著；*：0.01、*：0.001均表示差异极显著。2结果2.1缺失株LM928的构建、鉴定与遗传稳定性检测结果以LM928株的DNA作为模板，分别经PCR扩增基因的上下游同源臂作为模板，通过重叠延伸PCR扩增上下游同源臂融合基因并采用同源重组技术构建重组质粒pKSV7-，使用F1/R1引物进行PCR和测序鉴定。结果显示，获得了772 bp的目的片段，与预期一致。将pKSV7-电转化LM928感受态细胞中，通过42 和氯霉素抗性筛选发生同源重组的菌株，每隔2代采用P1/P2引物经PCR鉴定，结果显示，连续传5代，同源重组菌均能够扩增到1 139 bp的目的基因片段，而LM928则扩增到3 095 bp的目的基因片段(图1A，仅展示了第5代的PCR图)，测序结果显示，获得缺失1 956 bp基因的目的片段，表明获得了同源重组菌pKSV7-LM928。然后在无抗性30 条件下连续传12代通过引物P1/P2经PCR鉴定与氯霉素抗性筛选丢失质粒的菌株并经PCR和测序鉴定。结果显示，每隔3代的菌株均扩增到1 139 bp的目的片段，且这些菌株均能够在不含氯霉素抗性的平板上生长，表明pKSV7质粒丢失，LM928则扩增到3 095 bp的目的片段(图1B)。测序结果显示，pKSV7质粒丢失的基因缺失菌株均正确缺失1 956 bp的基因片段，即获得了基因缺失株LM928。将其连续传15代，从第5代开始，每隔2代均利用P1/P2引物对缺失株进行PCR鉴定。结果显示，5、7、9、11、13、15代LM928株均扩增出1 139 bp的目的条带，LM928株则扩增到3 095 bp的目的片段，阴性对照则无任何条带扩增(图1C)。测序结果显示，各代次LM928均缺失1 956 bp的目 的 片 段。表 明 正 确 构 建 基 因 缺 失 株 LM928，且其遗传稳定性较强。2.2回补株CLM928的构建与鉴定结果按照2.1的方法并采用同源重组技术构建重组质粒pIMK2-，并采用C-F/R引物经PCR及测序鉴定。PCR结果显示，pIMK2-扩增到1 956 bp的目的片段，测序结果显示，基因回补至该质粒中。将pIMK2-电转化LM928感受态细胞中，通过卡那抗性筛选阳性转化子并采用C-F/R引物经PCR鉴定。结果显示，阳性转化子扩增到约1 956 bp的目的片段，与 LM928 株 扩 增 的 目 的 条 带 一 致，而 缺 失 株LM928则无该条带(图2)。测序结果显示，阳性转化子的基因已经回补到基因缺失菌株中，表明正确构建基因回补株CLM928。2.3各 菌 株 生 长 曲 线 的 测 定 结 果将 LM928、LM928与CLM928培 养于BHI培养基中，每隔2 h平行取3个样测OD600nm值，绘制各菌株的生长曲线。结果显示，LM928、LM928与CLM928生长趋势基本A：M：DL2000 DNA Marker；1：LM928 strain；2：同源重组菌pKSV7-LM928A:M:DL2000 DNA Marker;1:LM928 strain;2:Homologousrecombinant bacterium pKSV7-LM928B：M：DL2000 DNA Marker；1：LM928株；25：分别为3、6、9、12代基因缺失株pKSV7-LM928；6：ddH2OB:M:DL2000 DNA Marker;1:LM928 strain;2-5:the 3rd,6th,9th,and 12thgeneration of gene deletion strainpKSV7-LM928驻Lm4b_02325;6:ddH2OC：M：DL2000 DNA Marker；1：LM928株；27：分别为5、7、9、11、13、15代基因缺失株LM928驻Lm4b_02325；8：ddH2OC:M:DL2000 DNA Marker;1:LM928 strain;2-7:the 5th,7th,9th,11thand 13thgeneration of gene deletion strainLM928驻Lm4b_02325;8:ddH2O图1同源重组菌pKSV7-LM928(A)、基因缺失菌LM928(B)及其遗传稳定性(C)的PCR鉴定结果ABC2000bp1000bp750bp500bp250bp3095bp1139bp3095bp1139bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp1139bpM12M123456M12345678一致，在培养4 h10 h时处于对数生长期；10 h后进入稳定期(图3)。在同一时间点3株菌的生长趋势基本一致。表明基因与LM的体外生长能力基本无关。2.4各菌株对小鼠的LD50测定结 果将LM928、LM928与CLM928分别采用5个稀释度(109cfu/mL105cfu/mL)以0.2 mL/只经腹腔接种小鼠。在10 d的观察期内，接种109cfu/mL107cfu/mL上述3株菌的小鼠均出现被毛凌乱、厌食或神经症状与昏睡等临床症状，死亡率分别为100%、94%、89%。而接种106cfu/mL105cfu/mL上述3株菌小鼠的临床症状较轻，死亡率分别为33%、83%、50%。利用寇氏计算法计算各菌株对小鼠的LD50，结果显示LM928对小鼠的 LD50约106.52cfu/mL；CLM928对小鼠的LD50约106.03cfu/mL，与LM928株接近；LM928对小鼠的 LD50约105.45cfu/mL，与LM928株相比，缺失株LD50下陴了1.07个数量级，毒力高于LM928株。表明，LM928基因调控LM928株的毒力与致病性。2.5各菌株对HBMEC黏附力与侵袭力的测定结果将 LM928、LM928与 CLM928株分别感染HBMEC 1 h后，裂解各细菌并将1021043个稀释度做3个平行涂布于BHI固体培养基，37 培 养 1 d 后 菌 落 计 数。结 果 显 示，LM928株 黏 附 HBMEC 的 数 量 极 显 著 高 于LM928与CLM928株(0.01)，而LM928黏附HBMEC的数量显著高于CLM928株(0.05)(图4)；上述细菌感染HBMEC 1 h后采用庆大霉素(100 滋g/mL)杀死未黏附的细菌，2 h后裂解各细菌并分别以1011033个稀释度做3个平行涂布于BHI培养基，37 培养1 d后进行菌落计数。结果显示，侵入HBMEC中的LM928的活菌 数 显 著 高 于 LM928 与 CLM928株(0.05)，而后两者侵入HBMEC的活菌数之间差异不显著(图4)。表明基因参与LM对HBMEC的粘附力和侵袭力。2.6各菌株在HBMEC内增殖能力的测定结果将LM928、LM928与CLM928株分别感染HBMEC后 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h共6个时间点分别裂解上述细菌，并分别以1021054个稀释度涂布于BHI固体培养基，37 培养1 d经菌落计数。结果显示，感染后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h LM928比株在HBMEC内的增殖速度均显著(0.05)或者极显著(0.01)加快；在感染HBMEC后4 h、6 h、10 h LM928比CLM928株在HBMEC内的增殖速度均显著加快(0.05)(图5)。表明基因参与LM928株在HBMEC内的生存与增殖能力。2.7亲本株与缺失株主要毒力基因的qPCR检测结果提取LM928及LM928株的DNA作为模板，采用qPCR检测两株菌中内化素调节基因，黏附侵袭相关毒力基因、，胞M:DL2000 DNA Marker;1:LM928 strains;2:Complementay strain CLM928;3:Detetion strain LM928图2回补株CLM928的PCR扩增结果图3各菌株的生长曲线M1232000bp1000bp750bp1956bpLM928LM928驻CLM928驻1.51.00.50Time(hour)14121086420*:0.05;*:0.05)；与 LM928 株 相 比，LM928驻Lm4b_株、的转录水平显著降低(0.05)；、的转录水平极显著降低(0.01)(图6)。表明，基因通过调控LM928株粘附侵袭相关基因中的和大部分胞内感染相关毒力基因的转录水平影响LM928株对的毒力。3讨论LIPI-4是近年来发现的LM毒力岛，Maury等于2016年研究发现其为LM特异性毒力因子，与中枢神经系统感染及母胎感染关系密切。LIPI-4中的抗转录抑制因子BglG编码基因在革兰氏阳性菌中很常见，但其在LM中的作用，特别是该基因对LM的致病性及毒力影响的相关研究很少。因此，本实验采用SOE-PCR扩增基因的上下游同源臂融合基因片段，并克隆至pMD19-T载体，构建重组质粒pMD19-后，克隆至pKSV7温度敏感型穿梭载体，构建重组质粒pKSV7-，并经PCR及测序鉴定正确后电转化LM928株感受态细胞，采用42 与氯霉素抗性双重压力，让其在LM928感受态细胞中同源重组获得基因缺失株LM928，并具有良好的遗传稳定性。将构建的重组质粒pMD19-电转化LM928感受态细胞中，通过卡那霉素筛选阳性转化子，并通过PCR和测序鉴定获得了回补株CLM928。构建的回补株因为在保存与培养环节中均添加卡那霉素，因此无需经PCR检测其的遗传稳定性。本研究构建的基因缺失株为后续进一步研究LIPI-4中基因在LM中的功能及致病作用奠定基础，并为筛选LIPI-4的主效基因提供参考。生长曲线测定结果显示，缺失株与亲本株在BHI培养基中培养4 h时均进入对数生长期，在10 h时均进入平台期。表明，基因缺失对亲本株的生长无显著影响。研究显示，缺失LM的某些毒力基因确实不影响其生长特性，如LM 黏附侵袭相关毒力基因或者的缺失株均与亲本株的生长特性无显著差异11。LIPI-4中膜透性酶(EA)编码基因12以及LIPI-4 毒力岛基因的缺失对LM的生长特性也无显著影响13。表明缺失毒力基因与某些代谢相关基因时并不影响LM的生长特性。同样表明可以采用构建某些基因缺失株研究相应基因的功能及对LM各方面的影响。本研究首次分析了基因对LM毒力的影响，致病性实验结果显示，接种109cfu/mL107cfu/mL LM928、LM928与 CLM928的小鼠均出现相应临床症状，死亡率分别为100%、94%、89%。而接 种106cfu/mL105cfu/mL上述 3株菌小鼠的临床症状均较轻，死亡率分别为33%、83%、50%。与LM928株相比，缺失株对小鼠的LD50下降了1.07个数量级，再结合相同剂量接种小鼠的临床症状与死亡率表明该基因缺失导致LM对小鼠的毒力及致病性均显著升高。但有研究显示，在LM中敲除毒力基因会致其毒力降低，如敲除溶血素 O()基因会使LM对小鼠的LD50显著升高，致病性降低，且其对巨噬细胞J774.1的侵袭力显著下降14。缺失LIPI-4毒力岛导致LM在HBMEC中的增菌量降低15。LM928株对雏鸡有致病性，主要损伤雏鸡的肝脏和心脏，而缺失LIPI-4可以降低LM对雏鸡的致病性16。而本研究结果却显示，缺失株对小鼠的致病性，对HBMEC的黏附力、侵袭力及其胞内增殖能力均显著强于亲本菌株。与上述实验结果并不一致。1234567891011121314151617中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年582为了分析上述结果不一致的原因，本实验采用qPCR检测LM928中毒力相关基因、的转录水平。结果显示，缺失株、的转录水平极显著低于亲本株。、是位于LM第一毒力岛(LIPI-1)中的毒力基因，LIPI-1又称依赖型毒力基因簇，其G+C含量与毒力岛外的基因相似且较稳定，尚未发现该处有明显的插入片段元件、整合酶识别位点等12。致病性李斯特菌中大多含有LIPI-1与，而缺失使得其LIPI-1中、基因的转录水平均显著降低，这两个基因是由调节的细胞内感染相关毒力基因17，而缺失株的转录水平较亲本株无显著变化。表明除了的调节通路可能还有其他的基因会下调、与等毒力基因的转录水平。除此以外黏附侵袭相关毒力基因、胞内感染相关毒力基因却均显著下调。从毒力基因检测结果并不能解释上述相反的结