微卫星DNA分子标记.doc

微卫星DNA分子标记及其应用
唐开宇（20096798） 生物科学09-1
（四川农业大学生命科学与理学院生物科学09-2 雅安 625014）
摘 要：文章综述了微卫星DNA的概念及其标记的原理和在群体遗传学结构分析、构建遗传连锁图谱等诸多领域的应用，并作出了展望。
关键词：微卫星DNA 分子标记
微卫星DNA( Microsatellite DNA) [1]，又称SSR ( Simple Sequence Repeat) 即简单重复序列[2]，短串联重复( Short Tandem Repeat STR) [3] 或简单重复序列长度多态性( Simple Sequence Length Polymorphism, SSLP)是以少数几个(一般为1~ 6 bp)核苷酸为重复单位的首尾串联重复DNA序列，如( CA ) n，( TG ) n，( GGC ) n 等，其中n 代表重复次数，重复次数从几个到几十个不等。SSR 在原核和真核生物基因组中均有分布[4]. 一般说来，微卫星DNA的重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以，通过设计引物对基因组DNA进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），就可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性，这就是微卫星DNA分子标记。

1. 微卫星DNA的分类及其分子标记原理
1.1 微卫星DNA的分类及优点
大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上，植物基因组中一般含有50 %以上的重复序列，如小麦基因组的重复序列多达80 %，重复序列按其在染色体上的分布方式，可分为散布重复序列（Dispersed Repeats Sequence，简称DRS）和串联重复序列（Tandem Repeat Sequence，简称TRS）前者的重复单位与其它无关重复序列和单拷贝序列相间排列，而后者的重复单位则首尾相连，成串排列。按照重复单位的大小又可以将串联重复序列分为卫星序列( Satellite) 、小卫星序列（Minisatellite）和微卫星序列（Microsatellite）三种。根据重复结构的不同可将微卫星DNA分为三类：完全重复型（perfect），单一序列单元无中断或无颠倒；不完全重复型（imperfect），单一序列单元有中断或有颠倒；混合型（compound），多个序列中单位有或无中断和有或无颠倒的混合。与其它分子标记相比，SSR 具有许多优点。它具有等位基因变异多、单基因座、信息含量高、多态性高；稳定性好、重复性好；种族特异性强、进化所受选择压小；以孟德尔方式分离、呈共显性遗传等等[5]

1.2 微卫星DNA标记原理

微卫星标记的基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，由于核心序列串联重复数目不同，则通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据扩增分离片段的大小决定基因型，并计算等位基因频率。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。微卫星侧翼序列在相近的物种中具有一定的保守性。因此，某一物种的微卫星引物可以在其相近的物种中得以使用，这就使微卫星位点的检测丁作大幅度减少，从而加快对不同物种间比较基因图谱的制作速度。为此，常利用微卫星标记来检测个体基因型，统计群体中等位基因的数目和频率，结合分子遗传学和数量分类学原理，计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性，从而初步评估品种的遗传多样性及品种间的亲缘关系与分化关系。[6]
3. 微卫星分子标记技术的应用
微卫星DNA标记在遗传多样性的技术研究始于19世纪。早期的遗传变异研究主要集中在表型性状和染色体水平上，包括了染色体结构的变异(Stebbins等，1953)。20世纪80年代以来，分子生物学技术迅速发展，由于避免了根据表型性状来推测基因型时可能产生的各种问题，DNA遗传标记法成为目前最有效的遗传多样性分析方法。DNA多态性分析常用的分子遗传标记体系有限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)、微卫星DNA多态性等。现在，微卫星DNA技术在猪、牛、绵羊、山羊、海洋动植物等群体结构、遗传学分析、基因鉴定、生物多态性分析等方面已经广泛的运用。微卫星DNA 作为遗传标记具有很大的优越性。近年来随着研究的不断深入,对微卫星标记的研究不仅具有重要的理论意义, 而且还具有较好的应用前景。
3.1 微卫星多态性分析
在自然界中,生物个体表现出来的各种遗传变异,在本质上就是DNA 的差异,因此通过研究DNA 的变异来分析群体的遗传结构及遗传多样性更为直接。微卫星其重复单位数量可能不完全相同,因而形成多态性,即SSR 分子标记,这可能是由于有丝分裂过程中同源微卫星间的不等交换或复制过程“链滑”(strand slippage) 作用造成的。微卫星多态性反映着物种的进化历史,共有的等位基因在该物种基因组中最为古老、保守。与蛋白质标记技术相比较,利用微卫星标记估计的群体遗传杂合度和遗传距离明显优于蛋白质多态性标记,而且在分析遗传关系较近的种群和品种时,微卫星标记比蛋白质标记具有更为准确的数值。如Xiao. H 等[7]从运用FLASCO（fast isolation of AFLP sequences containing repeats）技术从湖南梁子湖取样的新几内亚以沼芒草（Miscanthus floridulus）基因组中成功分离出12具有多态性的SSR基因座并结合相关物种进行了生物多态性分析。
3.2 群体遗传多样性
微卫星比其他分子标记如RFLP、RAPD、AFLP 更能揭示遗传多样性。Li. D 等[11]用微卫星DNA标记分析了来自野生鲤鱼群体的30个基因座从而分析出六个野生鲤鱼群体的遗传多样性。Fahima 等的实验证实,单子叶植物大麦及双子叶植物鹰嘴豆也存在串联排列( GTAT) n和简单重复序列( GACA) n ,而且显示出高度多态性。Plaschke 等用23 个SSR 标记对40 份欧洲小麦品种进行检测,共发现142 个SSR多态性位点,平均每个SSR 标记能检测到6.2 个多态性位点。郭小平等用137 对有扩增产物的引物对2 个玉米自交系B14 和B96 进行分析,发现有67 对引物显示多态性,反映了这2 个自交系在遗传物质上的差异。杨官品等用一个多拷贝微卫星DNA 标记分析了238 份栽培水稻的遗传多样性及遗传多样性从农家品种到现栽培品种的动态变化,共检测出16 种长度变异类型和32种表现型,表现了较高的多态性。Turuspekov Y等用微卫星引物分析了代表日本主要栽培地区的18 种大麦品种的遗传多样性,Shannon信息含量最高的是Kanto 地区,为0.524；而含量最低的是Tohoku 地区,为0.264。遗传距离从Tohoku 和Tozan 地区的0.105 到Shikoku 和Kyushu 地区的0.88 。通过聚类分析表明,同一地区栽培的品种大都归为一类,这反应了大麦在日本在栽培不但受历史亲缘关系的影响,同时也有地理和环境因素的影响。Tanya P 等用SSR 对5 个韩国大豆品种、8 个泰国大豆品种和3 个野生大豆进行了遗传多样性分析。
3.3 基因定位及构建遗传连锁图谱
由于微卫星重复单位数量多，重复单位片段短，且重复程度不一样，同一类微卫星可分布在整个基因组的不同位置上，可将随机PCR标记沿着染色体锚定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微卫星标记来源于基因本身的序列，因而通过对微卫星标记的定位，也就相应地定位了其来源基因。Beckmman和Soller 认为, 多态的签条微卫星( Sequence - tagged Microsatellite site ,STMS) 对基因定位提供了有效的标记。
遗传连锁图谱是利用遗传标记进行连锁分析来反应遗传标记之间的相对关系。现在使用最广泛的是微卫星标记。其基本原理是：以微卫星位点为基础，在基因组中每隔一定距离找一个多态性的微卫星标记，当这些标记达到足够的饱和度（约每隔10-20cm一个，并覆盖90%的基因组）后，则可借助微卫星标记找到基因组中的任何功能基因和QTL，并进行连锁分析，从而确定QTL在图谱的位置、与标记之间的遗传距离和QTL的表型效应。Akkaga等将121个微卫星标记整合到水稻四个群体的RFLP框架图上，平均每16-20cm就有一个微卫星标记。拟南芥、水稻、番茄、土豆和玉米在遗传图谱上1cm分别相当于物理距离的150kb、300kb、500kb、1000kb和1500kb。相信随着分子遗传标记技术尤其是微卫星技术的进一步完善,对于构建基因文库将会起到进一步的推动作用。
3.4 构建指纹图谱
基因组中各微卫星位点除重复数不同外，其碱基组成和结构是相似的，因此可以以微卫星的核心序列如（AC）n、（TG）n等作为多位点探针，在基因组中同时检测多个位点。由于不同个体、品种（系）或群体在被检测位点上存在一定的差异，通过电泳及杂交，这些差异将表现为杂交带的有无，即产生微卫星DNA指纹图。B.Beyerman等通过DNA指纹印迹技术，利用简单重复序列（GATA）1和（GTG）5作探针，证实了大麦和甜菜DNA指纹印迹区带的显著差异。
3.5 用于种质鉴定和品种分类
由于微卫星座位的复等位性，使它易于鉴别同一物种的不同基因型。Guilford等利用（GA）15（GT）15作为探针筛选苹果基因组文库，证明了这些重复序列的多态性，并且利用3个微卫星标记就能足以区分21个苹果品种。Akagi等利用高度多变的含（AT）n的17个微卫星标记，成功地区分了59个亲缘关系极近的粳稻品种。Aranzana MJ用SSR对100个桃品种进行分析，用7个多态性微卫星位点得到32个等位基因，可区分78个不同的基因型。
3.6 分子标记辅助选择
微卫星标记应用于标记辅助选择具有很大的潜力，它改变了从表型值推断基因型值的选择过程。分子标记辅助选择相对于传统的表型选择来说，可以获得更大的遗传进展，尤其对于低遗传力性状、限制性状和后期表达的性状，能增大选择强度，缩短世代间隔，提高选择的准确性。如王晓丽等[12]为天麻种质资源进行更好的保护和育种选择提供科学技术资料，用该技术对天麻杂种F1进行鉴定得出F1杂种表现为父母本互补带型，与其亲本材料得到很好的区别，进而得出微卫星DNA分子标记技术适用于天麻杂种的纯度鉴定，能准确、快速、经济地为天麻种质资源的保护和选育提供科学参考的结论。Solomon Benor 等[8]运用SSR分子标记技术对从中国、日本、韩国和美国取样的近亲杂交的西红柿的35个微卫星DNA进行了分析测定，并最终得出其变异水平处于中等水平的结论。胡则辉等[9]运用微卫星DNA标记技术对海洋生物遗传学中，微卫星DNA在遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因鉴定和标记以及系谱图认证等领域进行研究并予以展望。全迎春等[10]用微卫星DNA标记探讨了镜鲤的种群结构与遗传变异并得出五个群体属于高度多态，遗传多样性水平较高等等。微卫星DNA分子标记技术除了在动物群体中进行研究，在植物方面也能进行群体多样性分析。此外国内外还有很多领域运用此技术进行运用。
4. 展望及讨论
微卫星DNA标记不仅可以反映不同个体间的遗传相似度，还可以利用基因频率反映群体间的遗传相似度。通过微卫星标记对遗传多样性的评估，可检测个体基因型，统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率，了解家畜品种的遗传结构、生活背景，分析其进化的历史。近年来微卫星DNA标记技术已取得了明显进展，但微卫星DNA标记还存在很多问题，如微卫星DNA分子突变机制尚不完全清楚、PCR引物在不同物种间保守性较差、对于不同物种要进行特异性引物设计等，但微卫星DNA仍然是研究当前种内遗传变异中分辨率最高、揭示力最强的核DNA标记。相信随着微卫星DNA研究的不断深入，微卫星必将会在各个领域中有着更为广泛的应用。

参考文献
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[7] Xiao Hu, Ying Diao，Isolation and characterization of simple sequence repeat loci in Miscanthus floridulus and their potential use as markers in related species. [J] , Biomass and Bioenergy ( 2012) I-4.
[8] Solomon B, Mengyu M. Assessment of genetic variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) inbred lines using SSR molecular markers [J] , Genet. Genomics 35 (2008) 373−379.
[9] 胡泽辉、周志刚．微卫星DAN标记技术及其在海洋生物遗传学中的应用 [J]．Transactions of Oceanology and Limnology，1003-6482 ( 2006) ：37~ 43.
[10] 全迎春、李大宇等．微卫星DNA标记探讨镜鲤的种群结构与遗传变异[J]．遗传( 2006) 28(12): 1541~1548.
[11] Dayu L. Dahai K . 微卫星DNA标记分析野生鲤鱼群体的遗传多样性 [J]．Journal of Genetics and Genomics ( 2007) 34( 11) :984~ 993.
[12] 王晓丽，宋聚先登．天麻杂种Fl微卫星DNA分子标记鉴定 [J]．安徽农业科学．2011，39（24）: 14634 ~ 14635.