吸水过程中发菜光合活性及相关转录本的变化.doc

摘要
发菜 (发状念珠藻，Nostoc flagelliforme Bornet & Flah )，是一种旱生蓝藻，分布于干旱、半干旱地区的部分荒漠草原和荒漠地带。发菜具有很高的经济价值，而且它还是研究极端环境中生命现象的一种良好材料，同时作为一种生活在半干旱、干旱地区的植物，其对于干旱荒漠区的生态维护有十分重要的意义。由于发菜生长繁殖缓慢，近几年又遭到人为的破坏性采收，严重破坏了这些地区的生态平衡。鉴于上述原因，对于发菜的研究和保护逐渐引起科研人员和政府部门的重视。本文综述了发菜近年来的研究进展，并在此基础上研究了不同干燥贮存时间的发菜回复吸水过程中光合活性的恢复，以及利用Real-time PCR技术研究了发菜回复吸水过程中光合作用相关基因表达水平的变化。
发菜的水分吸收基本上可以分为3个阶段: 短时间(0-2 min)内快速吸水阶段，2-30 min水分吸收的迟缓阶段和30 min之后的持续吸水阶段。干燥保存2年和8年的发菜的水分吸收的主要区别在第3阶段，这与藻细胞生理活性的恢复有关。
在回复吸水过程中，干燥保存2年的发菜的光合作用在回复吸水24 h后基本恢复，而干燥保存8年的发菜才恢复到其33.4%，这表明发菜在干燥状态下贮存时间越长，恢复光合活性所需时间越长。不同干燥贮存时间的发菜PSI电一子传递活性在短时间恢复，这表明PSI功能修复很快;而PSII电子传递活性的恢复比较缓慢，在吸水的第三阶段逐渐恢复。于燥保存8年的样品在回复吸水24 h依然检测不到叶绿素荧光，也检测不到其PSII电子传递活性，而干燥保存2年的样品PSII电子传递活性在回复吸水24 h基本恢复。
利用WATER-PAM测定回复吸水过程中千燥保存2年发菜的快速光响应曲线。
随着回复吸水时间的增加，藻细胞的光适应系数Ex呈上升趋势，这表明随着回复吸水时间的增加藻细胞能耐受的光照强度越高:最大电子传递速率ETRma二和表观光合效率a也呈L升趋势，这表明在回复吸水过程中光合电一子传递链的恢复情况。
通过比对其他藻株的光合作用相关基因(psbAl、psbA2和psaA)的保守区域，设计引物扩增了发菜相应的同源基因，并通过实时定量RT-PCR分析了它们在发菜回复吸水过程中的转录情况。研究发现，干燥保存2年样品的rbcL、rbcX 、 psbAl和psbA2基因的转录丰度随着回复吸水时间的增加而增加，而干燥保存8年的样品的rbcL、rbcX、psbAl和psbA2检测到的丰度很低。psbAl基因在回复吸水15 min分钟之后就达到了对照的0.36，而psbA2基因在回复吸水初期表达量很低。这说明在干燥脱水的过程中Rubisco和PSII反应中心D1蛋白受到损伤，在回复吸水过程中这两种蛋白开始修复;psbAl和psbA2基因表达差异说明光合系统的重建是一个多步骤的过程，尽管这种多步骤的意义和具体程序仍不清楚。干燥贮存长时间的发菜在回复吸水24 h后，rbcL、rbcX、psbAl和psbA2转录丰度依然很低，这说明长时间的贮存对DNA以及与转录相关的蛋白造成了比较严重的损伤，而这种损伤可能与ROS的积累有关。
关键词:发菜;回复吸水;光合作用;光合电子传递;快速光响应曲线;Real-time
RT-PCR; 光合作用相关基因

Abstract
Nostoc flagelliforme Bornet&Flah. is a terrestrial and highly desiccation-tolerant
blue-green alga, being distributed in the arid or semiarid areas of dry desert and grassland. It has great economic value and is very significant for the ecology of the dry desert and grassland. Unfortunately its resources have been over-exploited due to the increasing market demands. As a result, the ecological balance of its habitats has been damaged. As a consequence, many scientists have paid great attention to its protection and a number of studies have been carried out since 1998. In this paper, we reviewed the studies of N. flagelliforme in recent years, and then investigated the physiological changes of N. flagelliforme having been driedly stored for different periods and the expression of its photosynthetic genes during rehydration.
During rehydration, the weight of N. flagelliforme increased in three phases with the times of 2 min, 0.5 h and 24 h. Owing to the physiological activities of living cells, the difference was observed in the third phase for N. flagelliforme dried for 2 or 8 years.
The photosynthetic activity was fully recovered within 24 h rehydration in N.
flagelliforme after 2 years of drying storage, but that of samples dried for 8 years was
only 33.4% of the former samples after 24 h rehydration. This indicated that longer
storage in dryness required more time for the photosynthetic recovery. The PSI activity was rocovered almost within 15 min, suggesting that their function was restored very quickly. However, the PSII activity was recovered mainly in the third phase. After 24h rehydration, the chlorophyll fluorescence or PSII photosynthetic electron transport activity could not be detected in samples dried for 8 years.
During the process of rehydration, the rapid light curve of N. flagelliforme dried for 2 years was assayed with WATER-PAM. The Ek values increased during rehydration, indicating that N. flagelliforme could utilize high light more efficiently. The ETRmax and α also increased in this process, indicating the recovery of its electron transport activity during rehydration.
Then, the expression of possible photosynthetic genes (rbcL, rbcX, psbAl and
psbA2) in N. flagelliforme was investigated during rehydration. The rbcL, rbcX, psbAl and psbA2 transcripts of N. flagelliforme dried for 2 years were up-regulated during the rewetting process, but their levels were less in samples dried for 8 years. Within 15 minutes rehydration, the abundance of psbA1 gene reached 36% of fully recovered samples, but the abundance of psbA2 gene was very low in the second phase of rehydration. This indicated that Rubisco and D1 protein in PSII reaction center were damaged during water loss or dry storage, and they should be repaired during rehydration. The difference in the expression of psbAl and psbA2 suggested that the revovery of photosynthetic machine may be a complex process during rehydration although it is not clearly known now. The longer storage in dryness the recovery of photosynthetic genes expression needed more time, indicating that long-time storage might cause seriously damage on DNA or transcription-related proteins and this may be related with ROS production.

Key words: Nostoc flagelliform; rehydration; photosynthesis; photosynthetic electron transport; rapid light curve; Real-time RT PCR;
photosynthetic gene

目录
摘要.................................................................................................................................I
Abstract ................................................................................................................................lI
第一章发菜的研究进展................................................................................................ l
1.概述................................................................................................................................1
1.1地理分布生态特征. ............................................................................................................1
1.2形态特征.............................................................................................................. 3
1.3生长繁殖方式.................................................................................................................... 4
1.4化学组成.. .....................................................................................................5
2.生理生化特性....... .............................................................................................................. 6
2.1水分生理....... ................................................................................................................. 6
2.2光合生理.............................................................................................................. 9
2.3固氮作用............... .....................................................................................................11
3.人工养致 ....................... .....................................................................................................11
4.结束语................................ .....................................................................................................13
第二章回复吸水过程中发菜生理活性及相关转录本的变化..................................14
1.前占.....................................................................................................14
2.材料.和方法...... .................................................................................................... 15
2.1材料及培养条件............................................ .............................................................15
2.2水分吸收的测定.......................................................................15
2.3叶绿素荧光的测定......... .......................................................................15
2.4光合放氧和暗呼吸的测定.......................................................................15
2.5电子传递活性的测定........................................................................................ 16
2.6快速光响应曲线的测定.......................... ........................................................................16
2.7总DNA的提取. .......................................................................16
2.8基因的克隆......................................................................,................................. 17
2.9 Real-time RT PCR.......................................................................18
3.结果......................... .......................................................................20
3.1回复吸水过程中水分的吸收特征....................................................................... 20 3.2回复吸水过程中光合作用和暗呼吸的恢复.................................................... 21
3.3回复吸水过程I一!，光合电子传递活性的恢复二................................................. 22
3.4回复吸水过程中快速光响应曲线的变化........................................................ 24
3.5几个光合作用相关基因的初步克隆................................................................ 26
3.5在回复吸水过程，E}发菜光合作用相关基因转录丰度的变化....................... 29
4.讨论.... .......................................................................30
第三章高光强条件下外界无机碳浓度对抑Synechococcus sp. PCC 7942 CCM相关
基因的影响.. .......................................................................34
1.前言.......................................................................34
2.材料与力一法.................................................................................. 35
2.1材料及培养条件.......................................................................35
2.2反应液配制.......................................................................35
2.3强光处理. .......................................................................36
2.4总RNA的提取.......................................................................36
2.5 cDNA的合成.......................................................................................... 37
2.6荧光定量PCR.................................................................................................... 37
2.7转录木丰度的计算............................................................................................ 38
3.结果.......................................................................38
3.1在高光强条件卜外界无机碳浓度对Synechococcus sp. PCC 7942 CCM相关
基因农达丰度的影响.............................................................................................. 38
4.讨论.......................................................................40
参考文献........................................................................................................................................ 41
在学期间撰写和发表的论文…....................................................................................... 51
致谢............................................................................................................................ 52

第一章 发菜的研究进展
发状念珠藻(Nostoc flagelliforme Bornet & Flah.)，俗名发菜(以下简称发菜)，是一种旱生蓝藻，属原核生物界(Drocaryotae )、蓝藻门(Cyanophyta )、蓝藻纲(Cyanophceae )、段殖体目(Hormogonales )、念珠藻科(Nostoceae )、念珠藻属(Nostoc )。发菜具有很高的经济价值，而且它还是研究极端环境中生命现象的一种良好材料，同时作为一种生活在半干旱、干旱地区的植物，其对于干旱荒漠区的生态保护具有十分重要的意义。由于发菜生长繁殖缓慢，近几年又遭到人为的破坏性采收，严重破坏了这些地区的生态平衡。鉴于上述原因，发菜的研究逐渐得到人们的重视，近些年在发菜的生理生化、形态发育、生态以及人工养殖等方面都取得了一定的进展，本章将对这些研究进行简要的综述。
1.概述
发菜具有很高的经济价值，其营养丰富，蛋白含量很高，每百克中含蛋白20克，矿物质含量也很高，尤其是碘的含量，达到0.1-0.5%，为其它食物所罕有。发菜在中国已有上千年的食用和药用历史(Potts 2000 )，而且与“发财”谐音，预兆着吉祥，深受国内外华人的珍爱。同时发菜作为一种陆生固氮蓝藻，是荒漠生态环境中不多的固氮植物，是荒漠土壤中有机碳和氮的来源，对于干旱荒漠区的生态环境具有十分重要的意义。此外它还是研究极端环境中生命现象的一种良好材料。随着发菜逐渐被人们认识，对其的消耗量也随之增加。由于发菜生长繁殖缓慢，年生长量较低，有限的发菜资源远远不能满足市场需求，在这种巨大经济利益的驱动下，人们对发菜掠夺式的采收屡禁不止，一方面使有限的发菜资源面临枯竭;另一方面严重破坏了草原生态系统。因此，对于发菜的研究逐渐引起人们的重视。近些年，对于发菜的研究，在生态学、生理生化、人工养殖等诸多方面都取得可喜的进展。
1.1地理分布与生态特征
发菜的地理分布具有世界性。在美国、墨西哥、摩洛哥、索马里、阿尔及利亚、前苏联、法国、捷克、蒙古、中国均有分布，但发菜并非全境分布.仅生长在这些国家的干旱、半干旱地区的部分荒漠草原和荒漠地带(姜翠萱 1981)。发菜在我国的分布范围是东起内蒙古东部，西至新疆西部，南自河北蔚县和青海，北达中蒙边界。发菜多生长在海拔为1000-2800 m的山地丘陵、山前平原、洪积冲积扇、荒滩戈壁、剥蚀残丘和丘间盆地(Gao 1998 )。
发菜仅生长在干旱和半干旱地区。这些地区降水稀少，平均年降水量在450 mm以下，多数地区降水量低于200 mm，且降水变率大，多集中在5-9月份;其蒸发量较大，一般都超过降水量的10-20倍，空气干燥，年平均相对湿度在40-70%之间，绝大部分地区的干燥度大于1.5；年均气温较低，均低于8.0 0C;四季气候分明，昼夜温差大。气温在夏季可高达350C，冬季低至-170C，有些地区(甘肃部分地区)最低达零下290C，温差达到640C。地表温差可达950C( -290C-66 0C )。可见发菜耐旱性很强，而且对温度变化有很强的耐受能力。发菜生长地区太阳辐射强烈，年总辐射量在5.376×105(古浪)-6.2118×105 J.cm-2(酒泉)之间;日照时数长，均超过2500 h，发菜对于这种光胁迫有很强的抗性，其外层的胶质鞘起到很重要的作用(Gao 1998; 赵明等2000; 唐进年等2000)。
根据野外调查，发菜生长的土壤类型虽有差异，但也具有一些共同特征:地表坚实有一定的紧实度，土壤表面常龟裂形成荒漠孔状结皮;且土层薄，沙性大，结构松散。这种特殊的土壤表面结构及其物理性质，一方面，降雨后地表不易积水，发菜不会因长期吸水使胶质鞘液化而解体死亡;另一方面，可使发菜丝体与土壤之间接触充分，保证了发菜与土壤之间进行充分的物质交换。这种非扰动土壤环境有利于发菜的生长发育，而在松散或易流动的土壤地表上无发菜生长。这可能是因为流动物体易将发菜掩埋，并且不利于发菜和土壤之间进行物质交换。生长区土壤以灰棕漠土和棕钙土为主，pH值介于7.5-9.5;在盐碱地和有盐(碱)结皮的土壤环境中无发菜生长。在发菜人工培养中，也同样发现，当培养基表面出现盐(碱)结皮后，发菜丝体就会很快变黄，粘接在结皮上失去弹性而最终死亡。这说明发菜不适应强盐碱环境(赵明等2000)。生长发菜的土壤十分贫瘠，生物作用微弱，腐殖质矿化迅速，钙积过程明显，N和P含量极低，有机质含量在1.0%左右。调查中发现，在第三纪红层出露的地方，土层薄，土壤尤其贫瘠，几乎无其它植物生长，而发菜却能单独生存生长，并且集中连生分布，且数量较多，凡在第三纪红层出露的干旱地区，一般都有发菜分布(唐进年等2000)。发菜是一种固氮蓝藻，藻体中的异型胞存在固氮酶，可以转化空气中的氮为可利用的氮素，合成生长必需的氨基酸，所以发菜可以在营养匾乏的土壤中生长。
发菜在迎风向坡面上生长较多，而在背风坡面上生长较少或无发菜生长;在小生境中表现为，在岩石、土坎或各种突起物的迎风处发菜分布较多。风是发菜进行再分布和扩大分布范围的主要动力因素之一(赵明等2000 )。可能的原因是由发菜的生物学特性所决定的，研究表明以水分为主导因子的节律变化对于发菜不断积累有机物至关重要，Gao等人的研究结果显示，风速对于发菜失水的调节起着重要作用(Gao 1998 )，生长在多风的环境中有利于发菜在吸水后迅速失水，从而促进发菜生长，并且提高发菜对于各种胁迫的抗性(温度、干旱等)。因此，多风的环境可能更适于发菜生长。
野外调查研究发现在固定沙荒地和半固定沙荒地土壤中，除了发现有发菜生长外，还生长了大量好氧性细菌、放线菌和真菌(张功，张威伟2003)。在发菜分布区，植被稀疏、矮小，主要以旱生或超旱生的小灌木、小半灌木和草本植物为主。从干草原和荒漠草原过渡到小半灌木荒漠，发菜分布的数量明显增多。发菜一般贴地面生长在一些旱生或超旱生的矮小灌木下或裸地上(赵明等2000)。
1.2形态特征
1.2.1外部形态
发菜是一种丝状体蓝藻。其起源古老，但演化十一分缓慢，植物体结构简单，无根、茎、叶的分化。干燥状态的发菜藻体(原植体)呈黑色形似头发，故名“发菜”；发菜吸水后呈橄榄绿色或棕褐色，且颜色深浅不等。发菜藻体的形态主要有柱状(细丝状)和带状两种。除此之外，还存在一种特殊形态——丝状和带状体的结合体。柱状(细丝状)体的发菜，原植体细长，粗细均匀；不分支，略有不规则弯曲，部分原植体端部常膨大呈各种形态；原植体横截面呈圆形，直径(干燥状态)一般为0.02-0.25 mm；长度不等，一般为10-60cm，最长可达100 cm以上。带状体发菜，原植体扁平，呈狭长带状；多数不分支，略有不规则弯曲，端部常出现平钝端；横截面呈椭圆形，或哑铃形、长椭圆形，宽度(干燥状态)一般在0.10-5.00mm之间；长度不等，一般为5-30 cm，最长可达50 cm以上。吸水后部分原植体表面上有明显的分裂线，条件适宜时，可沿分裂线进行纵裂繁殖。带状发菜在自然界分布相对较少，多生长在水分条件相对较好的地区(地带)。丝状体-片状体结合体即丝状藻体上长出一段带状或片状藻体，或是带状或片状藻体上长出一段丝状藻体。自然界中分布数量极少，仅在相对潮湿的环境中形成(唐进年等2003)。单个分布的柱状或带状发菜可以通过弯曲盘绕、纵横交错交织形成团块状、网状或束状的群体形态。发菜形态上的不同，主要是受生态环境，特别是受环境湿度的影响所致。唐进年等(2003)的实验显示，带状原植体可能是发菜发育的最初形态，柱状发菜是带状发菜当生长环境变得更为干旱后，经长期演变而来。
1.2.2内部形态
发菜藻体是由无数条念珠状细胞构成的藻丝体由公共的胶质鞘包被而成。藻丝体是发菜结构和生理的基本单位(王志本等1989 )。藻丝体多数为单链，常纵向排列，与藻体的长轴平行；但也有少数藻丝体出现分支，呈不规则排列。藻丝体主要由近球形的营养细胞构成。有些藻丝体上具有异形胞，单个或成串存在。异形胞比营养细胞略大，具有明显的厚壁，分两个层次，内深外浅，与相邻营养细胞连接的地方有所加厚，异形胞内无颗粒物质，内含物呈均匀状态，较透明。有些藻丝还具有厚壁孢子，在光学显微镜下不易确认(唐进年等2000)。发菜对光辐射的抗性，与其外部的胶质鞘密不可分(唐进年等2000)。胶质鞘对紫外线的辐射具有一定的抵抗能力(黄有馨等1984)。发菜细胞对于光辐射可能具有其他一些调节机制，例如细胞内部的一些生理生化机制是否存在耗散过剩光能的作用，这方面的工作还未见报道。
1.3生长繁殖方式
蓝藻是一类光合原核生物，不能进行有性生殖，不能区分胞子体和配子体，其中丝状体蓝藻在个体发育中有不同的细胞形态。de Tandeau MN （1994 )研究发现在念珠藻属中普遍存在着两个重要的个体发育阶段，即营养藻丝体和藻殖段。藻殖段的特征是比营养细胞小，缺乏异形胞，可以移动，藻丝短而直。通常营养细胞在不利的环境条件下形成厚壁孢子，以抵抗恶劣环境，然后在适当条件下再萌发繁殖(Rippka et al. 1979；Bilger et al. 1994 )。在发菜中也存在着这两个阶段，而且在一定条件下可相互转变。之前的研究发现发菜具有四种繁殖方式:1.单细胞从藻丝上脱离，形成新群体；2.营养细胞转变为厚壁孢子，以抵抗恶劣环境，在适当条件下萌发繁殖形成新群体； 3.藻殖段分散形成新群体；4.大群体形成小群体(程子俊，蔡惠珍1988；姜翠萱1990；Dodds et al. 1995 )，其中藻殖段分散的形式是主要繁殖方式(华振基等1994)。程和蔡(1988)对发菜早期发育阶段的研究表明:发菜早期发育与地木耳和灰色念珠藻基本相同，都要经过几个不同的发育阶段，然后形成球形胶群体，由此再发育为成熟的胶群体，只是发菜的生长发育慢于后两者。钟泽璞等(2000)采用弱光(铺垫砂粒遮光)，红光或在白光下向培养基中加入DCMU(3, 4- dichloropheny-l, 1-dimethylurea)等方法，可促进营养藻丝体向藻殖段转变。研究发菜的藻丝体与藻殖段的光合特性，发现营养藻丝体和藻殖段的可见光吸收光谱和色素含量差别不大(钟泽璞等2000)。而两者在不同光强范围(110-1200 μmol photons.m-2.s-1)和不同温度(15-45 0C)下的光合放氧活性研究表明，藻殖段比营养藻丝体可能更适合在低光强下和较高的温度下生长；而在光合能量传递中营养藻丝体比藻殖段在两个光系统之间的光能分配上更加均衡，但是藻殖段中藻胆体吸收光能向两个光系统的传递比营养藻丝体的更加有效(钟泽璞等2000)。
1.4化学组成
发菜营养丰富，含蛋白质20%-23.41 %，碳水化合物57%(戴治稼1988)，粗脂肪5.59%-5.69%，磷0.27%-0.30%，铁0.12%-0.20%，钙0.27%-2.56%，灰分
6.62%-7.65 %，并含有19种氨基酸，总量达17.79%，其中人体必需的7种氨基酸占总量的35.83%(戴治稼等1991)，尤其亮氨酸、苏氨酸、精氨酸，缬氨酸最为丰富