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细胞壁中的蛋白质蛋白质组学的新视角
细胞壁的蛋白质，是植物细胞壁的基本成分;他们在涉及修改细胞壁组成，剪力墙结构，​​信令和质膜蛋白质在细胞表面的相互作用。细胞壁舱的蛋白质组学方法的应用提出了重要的问题：是有技术问题，具体到细胞壁蛋白质组学？种蛋白质可以发现在拟南芥中的墙壁？他们中的一些意外吗？什么样的翻译后修饰的特点，在细胞壁蛋白日期？这次检讨的目的是讨论利用蛋白质组学，以及一些新的问题，挑战未来的研究迄今取得的实验结果。

细胞壁蛋白建立一个更全面的观点
由于植物细胞中的第一个在1665年由罗伯特·胡克的意见，直到1980年代，细胞壁被认为是刚性的，静态结构。在过去的二十多年中，它有成为明显的细胞壁是一个充满活力的组织细胞是必不可少的细胞分裂，扩大和分化（如动物细胞外基质），以及生物和非生物胁迫响应。它也是细胞信号源承认在相同或不同的生物体之间[5-7]。细胞壁是天然复合材料结构，主要由超高分子量多糖，蛋白质，木质素。木质素只存在于特定的细胞类型中。由于目前的知识细胞壁多糖最近已检讨[8，9]，我们将专注于拟南芥细胞壁蛋白（CWP）可以参与细胞壁成分的修改，剪力墙结构和信令以及质膜蛋白质在细胞表面的相互作用
分子生物学技术和拟南芥基因组的完整测序已经极大地促进了许多CWP的基因家族的描述和他们的转录调控 [10-23]。有人发现，大多数CWP是由多基因家庭编码。系统转录方法结合遗传分析[8]，但这些不解决剪接的发生或翻译后修改的蛋白质。此外，蛋白质可以移动和复合物，修改其功能。这种复杂程度不能使用单独转录处理 [24]。蛋白质组学方法的尝试，不仅给在给定的发展阶段的蛋白质更大的视野，呈现在一个特定的器官上，并且还处理其中的一些问题。植物蛋白质组学的几个最近的评论描述了这方面可用的方法 [24-26]，蛋白质组学中的应用研究细胞壁 [27，28]
在过去三年中，几组采用蛋白质组学研究，以确定CWP，在不同的拟南芥器官。这些研究只评估存在的蛋白质，而其相对丰度仍然不明。新兴的细胞壁蛋白质更准确的眼光：CWP新的家庭和翻译后修饰，除了N和O-糖基化，正在描述。这就提出了一个问题的估计数A.细胞壁的蛋白质存在于拟南芥。答的注解拟南芥基因组显示，约17％的基因组，即5000基因编码的蛋白质与预测信号肽，针对它们的分泌途径。细胞壁在普渡大学的基因组大学（cellwall.genomics.purdue.edu /家庭/ index.html）上列出的答拟南芥细胞壁的组装和修改有关的基因，其中约500个基因编码胞外蛋白。然而，这个数字太低了，因为只有基因家族被认为与已知的生化功能的编码CWP。如果CWP最近在蛋白质组学研究，以及产生的蛋白质的多种形式确定剪接和翻译后修饰，考虑考虑，合理估计将产生1000至2000种不同的蛋白质。在此审查细胞壁蛋白质组学在A拟南芥，我们将分析的结果，讨论了新兴的图片，强调蛋白质组学的具体贡献，并指出在该地区的新观点。
很难把握细胞壁蛋白质
除了蛋白质组分析中通常遇到的困难，如稀缺蛋白的蛋白质分离和检测[29]，CWP目前特别复杂性。他们是嵌入在一种不溶性多糖基质和互动与其他细胞壁成分（1盒），其萃取具有挑战性的。可用的细胞壁蛋白质组包括不稳定和弱结合蛋白（1盒）。弱束缚的CWP提取纯化细胞墙壁与盐或螯合剂。由于不稳定的蛋白质，可以编制过程中丢失细胞壁，他们必须从组织中提取非破坏性的技术，如真空浸润[30]，或细胞悬浮培养的液体培养基或恢复苗[31，32]。至于尚未有没有有效的程序来释放强烈必将以CWP细胞外基质。结构蛋白，的实例伸展或覆检，可交联通过DI-isodityrosine债券[33，34]。到现在为止，已经伸展与盐洗脱之前他们从细胞悬浮培养insolubilization [35]。另一个困难是分离的由经典的二维凝胶电泳的多肽。大多数CWP的基本糖蛋白框1（图1）和缺乏解决这种技术[36]。以上CWP的60％，PI值8和12.9之间，平均为8.5（1盒）。这一数额包括只有少数的结构蛋白，其基本的PI闻名。最后，HRGP大量糖化，他们是很难检测凝胶和抗蛋白酶。这样蛋白质需要的隔离和deglycosylation的具体方法，如发展最近合成伸展使用的[34]和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP） [37]。
专栏1 细胞壁蛋白和细胞壁成分的相互作用
植物细胞壁多糖和蛋白质组成的复杂结构。目前的模型描述成两个结构独立和相互作用及其组成部分的安排网络，在果胶矩阵[5，69]嵌入式。纤维素微纤维和半纤维素构成第一个网络;第二个是由结构蛋白组成。在这次审查中，我们认为作为CWP所有蛋白质分泌到细胞外空间以及蛋白质之间的接口位于细胞膜和细胞壁。在蛋白质组学研究确定的CWPCWP数据库中列出（补充材料）。可分为三种类型，CWP，根据它们之间的相互作用细胞壁的成分。CWP可以有很少或根本没有细胞壁成分的相互作用，从而在细胞外空间自由移动。可以发现这种蛋白质在细胞的液体培养基悬浮或幼苗或可提取低离子强度缓冲。我们呼吁这个分数“活性蛋白”，其中大多数是有酸性的pI范围从2到6（图1）。另外，CWP可能范德华力，氢键，疏水性或弱约束矩阵离子相互作用。 这种蛋白质可提取盐和其中大多数是有基本的pI范围8日至11日，让他们带正电荷的细胞壁酸性pH值（图1）。 即使最细胞壁多糖是中性的，带负电荷的果胶含有半乳糖醛酸与高PI蛋白质相互作用的负电荷。 这种相互作用会是由pH值，钙，果胶酯化度的调制2 +浓度，流动性和这些大分子的扩散系数[70]。 最后，CWP可以强烈约束细胞壁组件，使他们仍然耐盐提取。 作为例子，伸展是交叉链接共价链接[33，71]和过氧化物酶，可以有一个高亲和力的Ca+ -果胶[72]

图1。CWP的pI。 成熟的CWPPI计算后去除其信号肽
是否有不规范的细胞壁蛋白？
非规范CWP，被称为细胞内蛋白质。 他们已经在几个报告高等植物细胞壁蛋白质组的近期出版物[38，39]，绿藻[40]，和真菌[41，42]。 这些蛋白质的存在（ 如糖酵解酶，转录因素，核糖体蛋白）令人费解的是，因为它们不包含预测的信号肽，必要针对分泌途径;他们也不具有理解函数在细胞壁上。 存在一个未知的出口机制不能排除[43]。 在这些研究中，非规范的CWP可以代表一半的蛋白质确定在细胞壁制剂中[38，39]。 他们从孤立的细胞壁中提取，结果是高度依赖净化技术的可靠性。 事实上，这些蛋白质，尤其是基本的，可以由酸性多糖基质离子被困在细胞壁净化。 细胞壁制剂的纯度可以使用标记检查对已知的蛋白质的酶或抗体[38]，但分析工具（质谱）10日至1000倍以上，经典的生化和免疫学检查敏感。 使用非破坏性的技术隔离CWP[30]，只有少数不规范的蛋白质发现，支持的想法，他们很可能是污染物。
新的有关细胞壁蛋白的规范是什么？
对于这次审查中，所有可用的拟南芥细胞壁蛋白质组数据进行了筛选使用生物信息学工具，只选择那些含有一个信号肽的蛋白质，但缺乏的内膜系统的保留信号[31]。 这些蛋白质加入到我们的CWP数据库，现在有281蛋白质（补充材料）[30-32，38，44-46]。 在此外，功能注释使用这两种蛋白质序列比较和检查生物信息学软件设计的屏幕功能域[31，47]。约90％的CWP类生化预测的基础上被放置在（见表1）的生物学功能。 应当指出的是，只有生化功能实验证明确定蛋白质的一小部分。 假设是分享保守结构域的蛋白质具有相同的活动。 最令人惊讶的是，只有一半的蛋白质已经被定性为CWP。 他们是苷（生长激素）的水解酶，的碳水化合物酯酶/裂解酶，膨大，氧化还原酶，结构参与蛋白质和蛋白质的信号，其中大部分的AGP。 另一半是部分已知， 例如一些蛋白酶和外源凝集素已被形容为是外[9，48，49]。 最耐人寻味的是，其余10％的蛋白质，没有任何相似在其他生物体中已知的蛋白质。 面临的挑战是阐明其生物学作用，在细胞壁。
这项检讨兴建的CWP数据库（补充材料）包括每个鉴定蛋白质的来源。 相同的蛋白质被发现在不同的细胞壁器官呢？ 为了回答这个问题，我们选择了三套数据，涉及到：叶含有分化细胞的花环，充分发展，在白化下胚轴分析伸长率，7日龄的悬浮培养细胞时，细胞正在积极分裂的结束扩大。 所有这三个蛋白质组分别获得使用媲美盐提取协议，电泳，通过的MALDI-TOF质谱鉴定蛋白质的分离。可比性的基础上确定在一个特定器官的特定蛋白质。 的差异多糖组成，细胞壁结构，低丰度的蛋白质，或邮寄翻译后修饰可能导致它不是在实验过程中发现的。
表1。 预测不稳定和弱束缚的CWP的功能类。
从数据的基础上的281蛋白质（补充材料）被组装在功能类和子类中的蛋白质的功能域的存在。对多糖的蛋白质，包括糖苷水解酶，酯酶，裂解酶和膨大; oxido-还原酶过氧化物和黄连桥酶蛋白质相互作用的领域包括与外源凝集素或LRR类域的蛋白和酶抑制剂。 数据源于花环，细胞悬浮培养，白化下胚轴及幼苗，文化细胞悬液或白化苗，原生质体的媒体。
功能类
确定蛋白质％
蛋白多糖的行为
29,5％
糖苷水解酶
21％
酯酶/裂合酶
5.5％
膨大
3％
oxido-还原酶
13.5％
过氧化物酶
6％
小檗碱桥酶
2.5％
结构蛋白
1.5％
蛋白质参与的信号
8％
蛋白酶
10％
蛋白质相互作用域
10％
凝集素域
2.5％
LRR类域
3.5％
酶抑制剂
3％
杂项
16.5％
未知函数
10％
在确定每个蛋白质和一些共同CWP数量如图1a所示。 一个有趣的事实是十一蛋白存在共同所有三个器官。 这些蛋白质在仔细观察就会发现：两个生长激素，两个机动设备，一个germin，一种蛋白，四相互作用域的蛋白（凝集素和番茄的一个同源特定的木葡聚糖内切葡聚糖酶抑制剂蛋白质），和一个未知功能的蛋白质。
有趣的是，这两个生长激素是由单个基因编码的α-木糖苷酶（At1g68560）。 现在的问题是：这些CWP代表一组的看家蛋白，所有类型的细胞壁至关重要？
部分墙体白化下胚轴细胞蛋白质组学，细胞悬浮培养，比较图1。
莲座叶。 CWP不稳定和弱束缚的代表出席了会议。 （一）维恩图的重叠
三者之间的细胞壁蛋白质组的。 （二）直方图显示功能不稳定的类和弱束缚
CWP在不同器官。 功能类，如表1，并在CWP数据库中列出的所有蛋白质
（补充材料）。
确定一个蛋白质CWP至少有50％没有被发现在别人，因此可能会具体到这种类型的细胞壁。 这部分是挂高数每个CWP的家庭，这可能是在开发过程中不同监管发现的基因。更详细的分析（图1b），CWP类，在每一个器官确认在所有情况下，最能代表的蛋白质，是那些对细胞壁多糖的演技。 如预计从事实生长激素确定CWP占20％（见表1），蛋白质作用于细胞壁多糖也具有最高的多样性在每个类别器官。氧化还原酶是细胞悬浮培养，特别是众多的，可能是由于连续纺生产的机械应力，氧化应激发生在液体培养基中培养。 在一些盐提取结构的唯一机关蛋白质被确定是黄化的下胚轴，可能是因为这种蛋白质尚未
完全不溶性。 蛋白质与蛋白质相互作用域或多糖代表在所有器官，尤其是在玫瑰花。
著名的细胞壁蛋白：蛋白质组学的教训
蛋白质组学分析提供了一个很大的优势：他们可以精确识别蛋白质属于同一个家族，每个成员在不同的检测器官。 作为一个例子，图2显示了每个GH家族成员的数量发现在莲座叶，白化下胚轴细胞悬浮培养。 生长激素已被列为基于序列的CAZy同源性。 在玫瑰花和白化下胚轴已经确定，23日和17日生长激素分别，而只有在细胞培养13。 意想不到的大量不同的生长激素，建议在成熟叶片细胞壁，经过不断的变化。 相比之下，低在细胞培养中发现的数量是惊人的，因为生长激素预期得到很好的体现在细胞分裂和伸长，重塑自己的多糖。 然而，这种低也可以是由于缺乏细胞分化的细胞培养。 各器官似乎有特别的GH分布（图2）。 这将是有趣的，将这些为更好地了解多糖酶的活动，以他们的基板在细胞分裂过程中，细胞扩增和分化的细胞壁重塑。 同一gh分布在不同器官之间的差异被发现在其他蛋白质家族，，如氧化还原酶。

图3。三个细胞壁蛋白质组的糖苷水解酶的发生。 数据来源于从白化胚轴，7日龄悬浮培养细胞和莲座叶，在CWP数据库（补充上市材料）。 糖苷水解酶被列为据的CAZy术语，基于序列同源性。
蛋白质组学的另一个特点是通过蛋白质的结构表征翻译后修饰的分析。 糖基化，羟基化，以及许多其他的修改，是必要的，因为他们决定结构，本地化和活动。CWP等特性，是体现糖基锚蛋白（GAP），其中AGP [37，45]。 这些蛋白质的属性允许特定净化程序，以及他们为CWP的一个子集的分离。 它被发现，各种蛋白家族是脂质锚到血浆膜通过糖基（GPI）（补充材料）。 表征阿拉伯半乳聚糖肽基（集团）导致GPI锚定的存在，并确定为8个​​公司的12肽裂解位点的内质网分泌信号和GPI锚定信号的实验证据。 此外，新的翻译后修饰被发现在公司多肽，即脯氨酸羟基甘氨酸临图案内的[37]
迈向新细胞壁的生物功能
蛋白质组学研究打开新的视野，扩大我们的CWP知识。 “识别不同类型的蛋白质相同的生理过程也应有助于更好地了解细胞壁的功能，如下面的例子所示。已知的一些蛋白酶在细胞壁由免疫本地化方法和酶的活动[9，50]。 蛋白质组学提供的额外信息蛋白酶，极大的多样性，如枯草杆菌，羧，天门冬同源半胱氨酸蛋白酶。 到目前为止，在 A. 拟南芥突变体sdd1-1（气孔密度和distribution1的-1）是唯一的突变影响的基因编码细胞壁蛋白酶[49]。 “气孔格局被打乱的突变，导致气孔集群和增加气孔密度。 然而，过度的 SDD的产生相反的表型。 “作者提出，SDD1产生的细胞外信号调节不对称分裂在卫星meristemoids中。 蛋白酶可以因此发挥的作用参与开发，他们也可能会导致CWP的营业额，产生的信号过程仍知之甚少。
蛋白质相互作用，如凝集素或LRR类的域（富含亮氨酸重 ​​复）蛋白质可能在细胞壁中发挥重要作用。 事实上，三个凝集素被发现，在所有细胞壁的蛋白质组讨论，在这里，重要的是自我碳水化合物识别在植物细胞壁的非自治的交互。 该研究提供了有趣的证据受精卵分泌（ZSP的 莱茵衣，其中有两个凝集素和蛋白质）-2HRGP域[51]。 作者提出，原ZSP-2糖基结合，有利于组装受精卵细胞壁。 因此，凝集素可能是必不可少的组织和多糖基质的组装。 LRR类含蛋白质被认为互动其他蛋白质。 尤其是，多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）以及已其结构特点是：它的结构已经建立了X射线晶体学[52]和真菌多聚半乳糖醛酸酶的差的亲和力已经涉及到它的LRR类域[53]。此外，它表明，一些LRR类受体蛋白激酶在重要的角色发展或抗病[53]，许多被认为是参加在信号。然而，他们的配体和配体结合位点的信息，在很大程度上仍然缺乏。氧化还原反应发挥在开发过程中以及在植物细胞壁中的许多角色病原体攻击[54-57]。 除了 ​​以过氧化物，可能是几个CWP在这些过程参与。 例如，黄连桥同源（S）网状：氧气从 罂粟和小檗 氧化还原酶（BBE的）在细胞壁中被发现。 古典BBE的定位于液泡，并参与生物碱的合成[58]。 然而，A.拟南芥蛋白质预测是外[31]，并于最近，分泌烟草的BBE被发现有葡萄糖氧化酶的活性[59]。 细胞壁BBE的底物特异性因此，从液泡蛋白质的不同。 germins和germin样蛋白无处不在的植物蛋白构成的庞大和多样化的家庭。 谷物，他们作为密切相关，半纤维素，草酸氧化酶，合成是其中描述挂在增加细胞壁的可扩展性[60]。 在几个双子germin样蛋白，这活动无法进行评估。 然而，棉花germin样蛋白被发现纤维质外体中的积累在细胞伸长[61，62]。 最后，phytocyanins，我们的数据库中的“杂项”，又称蓝铜蛋白，可能关联，随着小分子量的化合物，作为电子转移的蛋白质氧化还原过程[59]。 除了 ​​铜结合域，stellacyanins和uclacyanins有细胞壁结构的蛋白质结构域，这意味着协会的可能性其他结构蛋白。
新人在细胞壁中的挑战
与未知功能的蛋白质是在CWP组的最大挑战之一。从我们的实验中，它看来，这些蛋白质是细胞的主要组成部分墙蛋白质。 还应当指出，一个未知功能CWP是共同三个分析蛋白质组。 在蛋白质结构专家已经定义了一些“域的未知功能“（DUF）共享通过几个蛋白质家庭。 DUF不显示任何的同源性已知函数域，其中一些是特定的植物蛋白。 事实上，一些这些蛋白质只能在植物中被发现，它们可能是在细胞壁丰富，他们有没有已知的功能，使他们未来研究的首选目标。
结束语
在这次审查中，我们已经表明蛋白质组学多个捐款CWP的知识。 蛋白质组分析允许：i）一个成员的精确识别在特定器官的CWP家庭;二）新CWP鉴定（其中的蛋白质未知功能）;三）研究翻译后的表征CWP修改;四）在一个特定的概述所有的蛋白质存在于细胞壁生理阶段。 然而，这是冰山的一角，一个大的努力，应作出增加的数量确定的CWP。 对CWP可以得到更多的信息利用蛋白质组学方法已开发的方法，提高提取CWP强烈势必细胞壁的成分，如多糖或木质素，和/或分离CWP之前，鉴定质谱[63，64]。 由于定量数据仍然失踪，样本之间的精确的比较，可以继续运用现有技术进行差异蛋白质组学研究[65，66]。 的理解生化和/或生物功能的蛋白质，越来越多地呼吁罚款表征CWP[37，67]。 CWP互动与其他细胞壁组件，包括CWP或质膜蛋白质。 这种相互作用可以使用的BIA研究（生物分子相互作用分析）-MS技术[68]。 所有这些数据将提供更好的CWP，遗传学，生物化学和分子生物学相结合的知识，可以导致了解CWP的作用，在植物生长发育，信号，防御和适应环境。
致谢
作者感谢大学的保罗·萨巴蒂尔（法国图卢兹）和国家科学研究中心支持。 他们责成到，洛雷纳杜邦Lezica和戴安娜Mosovich为他们的种类修订手稿。

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