NY∕T 3032-2016 草莓脱毒种苗生产技术规程(农业).pdf

ICS 67.080.10 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 3032一2016草莓脱毒种苗生产技术规程Technical code for the production of virus-free strawberry stock 2016-12-23发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布目。昌本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国果品标准化技术委员会(SACjTC5 10)归口。NYj T 3032-2016 本标准起草单位:沈阳农业大学、北京市农林科学院林业果树研究所、湖北省农业科学院经济作物研究所。本标准主要起草人:张志宏、刘月学、张运涛、顾玉成、代红艳、常琳琳、李贺、王桂霞、向发云、马跃、韩永超。I NY/ T 3032-2016 草莓脱毒种苗生产技术规程1 范围本标准规定了草莓茎尖培养脱毒方法、脱毒种苗保存与繁殖、检测病毒种类和RT-PCR检测方法。本标准适用于草莓脱毒种苗的培育及草莓活体材料中病毒的检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 茎尖培养脱毒virus elimination by sht tip culture 取O.2 mmO. 5 mm的茎尖，经组织培养获得无病毒植株的过程。2. 2 脱毒原原种苗br时ers virus-free stock 通过茎尖培养获得的不携带草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓斑驳病毒且未经过组培增殖的元病毒原始植株。2. 3 脱毒原种苗original virus-free stock 脱毒原原种茵通过匍匍茎繁殖方式繁育出的无病毒植株。2. 4 脱毒种苗virus-free stock 脱毒原种苗通过匍匍茎繁殖方式繁育出的元病毒植株。3 茎尖培养脱毒方法3.1 茎尖剥离及接种田间选择表现品种特性的健壮植株并做标记。在匍匍茎发生初期，采集长约2cm的匍甸茎顶端，在超净工作台上去掉外层苞叶，用70%乙醇表面消毒305，然后用2%的次氯酸锅溶液消毒10min.再用元菌蒸馆水冲洗3遍。逐层剥去匍甸茎顶端上的叶原基，用元菌刀片切取O.2 mmO. 5 mm大小的茎尖，接种在分化培养基上(培养基配方参见附录A)。将接种后的培养瓶置于(23士2)OC、光照强度约24001x、每天光照时间14h16 h的培养室中进行培养。3. 2 茎尖分化成苗茎尖培养2个月后，分化成带有叶原基的小芽，将小芽转接到新鲜的分化培养基上继续培养。当小芽长出叶片后，将带有叶片的小芽转移到成苗培养基上(培养基配方参见附录A)，大约培养2个月后分化成苗丛。对苗丛进行编号，然后从苗丛上剪取叶片进行病毒检测，淘汰感染病毒的苗丛，保留无病毒苗丛。3.3 生根和移栽从脱毒苗丛上剪取株高在2cm以上的试管苗，将试管苗基部的小芽切除，然后接种在生根培养基中(培养基配方参见附录A)。在组培室中生根培养30 d40 d后，将培养容器置于覆盖100目纱网的NY/ T 3032-2016 温室中，炼茵l周。炼苗后，用慑子从培养容器中取出生根的试管苗，清除试管苗根部附着的培养基，然后栽人盛有营养基质的50孔六盘中，浇透水。营养基质配制方法:将草炭、蛙石、细土、腐熟的牛粪按照5: 2 : 2 : 1 (体积比)的比例混合，按1kg/ m3加入氮磷饵(20-5-10)复合肥，混匀，过筛，高温蒸汽消毒，备用。在穴盘上方搭建塑料小拱棚，塑料薄膜上加盖遮阳网。温度控制在100C280C。移栽后第1周，空气相对湿度控制在90%以上;移栽后第2周第6周，空气相对湿度控制在80%以上。通过打开小拱棚上的薄膜来降低小拱棚中的湿度。移栽6周后撤除小拱上的薄膜。移栽8周后试管苗生长发育成为可以定植的脱毒原原种苗。4 脱毒原原种苗的保存脱毒原原种苗在网室并更换工作服。将器长1m、宽60cm、在开花结果期，于容洗植前栽室网中人器进容口贝人作10 cm的10 km 以上的酸钙30kg。株，在莓生产园5 m3、过磷苗作为母7 病毒检测7. 1 检测病毒种包括草莓镶7. 2 检测方法RNA提取方法参见附录7. 3 检测时期和取样部位试管苗和田间苗均可进行病毒检测。设置3次生物学重复。7. 4 检测结果判定将RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后置于凝胶成像仪中观察拍照。凝胶电泳模式图参见附录C。检测时设阳性、阴性植株对照，阳性对照植株应扩增出预期大小的单一目的条带，而阴性对照植株扩不出任何条带。如果样品扩增出与阳性对照位置相同的目的条带，则检测结果呈阳性，即判定该样品携带病毒。如果样品未扩增出目的条带，则检测结果呈阴性，应进行复检;如果复检结果仍呈阴性，则判定该样品为元病毒苗。2 A.1 培养基基本成分如元特殊说明，本标基本培养基各好后置40C冰制备培养沉淀，则应A. 2.1 A. 2. 2 附录A(资料性附录)培养基配方NY / T 3032-2016 溶剂溶解后蒸馆水定容，配不超过4个月，如发现(6 g/ L7 g/ L) 2 mg/L.用琼脂1 mg/ L.用琼脂3 NY / T 3032-2016 附录B(资料性附录)RNA提取方法B.1 称取50mg新鲜叶片，放于研钵中，加入液氮后充分研磨。B.2 将磨碎组织转移至1.5 mL离心管中(预先加入含2%-琉基乙醇的500LCTAB提取缓冲液).650C保温20min.期间将离心管颠倒3次5次，每次大约10508.3 加入600L氯仿/异戊醇(V/V=24 : 1).轻轻颠倒若干次后40C、10000r/ min离心10mi口。取400L上清液，移入新的1.5 mL离心管，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V = 24 : 1).轻轻颠倒1 min.40C、10000r/ min离心10min。B.4 取240L上清液，加入1/4体积的10mol/ L LiCl，颠倒混匀-200C放置1h.然后40C、10 000r/min离心10mino 8. 5 弃上清液，加入350LTE缓冲液溶解沉淀.40C、10000r/min离心10min。B.6 弃沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24 : 1).轻轻颠倒1min. 10000 r/ min离心10min。8.7 将200L上清液移入新的1.5 mL离心管，加入1/10体积的3mol/ L NaAc(pH 5.2).混匀后再加入2倍体积冰冷的无水乙醇，颠倒?昆匀，一200C放置30min.然后40C、10000r/min离心10mino 8.8 弃上清液，加入500L70%乙醇洗涤沉淀，共2次。B.9 超净工作台上吹干，用50LDEPC水溶解沉淀，测定总RNA浓度，立即进行反转录操作或保存于-700C超低温冰箱中备用。4 NY/T 3032-2016 附录C(资料性附录)RT-PCR检测方法C. 1 cDNA合成在0.2mL离心管中依次加入30ng50 ng总RNA，lLdNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度各为2.5mmol/ U ，0.5L随机引物(9-mer)(50mol/U ，0.5L oligo d(T) 18 (50mol/U，无菌超纯水定容至14.5Lo650C处理5min后取出置于冰上冷却2mino再加人4L5XAMV-RT缓冲液、O.5LRNA酶抑制剂(RNa5i口)、1LAMV反转录酶，t昆合均匀后3 7C处理2h合成cDNA，然后700C处理15min以去除残余酶活性。C. 2 PCR扩增PCR反应混合液共20L，包括2LcDNA、2L10XPCR缓冲液、1.6LdNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度各为2.5mmol/ U、正向引物(浓度为10mol/UO. 4L、反向引物(浓度为10mol/ UO. 4LC引物序列参见表c.1)、1U热启动TaqDNA聚合酶，用元菌超纯水定容至20L。表C.1 PCR引物序列及扩增产物大小病毒名称引物序列(5-3) 产物，bp草莓轻型黄边病毒(SMYEV)正向引物:GTGTGCTCAATOCAGCCAG 271 反向引物:CATGGCACTCATTGGAGCTGGG 正向引物:TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG 219 草莓斑驳病毒(SMoV)反向引物:TCfGGGCTTGGATCGTCACCTG 正向引物:GAATGGGACAATGAAATGAG 278 草莓镶脉病毒(SVBV)反向引物:AACCTGITCTAGCTTCTTG 按如下程序进行PCR扩增:940C2 min;940C 305、550C305、720C305，共35个循环;720C延伸5min。C. 3 RT-PCR产物检测将RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后置于凝胶成像仪中观察拍照，结果参见图C1。M 234 M 234 300 bp +1. 300 bp+ 200 bp+ 1;.;JII 200 bp+ a) SMYEV b) SMoV 说明:M一-Marker;1-3一一感染病毒植株;4 元病毒柏株。300 bp 200 bp 图C.l草莓病毒的RT-PCR扩增产物M 2 3 4 c) SVBV D