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课 程 论 文
分子克隆技术在热带作物中的应用
摘要：分子克隆技术在热带作物中主要用于建立基因文库、分离高产和抗性基因、基因重组选择适当受体和载体以及异源基因的导入等。在热带作物品种鉴定、资源保护以及繁殖育种中起到了重要的作用。
关键词：分子克隆；热带作物

分子克隆技术也称为基因克隆技术,包括把来自不同生物的基因同有与自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。热带作物是热带地区的栽培植物，是适于热带地区栽培的各类经济作物的总称。主要包括橡胶；油料作物：油棕、椰子、腰果；香料作物：胡椒、香茅、香根、罗勒；纤维作物：龙舌兰科麻类、番麻、蕉麻、爪哇木棉；饮料作物：咖啡、可可；药材：砂仁、巴戟、槟榔、三七；热带水果：香蕉、荔枝、龙眼、菠萝、芒果、油梨、番瓜、番石榴等。
一、分子克隆技术
分子克隆技术是七十年代初发展起来的新技术，在十年时间里已经得到了广泛地应用。它不仅对分子生物学、遗传学、细胞学等学科研究起了很大的推动作用，而且在工业、农业和医学等实际部门也将作出应有的贡献。分子克隆技术涉及面很广，包括限制性内切酶的应用，基因分离，载体组建，DNA片段连接，细胞转化，重组体的筛选和鉴定，基因表达和物质的生产等方面[1]。
二、热带作物的发展现状
本世纪以来,世界热带农业发展势头强劲,热带作物初级产品的产量从2000年的4. 85亿吨上升至2006年的6. 12亿吨, 5年间增长了26%。在世界热带经济作物中,产量增长幅度比较大的作物有油棕果、天然橡胶和木薯, 5年分别增长了45%、39%和27%。近年,热带水果产量均有不同程度的增长, 2006年香蕉、芒果、菠萝、油梨和番木瓜的产量比2000年分别增加了10%、16%、21%、24%和12%。[2]。
随着热作产业的快速稳定发展，热带作物资源的不可替代性、地域的不可替代性、产品的不可替代性及其在中国经济发展和国家建设中所具有的地位日益重要。科学收集和保存热带作物资源，以使其能够得到合理的开发利用已成为确保热带作物产业持续稳定健康发展的关键环节[3]。
三、分子克隆技术在热带作物中的应用
分子克隆技术在热带作物中主要用于建立基因文库、分离高产和抗性基因、基因重组选择适当受体和载体以及异源基因的导入等。在热带作物品种鉴定、资源保护以及繁殖育种中起到了重要的作用。
1、 橡胶
橡胶分为天然橡胶和合成橡胶。天然橡胶主要来源于三叶橡胶树，巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)因胶乳产量高、质量好、易于获取而具有商业开发价值，成为世界上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生乔木，常规育种周期长，选育种受到很大的限制。不断发展的基因工程技术解决了传统育种中不能突破的问题，其优点在于可有目的地改变植物的某一性状而不影响其他性状，并缩短育种周期。随着转基因技术的日臻完善，目前已经获得了许多转基因植物，但是橡胶树的基因转化仍存在很大困难。在1994年Arokiaraj等利用基因枪法获得了第一株转基因橡胶植株，随后，在1998年他们又尝试用农杆菌介导法转化橡胶愈伤组织,但是转化效率很低。2000年Montoro等人研究了Ca在橡胶的农杆菌转化中的作用，但未得到转基因植株[4,5,6]。2006年王颖[7]等以GUS基因为报告基因，NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶,Neomycinphosphotransferase)基因为筛选标记基因，用基因枪轰击橡胶愈伤组织进行转化实验，经过质粒DNA提取、愈伤组织诱导、基因枪转化、GUS组织染色和PCR扩增鉴定，初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中。
2、 槟榔
槟榔（Areca cathecu L.）是中国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟）之首，药用价值很高。槟榔产业是海南省热带作物产业中仅次于天然橡胶的第二大支柱产业。自1981年，在屯昌发现槟榔黄化病以来，琼海、陵水、万宁、三亚等地的槟榔种植区相继开始发现黄化病的危害，发生情况逐年严重，发生地点和面积也不断扩大，大量槟榔植株黄化死亡，严重影响了海南槟榔产业的健康发展[7,8]。俞浩等[9]调查认为万宁、屯昌的槟榔黄化病是由缺钾引起。金开璇等[10]通过电镜观察发现海南槟榔黄化病病株的输导组织内存在类细菌（Bacteria-like Organisms，简称BLO）与类菌原体（Mycoplasma like organisms，MLO）菌体，初步认为海南槟榔黄化病是由BLO与MLO复合侵染引起的。在此之后，罗大全等[11]通过电镜观察、抗菌素注射诊断、PCR技术检测，证实海南槟榔黄化病是由植原体（原称类菌原体）引起，但未见从分子水平等方面对其分类地位研究的报道。车海彦[12]等利用植原体16S rDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DNA进行巢式PCR扩增，获得约1.2 kb的特异片段，并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明，引起海南槟榔黄化病病原植原体属于翠菊黄化植原体组（16SrⅠ组），且为该组中一个新的亚组，即G亚组，现将其暂命名槟榔黄化植原体（Arecanut yellow leaf phytoplasma，AYL）。以期为槟榔黄化病快速检测技术体系的建立提供理论依据，为探索该病害的防治奠定基础。
3、香蕉
香蕉属芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa),是人类最早栽培的作物之一。目前具有商品价值的栽培品种,几乎全是三倍体植物,为营养性结实,由于它没有种子,给繁殖和育种都带来一定困难, 近年来,电击法和基因枪法在单子叶植物的基因转移上得到了广泛的应用,因此,对于香蕉来说,电击法和基因枪法可能是最为有效的转化方法。用这两种方法进行转化的最适宜受体是原生质体,但也可用于带壁的细胞如悬浮培养细胞,愈伤组织等。Gawel等利用限制性片段长度多态性(RFLP)对香蕉19个种(或亚种)的系统发育关系进行了研究(1992)及对香蕉叶绿体DNA的RFLP进行了分析(1991);Faure等(1993)利用三种标记(RFLPs,RAPDs和同工酶)对二倍体野生蕉进行了部分分子连锁图谱分析并对这些数据用于进一步的遗传、进化及育种研究进行了讨论[13]。
近年来，植物基因工程技术的飞速发展，为培育抗病毒植物新品种提供了新的途径，Powell等将编码烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因用植物表达载体导入烟草和番茄细胞中使之表达，首次获得了抗TMV的转基因烟草和番茄，此后，杜道林[14]等对海南香蕉花叶病毒外壳蛋白基因进行分离克隆和测序，并将其构建成植物表达载体, 为进一步培育抗花叶病香蕉品种奠定基础。
4、菠萝
菠萝又称凤梨(Ananas comosus)，是世界三大热带果树之一，也是重要的观赏植物和纤维植物，耐干旱瘠薄，生长迅速，因此，将CYP1A1导入菠萝中可培育出具有环境净化功能的新型果树和观赏植物．虽有研究者进行过菠萝遗传转化研究[15-16]，但迄今尚未见P450基因转化菠萝等果树的研究报道．何业华[17]等在根癌农杆菌介导CYP1A1转化菠萝的研究中以菠萝愈伤组织为受体，获得了转CYP1A1的转基因菠萝植株，旨在以该基因提高菠萝对本身及土壤中残留农药等POPs的降解能力。
5、番木瓜
番木瓜(Carica papaya Linnaeus)也称木瓜、万寿果,是热带亚热带多年生草本植物。我国广东、广西、福建、海南、云南和台湾都有种植。对番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV-CP)的分离和转基因工作始于80年代后期、90年代初期，目前在基因的分离克隆、转基因番木瓜进入大田的抗病试验等方面已取得了突破性的进展，但对基因表达与抗病性关系方面却研究得不多，周鹏等通过质粒的提取、RNA斑点杂交和间接斑点ELISA等技术估测了转基因番木瓜中mRNA、蛋白质的表达量，进而检测它们与抗病能力的关系，以、揭示了PRSV-CP转基因番木瓜表达水平与抗病能力的内在联系[18]。
6、木薯
木薯是三大薯类作物之一，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”，是世界６亿人口赖以生存的食粮。由于我国人多地少，木薯作为一种单位面积产量较高的潜在粮食作物和生物能源，其生产对于我国的粮食稳定和生物能源的发展有重要意义。首届中国（博鳌）农业科技创新论坛上获悉，中国热带农业科学院仅用１年的时间，已经完成３个木薯品种的基因组深度测序，同时采用几种超高通量测序技术，综合组装获得较完整的基因组草图，基因组精细图的完成能够阐明木薯基因组结构的基本特征，有利于进行基因定位和基因调控，同时可以利用一些重要的基因来改良木薯品种，为木薯产业提供高产、稳产和综合利用的新品种。
甲醇酵母表达系统是一种较好的外源基因表达系统，它的蛋白质加工方式和高等真核生物相似，为理想的高等真核蛋白表达系统。目前国外从多种植物中克隆了HNL基因，其中Hasslacher等将来自三叶胶的HNL cDNA分别在大肠杆菌、酿酒酵母和甲醇酵母中实现了表达，研究结果表明三叶胶HNL cDNA在甲醇酵母中表达量最高，目的产物可达可溶性总蛋白的30％；而haughes等在大肠杆菌中表达了来自木薯的HNL基因。王丹[19]等在对木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建的研究中，运用RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列．将其克隆至质粒pBluescript SK中进行序列分析，再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPlC3．5K上，经双酶切鉴定表明成功的构建了甲醇酵母表达载体，下一步将构建工程菌，完善发酵条件，以实现木薯HNL的高效表达，为深入研究其作用机理以及开展工业生产奠定了基础。
四、前景及展望
与大宗农作物相比，中国热带作物种质创新和开发利用起步晚，长期处于落后状况。且具自主知识产权的新品种不多，目前仅橡胶树、木薯、甘蔗、荔枝、龙眼、香蕉、柱花草7个属或种列入植物新品种保护名录。香蕉、菠萝、番木瓜、芒果、咖啡等主要依靠引进国外优良品种来发展，产业发展后劲严重不足。热带作物是生物技术开发和研究的重要领域之一，利用好包括分子克隆技术在内的分子生物技术，充分利用和发挥现有的热带作物资源优势，改良现有推广品种，创造新品种，加强热带物种资源的保护。

参考文献：
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[5]Arokiaraj P,Yeang H Y,Cheong K F,et al.CaMV 35S promoterdirectsβ-glucuronidase expression in the laticiferous system of transgenic Hevea brasiliensis(rubber tree)[J].Plant Cell Rep,1998,17:621-625.
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