NY∕T 3152.4-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第4部分：鱼类毒性试验(农业).pdf

ICS 65.020 B17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.4一2017微生物农药环境风险评价试验准则第4部分:鱼类毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide-Part 4: Fish toxicity test 2017 -12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.4-2017 目U吕NY / T 3152 (微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分第1部分:鸟类毒性试验;一一第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分:鱼类毒性试验;一一第5部分:搔类毒性试验;一一第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第4部分。本部分按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业司提:J:并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:曲甏苦苦、卡元卿、田丰、周艳明、续卫和l、瞿唯刚、姜锦林。I 微生物农药环境风险评价试验准则第4部分:鱼类毒性试验1 范围本部分规定了微生物农药要求。本部分适用于微生2 规范性引用文件3.1 微生是以细菌有害生物作用3.4 细菌芽抱、真菌袍子、细显微镜下一个完整的个体完整的实体。3.5 细菌营养体吨etativebacterium 单个活的生物体，通常是指自旨在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的-个完整的营养体、袍子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。NY/T 3152.4-2017 、试验报告等的基本、草、鼠等or pr侃侃oancyst 成单个CFU的一个-NY/T 3152.4-2017 3.8 最大危害暴霆量maximum hazard e碍。surelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露聋，通常以预测暴露量与安全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3. 10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后，在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性或敏感性有关。3. 11 半数致死量median lethal d翩。rconcentration, LD5tl / LCso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或毒素量。3. 12 半数感染量median infective dose or concentration, IDs. / ICs. 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或毒素量。4 试验概述在一定试验条件下，以一定的供试物浓度或剂量测试对受试鱼类的毒性和致病性等影响。当供试物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和致死(病验证试验。致死毒性以LDs./LCso表征;致病性以ID5./ICs.表征。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验生物推荐鱼种为斑马鱼(Brachydoniorerio)、倒(Carassiusauratus )、鲤(Cyprinuscarpio)、虹蹲(Qncorhynchus mykiss)、青鳞(Oryziaslatipes)或稀有酬绅(Gobiocyprisrarus)等。受试鱼要求健康无病，未性成熟的当年生幼鱼，并采用满足其生理要求的驯养和试验条件。具体体长和适宜水温见附录A。并根据以下原则选择受试鱼:一一尽可能与微生物农药靶标宿主分类地位相近;一一选择以微生物农药靶标生物为食的鱼类;一一生物学资料丰富的鱼种;一一选择幼年期的试验物种，避开产卵期。受试鱼类应在测试环境条件下驯养7d14d，每日光照12h-16 h，每天定时喂食1次-2次，及时清除粪便及食物残渣。试验前24h停止喂食。5. 1.2 供试物5. 1.2. 1 类型微生物母药、制剂产品等。2 NY/T 3152.4-2017 5. 1.2.2 批次通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报告中记录供试物的批次。5. 1. 2. 3 计数方法计数方法如下:一一细菌可采用平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定;真菌抱子以CFU为计数单位，可采用平板菌落计数法或血球计数板法等测定;一一原生动物以个体数目-一病毒以包涵一一其他单位，以上推荐计数方法，5. 1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。5. 2. 3 处理组和对照组试验设置供试物处理组、空白对照组柑贸m宣4个平行，每个平行10尾鱼。考虑微生物的传染性，各处理组及对照组应避免交叉污染。5. 2. 4 效应观察试验期间每日对受试鱼的饲料食用状况、异常行为、死亡等进行观察和记录。当鱼没有任何肉眼可见的活动，如鲸l呼吸、碰触尾鳝无反应，即可判断该鱼己死亡。5. 2. 5 试验周期试验观察时间应持续30 d。当在试验观察时间末期，处理组受试鱼开始出现死亡或明显病征，则需延长试验观察时间，直至受试鱼恢复正常或确定死亡。5.2.6 最大危害量暴露量试验以下列不同暴露途径分别设置供试物最大危害暴露量。当因制剂剂型、水质等条件限制，供试物溶NY/ T 3152.4-2017 液浓度不能达到最大危害暴露量时，则采用供试物在水中能配置得到的最大量进行试验。试验开始后，每日观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡情况。当受试鱼在试验期间未发生死亡(病变)或死亡(病变)率不超过50%.则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。不同暴露途径供试物最大危害暴露量分为:a) 接触暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为10单位/mL.或按照供试微生物农药推荐施用量在15cm 7.1.体中浓度的1000倍计算设计最大危害暴露浓度。两者均能达到时，以较高浓度为最大危害暴露量。b) 饲喂暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为供试微生物农药推荐施用量在15cm深水体中浓度的100倍，将供试物添加到饲料中连续饲喂5d后，正常饲喂至试验结束。c) 腹腔注射暴露量。供试物最大危害暴露量为供试微生物农药推荐施用量在15cm深水体中浓度的10倍，注射量为每克体重0.01mL。5.2.7 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度，将受试鱼暴露于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡情况，求出试验结束时供试物对受试鱼类的LDso/LCso值或IDso/ICso值及其95%置信限。5. 2. 8 致死(病)验证试验在无菌条件下将死鱼或病鱼进行表面消毒后解剖，分离感染组织并接种至适合的培养基质中，将培养物置于适宜目标菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试鱼。如果受试鱼出现与先前试验相同的病症，则证实目标菌株对受试鱼类具有致死(病)能力。5. 3 数据处理5.3. 1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3. 2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5. 3. 2 差异显著性检验5.3. 2. 1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析CF检验One-WayANOVA. LSD检验)等。显著水平取0.05C差异显著)、0.01C差异极显著)。5.3. 2. 2 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。X1- X2 . (1) zzz l 式中:主1，X2分别为两样本平均数;1., .1., 分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3. 2. 3 One-Way ANOVA方差分析(LSD检验)3组及以上均值比较时可进行方差分析.LSD检验按式(2)计算。LSD. = t.df,l S王J.(2) 式中:ta(dfe)一一在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;4 NY/T 3152.4-2017 S二-玉，一一均数差异标准误，按式(3)计算。S玉-i，= j2MS，/可.(3) 式中:MS，-F检验中误差均方;n 一一各处理重复数。5. 3. 3 半数敖死量或半数感染量计算鱼类半数致死量LCso/LD5。或半数感染量图解法估算，也可应用有关毒5. 4 质量控制质量控制条件如下:6 的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位见GB/T31270. 12. 和组成信5 NY/ T 3152.4-2017 附录A(规范性附录)受试鱼体长要求及适宜温度条件根据受试鱼的种类选择适宜体长的幼鱼及合适饲养的水温进行驯养(见表A.D。表A.1幼鱼的体长和适宜的水温鱼种体长，cm适宜水温，C斑马鱼2. 0土1.021-25 饵5. 0士1.023-29 鲤3. 0土1.020-24 虹鲸5. 0士1.013-17 青鳞2.0士1.021-25 稀有例哪2.0土1.021-25 6 圄NY/T 3152.4-2017 附录B(资料性附录)稀释平板菌落计数法I B. 1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后，在固体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落，因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量。B.2试1flJ蛋白陈。牛肉膏。氯化纳(NaCl)。氢氧化纳溶液:1mol/L。盐酸溶液:1mol/L。葡萄糖。磷酸二氢御(KH2PO.).硫酸缓(MgSO.).琼脂.孟加拉红。蒸馆水。氯霉素。B.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台.酸度计等。B.4 固体培养基平板的制备B. 4.1 细菌培养基平极依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化纳5g、琼脂15g18 g.滚于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL.以1mol/ L氢氧化销溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07.2.分装于500mL三角瓶中，每瓶装150mL.塞上棉塞，经121.C高压蒸汽灭菌20min.培养基温度降至约50.C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL. B. 4. 2 真菌培养基平板依次称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢饵1g、硫酸缓0.5g.琼脂15g18 g、孟加拉红0.03g、霉素。.1g .溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸饱水至1000mL.分装1) 本方法适用于细菌、真幽.袍子等计数.但细商、真菌袍子等计数不仅限于本方法.7 NY/T 3152.4-2017 于500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121.C高压蒸汽灭菌20min，培养基温度降至约50.C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL。B.5 样品的处理称取一定量的供试物，加入盛有适当元菌水的三角瓶中，通过振荡、超声等方法使供试物充分分散成单细胞，形成菌悬液，然后用容量瓶和无菌水定容，配置一定浓度的微生物悬浮母液备用。上述过程均应无菌操作。B.6 样晶母液的稀释涂布细茵通常稀释到10-88 中，按10倍法依次稀释，通常稀释到10斗，并选择，立即用无菌玻璃涂棒暗培养。当用同一支的菌悬液CB.D 嘀嘀 C.1 方法原理附录C(资料性附录)血球计数板法1NY/T 3152.4-2017 血球计数板法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(血球计数板)，于显微镜下直接计数，然后推算出数量的一种方法。C.2 仪器设备血球计数器。显微镜。锥形瓶。滴管。载玻片、盖玻片。超净工作台等。C.3 样晶的制备根据供试物浓度或含量，用无菌水稀释后形成供试物悬浮液用于血球计数板计数。血球计数板5个中格中微生物数量宜控制在20-100.C.4 样品的制片取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将稀释后的供试物悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让悬液利用液体的表面张力充满计数区，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。静置片刻，使微生物沉降到计数板上.在显微镜下进行计数。C.5 数量计数计数时若计数区是由25个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右下、右上、中间的5个中方格(即80小格)的微生物数。为了保证计数的准确性，在计数时，同一样品至少计数2次，对沉降在格线上微生物的统计应有统一的规定。如微生物位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的微生物计入本格，本格的下线和右线上的微生物按规定计入相应的格中。样品浓度或含量按式Cc，1)计算。C = N X 25/ 5 X 10 X 10 X XCC.1) 式中:C 一-样品浓度或含量，单位为个每毫升(个/mL);1) 本方法适用于体型核大的微生物，如真菌袍子、酵母、多角体病毒和原生动物等讨数.但真菌泡子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数不仅限于本方法.9 NY/ T 3152.4-2017 10 N一一5个中方格的微生物总数;x-一样品稀释倍数。 . NY/T 3152.4-2017 D. l 方法原理附录D(资料性附录)荧光定量PCR法1)SYBR Green能结合于所有dsDNA双螺旋小沟产生极强荧光，其荧光信号强度与dsDNA的数量正相关。因此，根据荧光信号监测PCR体系存在的dsDNA的数量并绘制荧光信号累积曲线，最后通过参照标准曲线对未知模板进行定量分析。D.2 试验试剂与材料常规PCR体系:rTaqDNA聚合酶、rTaq10Xbuffer、dNTP、ddH20、扩增引物。克隆体系:大肠杆菌DH5感受态、pMD18T、ddH20、T4连接酶、T4连接酶10Xbuffer qPCR体系:SYBR Green Superrnix、ddH20、扩增引物。基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒等。D. 3 主要仪器荧光定量PCR仪。普通PCR仪。超净工作台.微量核酸定量仪(如Nanodrop)或紫外可见分光光度计。D.4 标准品模板的制备D. 4.1 目的基因片段的扩增与克隆引物设计:寻找待测物种的物种特异基因最好是单拷贝)，按基本引物设计原则设计引物，使引物Tm值为62C-65C，PCR产物长度为80bp-150峙。样品基因组总DNA的提取:针对不同样品，购买基因组提取试剂盒，按照基因组提取试剂盒操作说明提取样品基因组总DNA。特异基因片段扩增:以提取的样品基因组总DNA为模板，PCR扩增特异基因片段，采用两步法扩增，PCR扩增体系如下:rTaq酶0.25L，rTaq酶10X buffer 2. 5L，dNTP 2L(20 mrnol/ L) ，引物1(Pl)、引物2(P2)各1L，模板lL，加ddH20补足体积至25L;反应条件为:94C预变性5min; (94C变性，30 s;60C退火延伸30s)30个循环;72C充分延伸10min;4C保存。电泳检测:PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确保元非特异性扩增并回收扩增片段。TA克隆:按照TA克隆标准步骤将回收后的扩增产物连接至卢ID18T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中;LB抗性平板(Amp100)结合蓝白斑筛选，挑取单克隆转移至液体LB(Amp100)中，37C摇床培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒并送至测序公司进行测序验证，确定目的基因片段与载体相连且序列正确。D. 4. 2 标准晶模板的拷贝数确定1) 本方法适用于细菌、真商和病毒等计数.但细菌、真菌和病毒等计数不仅限于本方法.11 NY/ T 3152.4-2017 使用Nanodrop或其他仪器测定含目的基因片段的载体浓度，按式(0.1)计算目的基因拷贝数CCopies/L)。Q=6. 02X 1023 XCX 10/L X660. (0. 1) 式中:Q一一基因拷贝数，单位为拷贝数每微升CCopies/L);C一一DNA浓度，单位为纳克每微升Cng/L); L一-DNA长度，单位为碱基对Cbp)。将含目的基因片段的载体用ddH-画矗萃，稀释为10Copies/L 108 Copies/L， 此即为标准品模板，一20.CSYBR Green D.6 D. 6. 2样以提取的样成的Ct值和已建立12 :标准品模板2L，20L;反应条件为:以程序默认为准;-倍;E(0. 2) D.5一致，根据反应生中待测物种的丰度。 参考文献l(;B 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定2NY j T 2743-2015甘N，臼色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法3SNj T 2358-2009 国绕口岸炭瘟芽抱杆菌荧光定量PCR检测方法.NY/T 3152.4-2017 13 EON-寸.NmF的回hz中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境凤险评价试验准则第4部分:鱼类毒性试验NY/ T 3152.42017 等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销峰晤* 开本880mmX1230mm 1/16 印张1.25 字数25千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4425 定价30.00元峰峰版权专有侵权必究举报电话[phone]