TRIM2通过泛素化修饰PKM2调控肝癌细胞糖酵解机制的研究.pdf

.():.():.():.():./.():.闫丹措逯艳艳刘芝兰等.通过调节 /轴对人胃癌细胞增殖凋亡和侵袭的影响.河北医学():./.():.司刚司贞钟国南等.在乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及作用机制.山西医科大学学报():.():.陈剑.宫颈癌患者血清 和 表达水平及与预后的关系.现代实用医学():.():./.():.(编校:蔺玥)通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解机制的研究唐津天唐润娟薛 峰易 超黎旺红刘 晨新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科新疆 乌鲁木齐 新疆医科大学第二附属医院康复科新疆 乌鲁木齐【摘要】目的:探究 通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解的机制 方法:和 数据库分析 基因及蛋白表达水平并结合病人生存状态进行相关性分析 构建 和 细胞株细胞能量代谢仪检测两组细胞胞外酸化率和耗氧率并测定细胞葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平 免疫共沉淀验证 和 在、细胞中相互作用免疫荧光检测 和 共定位 免疫共沉淀检测在/细胞中敲低/过表达 后 的泛素化修饰水平体外酶催化反应检测在/细胞中敲低/过表达 后 酶活性 小室法检测 和 细胞侵袭和迁移能力 皮下移植瘤实验检测 和 细胞体内成瘤能力 结果:和 数据库分析发现 在肝癌组织中 及蛋白表达水平均升高高 表达预示差的患者生存状态 表达水平与糖酵解通路相关 性 高 敲 低 可 抑 制 胞 外 酸 化 率 提 高 耗 氧 率 细 胞 葡 萄 糖 吸 收 率(.)(.)、乳酸产生量(.)(.)、水平(.)(.)均显著下调 与 在 细胞中相互作用且蛋白共定位 抑制后 细胞中 泛素化水平升高 酶活性降低在 细胞中表达 下调 蛋白泛素化修饰水平提高 酶活性 敲低抑制细胞侵袭能力(.)、迁移能力(.)抑制细胞体内成瘤体积(.)(.)和重量(.【收稿日期】【修回日期】【基金项目】新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(编号:)【作者简介】唐津天()男新疆乌鲁木齐人副主任医师博士主要从事肝胆胰良恶性肿瘤的外科诊疗研究 :.现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .)(.)结论:在肝癌组织中高表达通过去泛素化修饰 促进其酶活性进而调控肿瘤细胞糖酵解能力【关键词】肝癌泛素化糖酵解【中图分类号】.【文献标识码】:./.【文章编号】().【】:.:./.:.(.)(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.)(.)(.).:.【】():肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一被认为是肝硬化患者的主要死亡原因 肝细胞癌的发生是体细胞基因组改变的结果除了表观遗传学改变之外还有免疫微环境改变的积累肿瘤的发生具有明显的分子异质性肿瘤产生的原因十分复杂 而目前提出的肝细胞癌的分子分类中没有能够预测疾病的进展或复发 三元基序蛋白()家族有 多个蛋白其家族成员主要在细胞生长、分化、凋亡、炎症和免疫过程中发挥重要作用 家族的蛋白质包含一个保守的“”模块其中包括 结构域、结构和盘状线圈区域 三元基序蛋白()属于 蛋白家族是一种环指 泛素 以前的研究表明 与癫痫的神经活动相关 缺乏可以减少神经纤维素的泛素化从而引起神经元的生成性变化 此外 可以利用泛素化来降解 样蛋白()在快速缺血耐受诱发神经保护 近年来越来越多的证据显示 在许多癌症中高表达与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移和肿瘤的血管生成有关如乳腺癌中 高表达参与他莫西芬耐药性形成 直接去泛素化并稳定 蛋白介导肺腺癌的增殖和转移抑制 会抑制骨肉瘤细胞活力和细胞侵袭唐津天等 通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解机制的研究能力并增加细胞凋亡率 的减少也抑制了裸鼠模型中骨肉瘤的发展和转移 然而 在肝癌中的功能鲜有报道故本文就 在肝癌中的功能进行研究为阐述 在肝癌中的分子机制进行探究为肝癌治疗提供更多的策略 材料与方法.材料肝癌细胞、从上海中科院细胞库购买、抗体购买于 公司 抗体、()、()抗体、试剂盒购自 公司.方法.细胞培养与慢病毒感染、细胞转染 细胞培养于含体积比 胎牛血清的 培养基中细胞培养至汇合率达 时进行细胞传代 、慢病毒购买自上海吉玛基因公司在细胞过夜贴壁培养后按 取适量病毒感染 之后更换为完全培养基继续培养至 用 /的嘌呤霉素持续筛选两周.、.、.真核表达载体由本实验室构建之后按体积比 转染 细胞转染后 更换为正常培养基继续培养至 收取细胞进行后续实验.裸体小鼠异种移植试验将 细胞、细胞(个细胞)皮下注射到/裸鼠(周龄雌性)的两翼这些裸鼠购自新疆医科大学实验动物中心 每三天用游标卡尺评估一次肿瘤大小以下公式计算肿瘤体积:体积/长直径 短直径 在注射后 天对肿瘤进行解剖和称量 裸体小鼠肿瘤发生试验得到了我院伦理委员会批准并按照实验动物护理和使用指南的规定进行.、数据分析及基因集富集分析 及 网站下载相应肝癌数据基于 语言进行数据处理及差异分析及生存期分析 使用基于 数据库的 .进行基因集富集分析()富集结果是根据基因组的 次随机排列产生的按平均归一化富集分数()排列.细胞外酸化率和耗氧率细胞外酸化率()和耗氧率()使用 仪器进行分析 实验时用补充有 /丙酮酸、/葡萄糖和 /谷氨酰胺的测定培养基()取代细胞培养基在 下持续.然后用 细胞线粒体应激试剂盒()测量 低聚霉素和 的浓度分别为./和./对于 试验将细胞在含有 /谷氨酰胺的试验培养基中于 培养.然后用糖酵解应激试剂盒进行测量 和 的结果使用 软件分析.细胞代谢测定使用商业试剂盒()按照制造商的说明书测量培养基中的葡萄糖和乳酸浓度 根据制造商的说明使用 发光法()对 进行量化 丙酮酸激酶活性按照商业试剂盒()说明书测定.小室法检测细胞迁移与侵袭用铺有 胶的 小室检测细胞迁移侵袭用不含血清的 培养基将 和 细胞稀释至 个/每孔接种 细胞 小室置于 孔板中细胞培养箱中培养 后取出小室用无水甲醛固定 结晶紫染色 清洗晾干显微镜下观察拍照用 统计各组细胞的迁移和侵袭细胞数.免疫共沉淀和 免疫共沉淀:收集用 培养皿培养的状态良好的 细胞或转染对应质粒 后的 细胞 加入 细胞裂解液冰浴裂解 离心 收集上清为总蛋白 法测定蛋白浓度 调整蛋白浓度为/分组分别加入对应抗体(.)和/()包被的琼脂糖珠于 过夜孵育结合次日用 充分洗涤三次每个样品加入 蛋白上样 沸水浴 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白湿转法转印目的蛋白至 膜上 脱脂奶粉室温封闭 一抗于 过夜孵育次日孵育二抗 显影呈像.统计学分析 用来统计相关的数据.软件用来绘制图片 每个实验均独立重复次两组间比较采用均值检验多组间比较采用单因素方差分析 .、.、.、.表明两组数据差异比较具有统计学意义 结果.在肝癌组织中的表达水平及与预后的关系 数据库分析结果显示与正常肝脏组织相比 在肝癌组织中显著高表达(.图)分析肝癌患者生存周期结果显示 水平与患者生存周期具有较强联系 低表达的肝癌患者生存时间长于 高表达的患者(图)此外通过 蛋白组学数据库挖掘结果显示肝癌组织中 蛋白表达水平显著高于正常肝脏组织(.图)蛋白表达与患者总体生存周期联合分析实验结果显示 蛋白高表达组患者生存时间短于 蛋白低表达组(图)上述结果显示在肝癌组织中 及蛋白表达水平均异常高表达低表达 的患者拥有更长的生存周期.敲低 抑制肝癌细胞 糖酵解基因功能富集()分析结果显示 基因表达与糖酵解通路相关性高 高表达组的糖酵解富集分数显著高于 低表达组(图)实时荧光定量 和蛋白质免疫印迹法检测发现感染 病毒的 组细胞中 的 及蛋白表达低于 组 细胞说明成功构建了 敲低细胞株可以用于后续实验(图 )肝癌细胞能量代谢分析发现 组细胞胞外酸化率高于 组(图)组细胞氧气消耗率显著高于 组细胞(图)此外 组相对细胞葡萄糖吸收率(.)、乳酸产生量(.)、水平(.)都显著低于组(.)、(.现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .)、(.)细胞(.、.、.图 )上述结果显示 表达水平与糖酵解通路相关敲低 抑制细胞糖酵解水平细胞内葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平都显著下调图 在肝癌组织中的表达水平及与预后的关系:数据库中分析正常肝脏组织和肝癌组织中 的 表达:表达水平与肝癌患者生存关系:数据库中分析正常肝脏组织和肝癌组织中 的蛋白表达:蛋白表达水平与肝癌患者生存关系 .:.:.:.:.图 敲低 抑制肝癌细胞 糖酵解:基因富集检测 基因表达与细胞糖酵解水平的关系 :和蛋白质免疫印迹法检测 细胞中 的敲低效率 :检测 、细胞胞外酸化率和耗氧率 :检测 、细胞葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平 .:.:.:.:.与 直接相互作用 型丙酮酸激酶()在肿瘤细胞有氧糖酵解过程中发挥重要作用 我们通过蛋白 蛋白相互作用数据库交互分析发现 与 存在预测的相互结合能力 故在肝癌细胞中 可能为 调控细胞糖酵解水平的下游蛋白 免疫共沉淀检测结果显示使用 抗体作为捕获抗体可以成功吊取 蛋白(图)同时使用 抗体作为捕获抗体亦可成功吊取 蛋白(图)通过在 细胞中异源表达 和 蛋白通过 抗体可以成功吊取 和 蛋白(图)此外免疫荧光实验结果显示 和 在 细胞中共定位(图)上述结果显示在 细胞中 和 蛋白可直接相互作用唐津天等 通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解机制的研究图 与 直接相互作用:免疫共沉淀检测 细胞中 和 相互作用 :细胞中检测 和 相互作用:免疫荧光检测 和 细胞内定位.:.:.:.抑制 泛素化修饰增强其酶活性泛素化修饰水平结果显示 组细胞中 泛素化修饰水平高于 组细胞(图)此外在 细胞中异源表达 、时 的表达会减弱 蛋白的泛素化修饰水平(图)泛素化蛋白酶体途径调控着细胞内蛋白降解为了探究 可能影响 的蛋白稳定性我们使用蛋白质免疫印迹检测 和 组细胞蛋白水平结果显示两组细胞中 蛋白表达没有明显变化(图)通过分析 酶活发现 组细胞 酶活显著低于 组细胞(.图)在 中检测 酶活结果显示 表达减弱了 的酶活(.图)而 过表达显著增强了 的酶活(.图)上述结果显示在 细胞中敲低 泛素化修饰水平大幅度提高不改变蛋白稳定性降低 酶活性在 中过表达 蛋白明显降低泛素化修饰增强 酶活性图 抑制 泛素化修饰增强其酶活性:细胞中检测 泛素化修饰:细胞中异源表达 、检测 蛋白泛素化修饰水平:蛋白质免疫印迹检测、细胞中蛋白表达水平:检测酶活性 .:.:.:.:.现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .过表达 逆转 敲低抑制的糖酵解水平蛋白质免疫印迹法检测发现在敲低过表达 质粒的 组细胞中 的蛋白表达高于 组细胞说明成功构建了 在 细胞中成功过表达可以用于后续实验(图)肝癌细胞能量代谢分析发现 组细胞氧气消耗率显著高于 组细胞(图)组细胞氧气消耗率与 组相当而 组细胞氧气消耗率低于 组恢复到 组水平(图)此外 组相对细胞葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平都显著高于 组细胞(图 )上述结果显示 过表达降低 细胞氧气消耗率细胞内葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平都显著上调图 过表达 逆转 敲低抑制的糖酵解水平:蛋白质免疫印迹法检测 细胞中 的敲低和 过表达效率:检测各组细胞耗氧率 :检测细胞葡萄糖吸收率、乳酸产生量、水平:差异无统计学意义 .:.:.:.:.促进肝细胞癌进展细胞划痕损伤愈合实验结果显示相比于 组 组细胞 的愈合能力减弱(图)小室法检测细胞迁移与侵袭结果显示 组的相对细胞迁移能力(.)和侵袭能力(.)显著弱于 组(.图 )体内成瘤实验结果显示 组肿瘤体积(.)和重量(.)显著高于 组(.)(.)(.图 )上述结果显示敲低 会减弱 的损伤愈合、迁移、侵袭能力并且抑制 细胞体内成瘤能力 讨论乙型肝炎病毒()和丙型肝炎病毒()的肆虐及高感染率导致我国肝癌发病率和死亡率逐步上升 作为促瘤因子参与多种癌症进程 在胰腺癌中 高表达激活 相关的/轴促进癌症进程在上皮性卵巢癌中 缺乏导致异常的 升高促进上皮性卵巢癌细胞的增殖、集落形成能力、侵袭性和体内致瘤性在结肠癌中 通过调控 蛋白稳定性参 与肿 瘤 生 存 调 控 本研究通过 和 数据库挖掘发现无论是 还是蛋白水平 都在肝细胞癌中异常高表达并且较高 表达预示着更差的患者生存状态 随后在肝癌细胞系 中敲低 发现可以抑制 细胞划痕损伤愈合能力抑制肿瘤细胞侵袭和迁移 体内成瘤实验检测发现 组小鼠体内肿瘤体积和重量均比 组小 我们的研究表明了 在肝癌组织中高表达通过 敲低肝癌细胞中 表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移且抑制其体内肿瘤形成能力唐津天等 通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解机制的研究图 促进肝细胞癌进展 :检测 、细胞划痕损伤愈合()、迁移、侵袭能力 :检测 、细胞体内成瘤体积和重量 .:().:.癌细胞的新陈代谢与正常细胞有巨大差异 肿瘤细胞具有新陈代谢活跃更高的增殖率抵御正常的细胞死亡途径等特征 众所周知在 世纪 年代沃伯格提出癌细胞中糖酵解比正常细胞活跃并使用更多的葡萄糖以产生更多的 来支持肿瘤细胞的代谢活动 目前新陈代谢的新方法和新疗法开始成为癌症研究中具有吸引力的课题研究肿瘤细胞中重要的基因、酶等以期望了解癌细胞的代谢调控途径为癌症治疗提供新的策略 我们的研究发现通过对肝癌患者中 表达量进行高低分组进行差异分析基因富集聚类发现 的差异化表达与糖酵解同路有着紧密联系由于 位曾有过关于细胞内糖酵解方面的研究故我们想探究 在肝癌中是否参与调控糖酵解过程 在 细胞中敲低 后细胞胞外酸化率下降耗氧率显著提高 同时我们检测了细胞内葡萄糖吸收率、乳酸生成量、水平发现抑制 可大幅下调细胞内葡萄糖吸收率、乳酸生成量、水平 这些结果表明在肝癌中 参与调控糖酵解过程高表达的 可以促进细胞糖酵解作为泛素化 连接酶 通过其酶活性参与多种蛋白的翻译后修饰进而调控细胞内稳态同时 也可发挥去泛素化酶的功能对底物蛋白进行修饰 在肺腺癌中 直接去泛素化并稳定 蛋白介导肺腺癌细胞的增殖和转移 通过在线数据库分析预测发现 与糖酵解通路中的 蛋白可能存在相互作用我们实验发现在 细胞中免疫共沉淀法检测发现 和 之间存在相互作用 同时我们在 细胞中异源表达 和 两者之间依然具有相互作用免疫荧光实验也表明 和 在 共定位 为进一步分析 是否作为 的泛素化修饰底物我们检测了敲低 后 的泛素化修饰结果发现 敲低后 泛素化修饰水平显著升高 此外在 细胞中表达 可抑制 的修饰水平 泛素蛋白酶体途径是调控细胞内蛋白降解的重要机制然而我们发现 对 的泛素化修饰调节并不影响其蛋白质稳定性 随后对 酶催化活性的分析发现在 中敲低 可有效抑制 的酶活性而在 细胞中过表达 后 的酶活性显著提高 我们的研究表明了 可以去泛素化修饰 蛋白不影响 的蛋白质稳定性促进其酶活性参与糖酵解过程综上所述我们研究发现 在肝癌组织中高表达其表达水平的升高预示着更差的患者生存状态抑制 可有效抑制肿瘤细胞侵袭、迁移和体内肿瘤形成能力 其作用机制可能为 作为去泛素化修饰酶介导 的去泛素化修饰提高 酶活性进而参与调控糖酵解途径促进肿瘤进展【参考文献】.():.武肖红余展晖牛晓辉等.深度挖掘肝细胞癌中遗传变异对可选择性多聚腺苷酸化的影响.华中科技大学学报(医学版)():.():.张丹眉石春霞龚作炯.肝细胞癌中表观遗传改变对免疫治疗的影响.中国肿瘤():.():.于世民.、及 在肝细胞癌微血管浸润诊断中的应用现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .价值.临床医学研究与实践():.():.():.:.():.牛艳芳柴芳玉庞文会等.通过泛素化稳定细胞骨架蛋白质促进下咽癌分化.中国生物化学与分子生物学报():.():.张军吴淑宁陈嘉丽等.靶向 对化疗药物诱导的乳腺癌细胞系凋亡的影响.中南医学科学杂志():.():.田密曾进聂伟等.通过抑制 炎性小体通路改善蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤.西部医学():.():.高颖颖李文冬温洁等.狼疮性肾炎患者血清 和 表达水平及其与自身免疫抗体和疾病活动的相关性分析.现代检验医学杂志():.():.:.:.:.():.王文忠周兰柱孙哲等.下调三结构域蛋白()阻断 信号通路抑制人鼻咽癌细胞的侵袭和迁移.细胞与分子免疫学杂志():.().():.丁宁赵建全李文俊等.蛋白与心衰患者的心肌重塑、病因以及预后关系的临床观察.内蒙古医学杂志():.():./.():.:.():.:.:.刘旭周强蒲高祥等.鼻咽癌组织中、的表达及临床意义.中国医药导报():.():.():.:./.():.():./.():.:.():.:.:.():.:.:.(编校:蔺玥)唐津天等 通过泛素化修饰 调控肝癌细胞糖酵解机制的研究